Tim 3對poly(I ∶C)介導的小鼠Kupffer細胞分泌細胞因子的影響

牛 堅，王 月，王人顥，劉 斌

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Tim 3對poly(I ∶C)介導的小鼠Kupffer細胞分泌細胞因子的影響

牛 堅，王 月，王人顥，劉 斌

目的 探討T細胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3(Tim 3)對poly(I ∶C)活化的小鼠肝Kupffer細胞調節作用并探討其相關機制。方法 將真核表達質粒pcDNA3.1-Tim 3轉染小鼠肝Kupffer細胞，以Realtime PCR和Western blot法驗證Tim 3在小鼠肝Kupffer細胞的表達。通過ELISA法檢測質粒pcDNA3.1-Tim 3，并使用Tim 3阻斷型抗體和核轉錄因子kappa B(NF-κB)抑制性配體對poly(I ∶C)活化的小鼠肝Kupffer細胞因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)]產生影響，Western blot法檢測NF-κB p65、IκBα蛋白表達。結果 Tim 3抑制小鼠肝Kupffer細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β，Western blot結果顯示其降低小鼠肝Kupffer細胞NF-κB p65蛋白和提高IκBα蛋白表達。結論 Tim 3通過NF-κB通路參與了poly(I:C)誘導小鼠肝Kupffer細胞活化的調節。

Tim 3；Kupffer細胞；小鼠

聚肌胞苷酸(poly I ∶C)是一種雙鏈RNA病毒模擬物，能與 Toll樣受體3(Toll-like receptor,TLR3)結合，后者主要表達在巨噬細胞和樹突狀細胞上。位于肝臟的巨噬細胞又稱Kupffer細胞，研究[1-2]表明，poly I ∶C能誘導肝Kupffer細胞的過度活化，產生很多種炎性因子。最近實驗顯示T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3( T cells immunoglobulin and mucin family-3,Tim 3)是炎癥反應的一種重要調節分子，提供抑制性信號，對Kupffer細胞活化有重要的調控作用[3]。該研究首先通過將表達Tim 3的質粒轉染入小鼠Kupffer細胞，檢測其產生炎性因子的變化，進一步研究產生這些改變的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗材料 6～8周齡 SPF級健康Balb/C小鼠，22～24 g，購自中國科學院上海實驗動物中心。真核表達載體pcDNA3.1-Tim 3由Sanchez-Fueyo A教授贈送。兔抗鼠Tim 3抗體以及同型對照抗體，核轉錄因子kappa B (nuclear factor of kappa B,NF-κB)p65單抗、NF-κB抑制蛋白α(NF-κB inhibitor alpha,IκBα)單抗購自美國Santa Cruze公司； LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；poly(I ∶C)、NF-κB抑制劑PDTC購自美國Sigma公司；小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA檢測試劑盒購自美國eBiosence 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Kupffer細胞分離、培養 參照文獻[4]方法對小鼠肝臟Kupffer細胞進行分離、純化。培養液RPMI 1640中含10%小牛血清，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.2 檢測poly(I ∶C)介導的小鼠肝臟Kupffer細胞Tim 3的表達 小鼠肝臟Kupffer細胞調整濃度至1×105/ml，接種于24孔培養板中，37 ℃、5% CO2培養過夜；加入終濃度為0、10、20、50 ng/ml poly(I ∶C)繼續培養24 h，收集細胞用于Realtime PCR法檢測Tim 3的表達。Tim 3上游引物：5′-TTGACCCTGGCACTTATC-3′，下游引物：5′-ATGGAGCATTTCAATGTAGCAT-3′；GAPDH上游引物：5′-ACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GATGCAGGGATGATGTTCT-3′。具體操作步驟見參考文獻[5]。同時Western blot檢測Tim 3蛋白的表達。

