人參皂苷Rk3對肝癌HepG2細胞凋亡的影響

范 潔，張 磊，王 嘯

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人參皂苷Rk3對肝癌HepG2細胞凋亡的影響

范 潔1,2,3，張 磊1,2，王 嘯4

目的 研究人參皂苷Rk3對肝癌HepG2細胞凋亡影響。方法 體內實驗采用HepG2細胞裸鼠腋部皮下接種，制備荷瘤鼠肝癌模型，分為生理鹽水組、人參皂苷Rk3 (25、50、100 mg/kg)組和5-氟尿嘧啶(5-Fu，20 mg/kg)組；體外實驗分為正常組、人參皂苷Rk3 (20、40、80 μmol/L)組和5-Fu(50 μg/ml)組；MTT法檢測HepG2細胞增殖；流式細胞術檢測HepG2細胞凋亡；RT-PCR法檢測HepG2細胞中Bax、Bcl-2，cleaved-Caspase-3、DR4和DR5 mRNA表達；Western blot法檢測HepG2細胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5蛋白表達。結果 人參皂苷Rk3(100 mg/kg)夠明顯抑制瘤體重量(P<0.05)；人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L )能明顯抑制HepG2細胞增殖，誘導HepG2細胞凋亡；人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L)能顯著增加Bax、cleved-Caspase-3、DR4和DR5蛋白和mRNA的表達，降低Bcl-2蛋白和mRNA的表達(P<0.05)。結論 人參皂苷Rk3可能通過DR4、DR5誘導HepG2細胞凋亡。

人參皂苷Rk3；HepG2；凋亡

肝癌的發生發展經歷了肝炎-肝硬化-肝癌三個病變過程，是一個多步驟、多階段的病理學過程[1-2]。肝癌因其惡性程度高、進展迅速以及治療復雜造成的療效預后差[3]一直是臨床研究的熱點。目前治療肝癌最有效的方法是手術切除或肝移植，但是多數患者并不具備手術指征和條件，術后發病率高也導致治療困難。研究[4-5]表明，通過誘導肝癌細胞的凋亡能夠有效控制腫瘤，因此，誘導肝癌細胞凋亡是抗肝癌藥物研究的重要思路之一。人參皂苷Rk3是人參在蒸制成紅參過程中生成的一種重要的稀有人參皂苷，研究[6]表明，紅參提取物能明顯抑制DMBA誘導的腫瘤細胞增殖，延長荷瘤小鼠的存活時間。近年來，關于人參皂苷抗腫瘤活性的研究取得了重大進展，體內外抗腫瘤研究[7-10]表明，具有腫瘤細胞毒性作用的人參皂苷多為一些稀有皂苷，研究較多的是稀有人參皂苷Rg3、Rh2、Rh1以及苷元原人參二醇和原人參三醇，在促進腫瘤細胞凋亡、促使腫瘤細胞分化、提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性以及提高機體抗腫瘤免疫力方面均有顯著作用。然而，稀有人參皂苷Rk3的抗腫瘤藥理活性尚未見報道。該研究通過體內體外實驗探討人參皂苷Rk3對肝癌的作用。體內采用裸鼠建立肝癌模型，觀察人參皂苷Rk3對腫瘤大小的影響；體外觀察其對HepG2細胞株凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和動物 人肝癌細胞株(HepG2)購自中國科學院上海細胞庫；清潔級Balb/c裸鼠，16～20 g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 試劑 人參皂苷Rk3購自大連美侖生物技術有限公司，有效成分≥98%；5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil, 5-Fu)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，有效成分=99%；胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司；TRIzol購自美國Sigma公司；Reverse Transcription System逆轉錄試劑盒購自日本Ferments公司；小鼠抗β-actin抗體購自美國 Santa Cruze公司；Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5抗體購自武漢博士德公司；Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4、DR5引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 MK3型酶標儀(荷蘭雷勃公司)；SW-CJ-IF型超凈工作臺(江蘇蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)；PCR擴增儀(德國Eppedorf公司)；Bio-rad電泳儀(美國伯樂公司)；COULTZER EPICS XL-MCL流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細胞的培養 采用含10%胎牛血清的DMEM培養液，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養，待細胞生長至70%～80%密度時進行傳代。

1.2.2 HepG2荷瘤鼠肝癌模型的建立 取對數期細胞1×107～5×107/ml 200 μl接種于裸鼠右腋部皮下。第4周給予人參皂苷Rk3(25、50、100 mg/kg)和5-Fu(20 mg/kg)灌胃，生理鹽水組給予等體積的生理鹽水，連續灌胃4周；8周后處死裸鼠取出瘤體，測量瘤體重量。

