ApoE基因敲除小鼠海馬CA3區神經元形態學和微管相關蛋白2表達變化

季 丹，黃大可，桂 麗，賈雪梅

?

ApoE基因敲除小鼠海馬CA3區神經元形態學和微管相關蛋白2表達變化

季 丹1,2，黃大可3，桂 麗3，賈雪梅1

目的 觀察載脂蛋白E基因敲除(ApoE KO)對小鼠海馬CA3區神經元形態結構改變以及微管相關蛋白2(MAP-2)表達的影響。方法 10只野生型C57BL/6J小鼠為對照組，10只ApoE基因敲除小鼠為KO組，普通飼料喂養3個月。采用分光光度計檢測血脂變化；取兩組小鼠腦組織，HE染色和電鏡技術觀察海馬CA3區結構改變，免疫組織化學技術觀察兩組小鼠海馬CA3區MAP-2表達變化, 采用計算機圖像分析系統檢測其平均光密度(MOD)值。結果 與對照組比較，KO組小鼠血漿總膽固醇、血漿三酰甘油、低密度脂蛋白含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)。光鏡下，KO組小鼠海馬CA3區錐體細胞較小，排列稀疏松散。電鏡下，KO組海馬神經元內線粒體腫脹變性，嵴消失；神經纖維髓鞘松懈；突觸小泡數量減少，突觸間隙模糊等。免疫組織化學結果顯示，對照組小鼠海馬神經元內MAP-2高表達， KO組含量明顯減少；圖像分析顯示KO組CA3區MAP-2 MOD值明顯降低(P<0.05)。結論 ApoE KO小鼠海馬神經元結構出現病理改變，MAP-2表達下降，提示ApoE KO與神經退行性病變有一定聯系。

載脂蛋白E基因敲除；微管相關蛋白2；超微結構；海馬CA3區；小鼠

載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是一種轉運血脂的血漿蛋白，參與調節機體脂質代謝和膽固醇平衡[1]。在神經系統中，ApoE參與膽固醇及磷脂的動員和再分布，可調節突觸可塑性和修復神經元損傷，是目前已知的唯一與神經系統密切關聯的載脂蛋白，也是第一個被確認的散發型和遲發家族型阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的重要易感基因[2]。近年來，膽固醇代謝異常、ApoE 對膽固醇代謝的調節等已越來越多地被證實與AD的發生和發展密不可分。本課題組前期研究[3]表明， ApoE基因敲除(ApoE gene knockout，ApoE KO)小鼠會引起海馬神經元中β淀粉樣蛋白(amyloid protein β，Aβ)的沉積，可能會引起AD等神經退行性疾病的認知功能障礙。研究[4]顯示，作為一種新型動物模型——ApoE基因敲除小鼠，已應用于認知障礙和記憶關系的研究。AD確切發病機制目前尚不明確，有研究者認為，細胞骨架的異常裝配和信號傳遞的障礙可引發AD等神經退行性疾病[5]。微管相關蛋白-2(microtubule-associated proteins-2，MAP-2)是構建細胞骨架的結構性微管相關蛋白家族，可促進微管形成、維持微管穩定、誘導微管成束，參與神經元發育、突起的形成和生長以及信息傳導等過程[6]。海馬CA3區是與記憶相關情報儲存的關鍵部位，該研究通過外購ApoE基因敲除小鼠，對海馬神經元CA3區進行超微結構及MAP-2表達觀察，旨在為進一步探討 ApoE異常引發AD等神經退行性疾病的可能機制提供形態學依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備 20只清潔級野生型C57BL/6J小鼠購自中國協和醫科大學，其中10只作為對照組，另10只為ApoE基因敲除小鼠作為KO組，單籠飼養12周，此期間各組動物均不限制飲食和飲水。普通飲食喂養3個月，禁食12 h后，將兩組小鼠水合氯醛麻醉下行下腔靜脈采血，離心后取血清，-20 ℃保存，待測血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平。取腦組織，用10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋，切片(厚4 μm，矢狀面切片)，待后續實驗。

1.2 主要試劑 兔抗鼠MAP-2單克隆抗體購自美國Sigma公司，SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。常用生化試劑：LDL試劑盒、TC試劑盒、TG試劑盒等均購自南京建成生物工程研究所，嚴格按照試劑盒說明書，采用分光光度計檢測。