1.2.3 小鼠Kupffer細胞轉染質粒pcDNA3.1-Tim 3后Tim 3的表達 將小鼠Kupffer細胞懸液接種于24孔板上，接種密度為1×105個/孔，放入37 ℃、5% CO2培養。轉染前更換成不含血清的RPMI-1640，采用LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑，按使用說明書進行轉染實驗。轉染質粒后的細胞孵育6 h換成正常培養液24 h，收集細胞。Realtime PCR法檢測Tim 3在mRNA水平的變化，具體步驟如參考文獻[5]。Western blot法檢測Tim 3在蛋白水平的變化，一抗10 ml(1 ∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，二抗10 ml(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育2 h后具體步驟如參考文獻[5]。

1.2.4 Tim 3過表達對poly(I ∶C)活化小鼠Kupffer細胞炎性因子分泌的影響 將1.2.3轉染質粒pcDNA3.1-Tim 3的Kupffer細胞，調整濃度至5×104/ml，接種于96孔培養板中，每組3個復孔，37 ℃、5% CO2培養過夜；加入poly(I ∶C)至終濃度50 ng/ml，于24 h后收集培養上清液用于TNF-α、IL-6 、IL-1β檢測。具體步驟如參考文獻[5]。

1.2.5 Western blot法檢測Tim 3對小鼠的Kupffer細胞NF-κB P65蛋白表達的影響 收集1.2.3中的細胞裂解液，Western blot法檢測NF-κB P65蛋白水平的變化，操作過程如參考文獻[5]。一抗10 ml(1 ∶2 000)室溫孵育2 h，二抗10 ml(1 ∶4 000)室溫孵育2 h。

1.2.6 抑制NF-κB通路后對Tim 3抑制小鼠Kupffer細胞因子產生的影響 將小鼠Kupffer細胞加入吡咯烷二硫基甲酸鹽(PDTC)至終濃度30 μmol/L，預處理0.5 h，轉染質粒pcDNA3.1-Tim 3，接種于96孔培養板中；最后加入poly(I ∶C)至終濃度50 ng/ml，于24 h收集培養上清液，ELISA法檢測細胞因子TNF-α、IL-1β、IL -6 含量。檢測方法如參考文獻[5]。

1.2.7 抑制NF-κB通路對封閉Tim 3后小鼠Kupffer細胞因子產生的影響 將轉染 pcDNA3.1-Tim 3的Kupffer細胞，調整濃度至5×104/ml，接種于96孔培養板中；37 ℃、5% CO2培養過夜；棄去原有培養基，加入兔抗鼠Tim-3單克隆抗體或同型對照羊IgG 5 ng/ml的培養基，同時加入PDTC至終濃度30 μmol/L，培養24 h收集上清液用于TNF-α、IL-1β、IL-6檢測。檢測方法如參考文獻[5]。

1.2.8 細胞培養及分組 細胞用含10%的小牛血清RPMI 1640常規培養，實驗所用細胞均處于對數生長期，分成3組，包括正常對照組(僅加等量轉染試劑)、pcDNA3.1-Tim 3組和pcDNA3.1組，每組細胞設3個復孔。

2 結果

2.1 光鏡下Kupffer細胞形態觀察 分離出的Kupffer細胞隨著培養時間的延長，細胞形態結構會發生改變。剛分離的Kupffer細胞懸浮于培養液中，呈圓球形，具有很強的折光性，形態、大小較一致；培養0.5 h后細胞黏附培養板底部，部分細胞開始貼壁生長，培養6 h后，大多數細胞已貼壁生長，少數細胞開始伸展；24 h后，貼壁細胞已完全伸展，體積明顯增大，細胞形態呈典型星形、多邊形或梭形，見圖1。

圖1 原代培養小鼠Kupffer細胞 ×200

2.2 poly(I ∶C)介導的小鼠Tim 3的表達 Realtime PCR法檢測結果顯示10 ng/ml(F=20.23、P=0.019)、20 ng/ml(F=29.16、P=0.011)和50 ng/ml(F=36.37、P=0.002)的 poly(I:C)介導的小鼠Kupffer細胞的Tim 3 mRNA含量較0 ng/ml poly(I ∶C)組顯著增高(P<0.05)，見圖2。Western blot法檢測結果顯示10 ng/ml(F=20.16、P=0.018)、20 ng/ml(F=28.26、P=0.014)和50 ng/ml(F=36.87、P=0.002)的 poly(I ∶C)介導的小鼠Kupffer細胞的Tim 3蛋白表達較0 ng/ml poly(I ∶C)組顯著增高(P<0.05)，見圖3。

圖2 Tim 3 mRNA的相對表達水平

圖3 Tim 3蛋白的相對表達水平

2.3 轉染質粒pcDNA3.1-Tim 3小鼠Kupffer細胞Tim 3的表達 Realtime PCR和Western blot分別檢測正常對照組、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-Tim 3組的Tim 3 mRNA的相對表達量，與pcDNA3.1組、正常對照組比較，pcDNA3.1-Tim 3組的Tim 3 mRNA表達顯著增加，pcDNA3.1組mRNA表達量為其21%(F=46.17，P=0.012)，正常對照組mRNA表達量為其12%(F=66.35，P=0.002)，見圖4。pcDNA3.1-Tim 3組中Tim 3蛋白的表達明顯高于正常對照組，經灰度掃描分析，pcDNA3.1組蛋白表達量為其31%(F=39.24，P=0.019)，正常對照組蛋白表達量為其32%(F=36.35，P=0.019)。見圖5。

2.4 Tim 3過表達對poly(I ∶C)活化小鼠Kupffer細胞的炎性因子表達影響 ELISA結果顯示，轉染質粒pcDNA3.1-Tim 3的小鼠Kupffer細胞經poly(I ∶C)活化后炎性因子表達發生了變化，pcDNA3.1-Tim 3組 的TNF-α、IL-6、IL-1β分泌炎性因子較pcDNA3.1組(F=30.16、P=0.023)、正常對照組(F=33.36、P=0.021)明顯下降，這表明Tim 3能抑制Kupffer細胞的活化，見圖6。

圖4 Tim 3 mRNA的相對表達水平

圖5 Tim 3蛋白的相對表達水平(n=3)

A：pcDNA3.1-Tim 3組；B：pcDNA3.1組；C：正常對照組；與正常對照組比較：*P<0.05

圖6 Tim 3過表達對小鼠Kupffer細胞炎性因子表達的影響

2.5 Tim 3對小鼠Kupffer細胞的NF-κB P65、IκBα蛋白表達的影響 pcDNA3.1-Tim 3轉染小鼠Kupffer細胞后經poly(I ∶C)刺激，Western blot檢測顯示，pcDNA3.1-Tim 3組細胞的p65蛋白的表達從poly(I ∶C)刺激6 h后均低于pcDNA3.1組、正常對照組，見圖7；而IκBα的表達量與之相反，隨著時間的延長其表達量逐漸升高，從poly(I ∶C)刺激6 h后高于正常對照組細胞，見圖8。可見Tim 3抑制了NF-κB通路的活化。

圖7 Tim 3對Kupffer細胞NF-κB P65蛋白表達的影響

與正常對照組比較：*P<0.05

圖8 Tim 3對Kupffer細胞IκBα蛋白表達的影響

2.6 抑制NF-κB通路后對Tim 3上調小鼠Kupffer細胞炎性因子產生的影響 NF-κB抑制性配體PDTC預處理轉染質粒pcDNA3.1-Tim 3的小鼠Kupffer細胞30 min后，經poly(I ∶C) 刺激后，ELISA結果顯示PDTC預處理組TNF-α、IL-6、IL-1β分泌較正常對照組無明顯變化，見圖9，PDTC未處理組TNF-α、IL-6、IL-1β分泌減少，差異有統計學意義，見圖6。可見Tim 3通過NF-κB通路抑制炎性細胞因子分泌。