1.3 HE染色 石蠟切片脫蠟至水，入蘇木精染色10 min，再進行鹽酸乙醇分色、藍化，入伊紅染色1 min，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察并攝片。

1.4 電鏡觀察 將兩組小鼠新鮮海馬組織預固定于4%戊二醛，1%鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，常規Epon-812 包埋、定位，60 nm超薄切片，醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色，置日產JEO L-1230透射電鏡下觀察并攝片。

1.5 免疫組織化學染色 采用免疫組織化學SP法染色，按照試劑盒說明書進行。3%過氧化氫溶液處理，微波中火抗原修復，山羊血清封閉，滴加兔抗鼠MAP-2抗體(稀釋度為1 ∶100)，37 ℃孵育30 min后，置4 ℃過夜；二抗為生物素化羊抗兔IgG血清，37 ℃孵育30 min；辣根酶標記鏈酶卵白素工作液37 ℃孵育30 min。DAB顯色，脫水、透明、封片。用PBS替代一抗作陰性對照。

1.6 計算機圖像分析 采用南京大學捷達公司801計算機病理圖象分析系統，應用日本Nikon Eclipse-800i顯微鏡，隨機選取20倍物鏡下6個視野，計算海馬CA3區神經元內MAP-2陽性染色平均光密度(mean optical density，MOD)值。

2 結果

2.1 血清血脂生化指標檢測結果 與對照組比較，KO組血清TC、TG、LDL水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 兩組小鼠血清脂質生化指標比較±s)

2.2 HE染色檢查結果 HE染色后在光鏡下顯示，海馬由CA1～CA4區域組成，可分為分子層、錐體細胞層和多形細胞層。對照組海馬CA3區錐體細胞層的神經元排列緊密，胞體呈錐體形，神經元的細胞核大而圓，著色淺。KO組小鼠海馬CA3區錐體細胞排列紊亂、松散，胞體較小，見圖1。

2.3 電鏡觀察結果 電鏡下顯示，對照組海馬CA3區錐體細胞胞質豐富，內含較多游離核糖體、線粒體成分； KO組海馬神經元內線粒體腫脹變性，嵴斷裂，粗面型內質網擴張，見圖2。對照組神經纖維髓鞘結構完整，密度均勻一致；KO組神經纖維髓鞘結構不完整、松懈，密度較對照組降低，見圖3。對照組突觸結構完整，突觸前成分中有大量突觸小泡，突觸間隙清晰，突觸后膜特化增厚；KO組神經末梢可見突觸結構小泡明顯減少，突觸間隙模糊，見圖4。

圖1 小鼠海馬CA3區神經元 HE×200

圖2 小鼠海馬CA3區神經元超微結構 電鏡×15 000

圖3 小鼠海馬CA3區神經纖維超微結構 電鏡×25 000

2.4 MAP-2免疫組化染色結果 本研究陽性染色結果為細胞質中出現明顯的黃色或棕黃色顆粒。在對照組中，MAP-2黃褐色陽性產物主要表達在海馬神經元胞質和樹突內，且陽性染色顯示的黃色顆粒樣物質表達較高，神經元突起較為光滑，呈連續而纖細的條索狀。KO組含量較少，MAP-2 免疫陽性產物在胞體和樹突中較對照組明顯減少，條索狀陽性產物連續性不完整。陰性對照結果呈陰性，見圖5。

圖4 小鼠海馬CA3區神經突觸超微結構 電鏡×50 000

圖5 小鼠海馬CA3區神經元MAP-2表達 SP法×400

2.5 計算機圖像分析海馬CA3區MAP-2表達 與對照組比較，KO組小鼠海馬CA3區神經元內MAP-2 MOD值明顯降低，差異有統計學意義(0.489±0.065vs0.339±0.029，t=2.659，P<0.05)。