圖9 NF-κB通路對小鼠Kupffer細胞炎性因子表達的影響

2.7 阻斷NF-κB通路逆轉Tim 3阻斷型抗體對poly(I ∶C)介導的Kupffer細胞分泌細胞因子的促進作用 為了研究阻斷Tim 3是否通過NF-κB通路影響TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌， 利用PDTC預處理pcDNA3.1-Tim 3組30 min后，然后加入Tim 3阻斷型抗體處理，poly(I ∶C)刺激后，收集培養上清液，ELISA結果顯示，PDTC未處理組，Tim 3阻斷型抗體組與未加Tim 3阻斷型抗體組比較，TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌增加(P<0.05)，見圖10A；而PDTC預處理組，Tim 3阻斷型抗體組與未加Tim 3阻斷型抗體組比較，TNF-α、IL-6、IL-1β分泌差異無統計學意義，見圖10B。

3 討論

Kupffer細胞是指存在于肝臟血竇內皮間的巨噬細胞，活性程度很高，在細菌脂多糖等激活下，可以釋放多種細胞因子，從而激活多種炎性細胞，共同在肝臟的炎癥反應中發揮作用[6-7]。肝衰竭綜合征的臨床特點和結局取決于Kupffer細胞的比例、釋放炎性因子的種類[8]。因而，深入肝巨噬細胞的活化及調控機制對治療肝損失具有重要意義。

Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)蛋白代表了一類保守的受體家族，分別識別不同的抗原。其中TLR3能專一性地識別poly(I ∶C)，激活NF-κB通路，促發炎癥因子及輔助刺激分子的釋放，調節機體單核/巨噬細胞。TLR下游信號通路的關鍵節點就是NF-κB蛋白，在免疫反應中發揮重要作用，最突出的生物學功能是促進細胞因子合成和釋放。poly(I ∶C)通過細胞膜表面的TLR3激活炎性細胞，核內NF-κB通路被激活，合成大量炎性細胞因子并釋放到胞外，趨化粒細胞、巨噬細胞，同時使得毛細血管通透性增加，引起炎癥反應[9-10]。

圖10 阻斷NF-κB通路逆轉Tim 3阻斷型抗體對Kupffer細胞分泌炎性因子的促進作用

A：PDTC未預處理組；B：PDTC預處理組；與Tim 3阻斷型抗體預處理比較：*P<0.05

Tim 3屬于T細胞免疫球蛋白及黏蛋白(Tim)家族成員，是活化的Th1細胞表面的共刺激分子[11]。Tim 3 和配體Gal9結合構成Tim 3-Gal9 信號通路，引起T 細胞的凋亡，并能激活天然免疫細胞，從而在先天性免疫反應和獲得性免疫反應中發揮重要作用。Tim 3分子對Th1細胞起負性調節作用，參與了特異性免疫應答。近年來研究[12-14]顯示，Tim 3在巨噬細胞、DC、肥大細胞等天然免疫細胞表面有表達，在先天性免疫反應和獲得性免疫反應中發揮重要作用。

在Kupffer細胞中，Tim 3通路是否與poly(I ∶C)/ TLR3活化NF-κB蛋白的調節有關聯，本實驗結果顯示poly(I ∶C)能夠誘導小鼠肝Kupffer細胞中Tim 3 mRNA的表達，并且隨著poly(I ∶C)濃度的增加，Tim 3 mRNA明顯升高。

鑒于Tim 3基因在poly(I ∶C)活化的小鼠肝Kupffer細胞中的表達及與NF-κB通路間的有調控關系，本研究應用真核表達載體pcDNA3.1-Tim 3轉染小鼠肝臟Kupffer細胞，Realtime PCR及Western blot法檢測結果表明構建的pcDNA3.1-Tim 3質粒有效表達Tim 3 mRNA和蛋白。用pcDNA3.1-Tim 3調高小鼠肝臟Kupffer細胞Tim 3的表達后，從細胞水平來觀察相關細胞因子的變化，實驗結果提示TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著下降，表明Tim 3抑制小鼠肝臟Kupffer細胞炎性因子的分泌。Western blot檢測顯示，pcDNA3.1-Tim 3組細胞的NF-κB蛋白的表達明顯低于對照組細胞，可見Tim 3抑制了NF-κB通路的活化。

為了進一步探討過表達Tim 3通過NF-κB通路抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌，利用NF-κB抑制性配體預處理小鼠Kupffer細胞后轉染pcDNA3.1-Tim 3，經poly(I ∶C)活化，顯示NF-κB抑制性配體未處理組與處理組細胞比較，TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌明顯下調。

在上面研究的基礎上，為了明確阻斷Tim 3是否通過NF-κB通路影響TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌，利用NF-κB抑制性配體預處理小鼠Kupffer細胞，然后加入Tim 3阻斷型抗體處理，經poly(I ∶C)活化后，NF-κB抑制性配體未處理組，Tim 3阻斷型抗體(+)組與Tim 3阻斷型抗體(-)組比較，TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌增加；而NF-κB抑制性配體處理組，Tim 3阻斷型抗體(+)組與Tim 3阻斷型抗體(-)組比較，TNF-α、IL-6、IL-1β分泌差異無統計學意義，進一步說明了Tim 3通過NF-κB通路抑制小鼠Kupffer細胞的炎性因子的分泌。

在本研究中，成功實現了采用真核表達質粒pcDNA3.1-Tim 3轉染小鼠Kupffer細胞，并觀察到Tim 3通過NF-κB通路對poly(I ∶C)活化的小鼠Kupffer細胞的炎性因子分泌的抑制作用，本實驗結果為進一步深入闡明Kupffer細胞活化的調控機制提供了幫助，研究該分子靶標對臨床診斷肝損傷進程和治療有重要意義，有望為肝損傷的診斷和治療提供新思路。

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Tim 3 affecting mice liver Kupffer cells secretion by poly(I ∶C) activation

Niu Jian, Wang Yue, Wang Renhao, et al

(DeptofGeneralSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002)

ObjectiveToinvestigatetheadjustmentroleofTcellimmunoglobulinandmucinfamily-3(Tim3)inKupffercellsactivationandtherelatedmechanism.MethodsTransfectedthepcDNA3.1-Tim3plasmidintoKupffercells.Tim3expressioninKupffercellwasexaminedbyRealtimePCRandWesternblot.PlasmidpcDNA3.1-Tim3,Tim3blockingantibodiesandNF-κBinhibitoryligandsonmiceliverKupffercellactivationfactor(TNF-α,IL-1β,IL-6)weremonitoredbyELISAtest.NF-κBandIκBαproteinswereexaminedbyWesternblot.ResultsTim3couldinhibitKupffercellsexpressionofTNF-α,IL-6,IL-1β.TheresultsshowedthatitreducedtheexpressionofNF-κBp65proteinandincreasedIκBαproteininthemouseliverKupffercells.ConclusionTim3isinvolvedintheregulationofKupffercellsactivationthroughNF-kappaBandIκBαprotein.

Tcellimmuneglobulinandmucinfamily-3;Kupffercell;mice

天晴肝病研究基金(編號：CFHPC20132020)；江蘇省333高層次人才培養(編號：Ⅲ-2290)；徐州市推動科技創新專項資金項目(編號：KC14SX011)

徐州醫學院附屬醫院普外科，徐州 221002

牛 堅，男，副教授，副主任醫師，責任作者，E-mail:njnj_001@163.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.007.html

R 392

A

1000-1492(2016)11-1584-06

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.007

2016-06-15接收