3 討論

ApoE主要分布于乳糜微粒(chylomieron，CM)、LDL中，是機體LDL受體的配體，在脂蛋白代謝中作用顯著[1]。基因敲除ApoE的小鼠因清除脂質障礙，易在短期內形成高脂血癥[2]。本研究結果證實，與對照組比較，ApoE基因敲除3個月后，KO組小鼠血清中TC、TG、LDL水平顯著升高，說明KO組小鼠已存在嚴重脂蛋白代謝障礙，模型建立成功。血漿蛋白ApoE與血脂轉運相關，在神經損傷的再生、神經元軸突的延伸中起一定的作用[1]。本課題組前期研究[3]表明，ApoE可調控大腦中Aβ的沉積和降解，Aβ與機體的學習、記憶、信息存儲等功能關系密切，海馬區Aβ的沉積受累，是引起AD的重要原因。文獻[7-8]報道，ApoE基因敲除可致Aβ沉積，可能與AD認知功能障礙有關。MAP-2是正常腦組織的神經元胞質中含量最豐富的細胞骨架蛋白，具有調節微管穩定性作用，作為神經元突起的可塑性的調節蛋白發揮作用。研究[5]表明，細胞骨架的異常裝配和信號傳遞的障礙亦可引發AD等神經退行性疾病。

大腦海馬區興奮閾值低，海馬CA3區神經元數量多，功能重要，探討海馬CA3區錐體神經元的形態發育對闡明AD發病機制具有非常重要的意義[9]。本實驗形態學結果證實，KO組較對照組CA3區錐體細胞排列紊亂、松散。電鏡下，KO組海馬神經元內線粒體腫脹變性，嵴斷裂，粗面型內質網擴張；神經纖維髓鞘結構松懈，密度下降；突觸小泡數量顯著減少，突觸間隙模糊。電鏡結果提示，KO組小鼠學習記憶的海馬CA3區神經元、神經纖維、突觸均發生變化，這些可能是ApoE基因敲除小鼠產生學習記憶功能障礙的原因之一。MAP-2屬于熱穩定的磷蛋白，在神經元的胞體及樹突內分布廣泛，調節神經元的生長、軸突和樹突的形成以及突觸可塑性[5,9]。本研究中免疫組化結果顯示KO組小鼠海馬CA3區神經元中MAP-2的表達明顯下降。 分析其下降的可能機制有[8-10]：① ApoE基因敲除后，小鼠海馬CA3區結構改變，錐體細胞線粒體結構不可逆性損傷，致使細胞能量代謝障礙；② 錐體細胞粗面型內質網擴張，細胞蛋白質的合成能力削弱；③ ApoE 基因敲除后，引起第二信使系統、谷氨酸受體亞單位和蛋白激酶受損，使得MAP-2表達下降，神經纖維修復障礙，并進一步引發加重AD等神經退行性疾病的發生發展。在神經細胞發育過程中，MAP-2可以調節微管聚合和穩定性，對神經元突起的發生、延長和穩定發揮著重要作用，微管結構蛋白MAP-2的下降，減弱了神經纖維軸突和樹突的產生和突觸的重建；MAP-2表達下降，加重了微管的不穩定性，其聚合作用下降，影響細胞有絲分裂和細胞骨架的正常裝配，這些變化有可能導致AD病變的發生[10]。但是，MAP-2 表達在ApoE 基因敲除小鼠海馬CA3 區神經元的分子機制，以及其與神經元損傷恢復與行為能力的改變有何內在聯系，有無AD特征性的病理改變如神經纖維纏結等尚需進一步研究。

綜上所述，本實驗通過ApoE基因敲除小鼠，證實其存在脂蛋白代謝障礙。ApoE 基因敲除小鼠海馬CA3區神經元超微結構明顯變化，這種改變可能與MAP-2 表達下降有關。

[1] Tai L M, Ghura S, Koster K P, et al. APOE-modulated Aβ-induced neuro inflammation in Alzheimer's disease: current landscape, novel data, and future perspective[J].J Neurochem, 2015,133(4):465-88.

[2] Davies G, Harris S E, Reynolds C A, et al. A genome-wide association study implicates the APOE locus in nonpathological cognitive ageing[J].Mol Psychiatry,2014,19(1):76-87.

[3] 張 寧，倪 普，徐凌凡，等. ApoE基因敲除小鼠海馬神經元內β淀粉樣蛋白的表達變化[J].安徽醫科大學學報,2011,46(6):531-4.

[4] 劉 娟,賈雪梅. 高脂飲食對載脂蛋白E基因敲除小鼠海馬CA3區形態學及Mortalin蛋白表達的研究[D]. 安徽醫科大學,2011.

[5] Vemuri P, Wiste H J, Weigand S D, et al. Effect of apolipoprotein E on biomarkers of amyloid load and neuronal pathology in Alzheimer disease[J]. Ann Neurol, 2010,67(3): 308-16.

[6] Haley G E, Kohama S G, Urbanski H F, et al. Age-related decreases in SYN levels associated with increases in MAP-2, apoE, and GFAP levels in the rhesus macaque prefrontal cortex and hippocampus[J].Age(Dordr), 2010,32(3):283-96.

[7] Zhu H Q, Li Q, Dong L Y, et al. MicroRNA-29b promotes high-fat diet-stimulated endothelial permeability and apoptosis in apoE knock-out mice by down-regulating MT1 expression[J].Int J Cardiol, 2014,176(3):764-70.

[8] Verghese P B, Castellano J M, Garai K, et al. ApoE influences amyloid-β (Aβ) clearance despite minimal apoE/Aβ association in physiological conditions[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013, 110(19):E1807-16.

[9] Bien-Ly N, Gillespie A K, Walker D, et al. Reducing human apolipoprotein E levels attenuates age-dependent Aβ accumulation in mutant human amyloid precursor protein transgenic mice[J]. J Neurosci, 2012,32(14):4803-11.

[10]Haley G E, Eghlidi D H, Kohama S G, et al. Association of microtubule associated protein-2, synaptophysin, and apolipoprotein E mRNA and protein levels with cognition and anxiety levels in aged female rhesus macaques[J]. Behav Brain Res, 2012,232(1):1-6.

Neuronal morphology and microtubule associated protein 2 expression changes in ApoE knockout mice hippocampal CA3 area

Ji Dan1,2，Huang Dake3，Gui Li3，et al

(1DeptofHistologyandEmbryology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032；2CollegeofBasicMedicine,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230061；3ComprehensiveLaboratory,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

ObjectiveTo observe the effect of apolipoprotein E knockout (ApoE KO) on structural changes in neuronal morphology of hippocampal CA3 area of mice and microtubule-associated protein 2 (MAP-2) expression.Methods10 normally-fed C57BL/6J wild mice were chosen as the control group, and 10 gene knockout mice were selected as ApoE KO group fed with a common diet for 3 months. Blood lipid changes were detected by spectrophotometer testing. Brain tissues of the two groups of mice were taken out to observe structural changes in hippocampal CA3 area by HE staining and electron microscopy techniques. MAP-2 protein expression changes in hippocampal CA3 area were observed by immunohistochemical technique. Average optical density (MOD) expression changes were analyzed by computer image system.ResultsCompared with the control group, plasma total cholesterol, triglyceride and low density lipoprotein cholesterol levels of the KO group were significantly higher (P<0.05,P<0.01). Light microscope showed that hippocampal CA3 pyramidal cells of KO group mice were smaller, sparsely and loosely arranged. Under the electron microscope, hippocampal neurons mitochondria of KO group swelled and degenerated and ridge disappeared, myelin sheath of nerve fibers relaxed, the number of synaptic vesicles decreased and synaptic cleft obscured. Immunohistochemical results indicated that the MAP-2 in hippocampal neuron was higher in the control group, whereas that of KO group was remarkably diminishing; image analysis showed that MAP-2 OD value in CA3 area of KO group significantly decreased (P<0.05).ConclusionApoE KO may contribute to pathological changes of hippocampal neuron structure of mice and decrease MAP-2 expression, which signifies that ApoE KO is correlated with neurodegenerative disorders.

apolipoprotein E gene knockout; microtubule associated protein 2; ultra microstructure; hippocampal CA3 area; mice

安徽高校省級自然科學研究項目(編號：KJ2012A164)

1安徽醫科大學組織學與胚胎學教研室，合肥 2300322安徽醫學高等專科學校基礎部，合肥 2300613安徽醫科大學綜合實驗室，合肥 230032

季 丹，女，講師，碩士研究生； 賈雪梅，女，教授，碩士生導師，責任作者， E-mail：jiaxueme@126.com

時間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.010.html

R-332

A

1000-1492(2016)11-1600-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.010

2016-07-06接收