1.2.3 細胞增殖試驗 取對數生長期的HepG2細胞制成單細胞懸液，以1×108/ml的細胞密度接種于96孔板，每孔約100 μl，37 ℃過夜。待細胞完全貼壁后加入人參皂苷Rk3(0、5、10、20、40、80 μmol/L)，分別作用6、12、24、48 h后，棄去培養基，換無血清培養液，然后每孔加MTT(5 mg/ml) 20 μl，37 ℃繼續孵育4 h后，棄上清液并每孔加150 μl DMSO溶解細胞內結晶，室溫振蕩溶解10 min后，于492 nm波長處測吸光度(absorbance，A)值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 取不同濃度的人參皂苷處理后的HepG2細胞制成細胞懸液后；1 200 r/min離心5 min，收集細胞，棄培養基，用PBS洗滌2次；用400 μl Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μl Annexin V染液，輕輕混勻后于2～8 ℃避光孵育15 min；加入10 μl PI后輕輕混勻，于2～8 ℃避光條件下孵育5 min；上流式細胞儀檢測細胞凋亡，實驗重復3次。

1.2.5 Western blot法檢測Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5的蛋白表達 取對數生長期HepG2細胞，加入400 μl含PMSF的RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min后；4 ℃、12 000 r/min離心30 min；取上清液加入SDS上樣緩沖液，99.9 ℃變性10 min。樣品經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉移至PVDF膜上，室溫5%脫脂牛奶孵育3 h后；一抗孵育過夜后，二抗孵育1 h，ECL發光試劑盒顯影。

1.2.6 RT-PCR法檢測Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5的mRNA表達 使用TRIzol法提取HepG2細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA。PCR擴增反應條件為94 ℃變性40 s，51～58 ℃ 復性40 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環。引物序列見表1。PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠圖像分析系統檢測光密度。

2 結果

2.1 人參皂苷Rk3對HepG2荷瘤鼠瘤體重量的影響 與生理鹽水組比較，人參皂苷Rk3(100 mg/kg)能夠明顯降低腫瘤的重量(F=56.6,P<0.05)。 見表2。

表1 引物序列

表2 人參皂苷Rk3對HepG2荷瘤鼠瘤體重量的影響

2.2 人參皂苷Rk3對HepG2細胞增殖的影響 與未加人參皂苷Rk3比較，人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L)在24、48、72 h能夠明顯抑制HepG2細胞增殖(F=38.4、48.5、69.7，P<0.05)。人參皂苷Rk3隨著藥物作用時間延長和濃度增加抑制HepG2細胞增殖作用增強。見圖1。

2.3 人參皂苷Rk3對HepG2細胞凋亡的影響 Annexin V和PI雙標經流式細胞儀檢測顯示，與正常組(3±0.32)%比較，人參皂苷Rk3 20 μmol/L組(13±1.31)%、40 μmol/L組(17±1.92)%和80 μmol/L組(25±2.92)%能夠明顯誘導HepG2細胞凋亡，差異有統計學意義(P<0.01)。 見圖2。

圖1 人參皂苷Rk3對HepG2細胞增殖的影響

圖2 人參皂苷Rk3對HepG2細胞凋亡的影響

2.4 人參皂苷Rk3對HepG2細胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5 mRNA和蛋白表達的影響 RT-PCR和Western blot結果見圖3、4，給予不同濃度的人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L)后，Bax、cleved-Caspase-3、DR4和DR5 mRNA和蛋白明顯增加(P<0.05)；Bcl-2的mRNA和蛋白顯著減少，差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

人參皂苷 Rk3是從人參炮制品紅參藥材中分離提純的一種單體，為四環三萜類人參二醇型皂苷。

圖3 人參皂苷Rk3對HepG2細胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5 mRNA表達的影響

M：Marker；A～D:人參皂苷Rk3 0、20、40、80 μmol/L; E: 5-Fu 50 μg/ml；與人參皂苷Rk3 0 μmol/L比較：**P<0.01

Quan et al[11]通過體外實驗證明，稀有人參皂苷Rk3對胰腺癌、白血病、結腸癌等細胞株的增殖有明顯抑制作用。

本研究顯示，人參皂苷Rk3能夠顯著抑制HepG2荷瘤鼠肝癌模型中腫瘤的重量。同時， MTT結果顯示人參皂苷Rk3 (20、40、80 μmol/L)在24、48、72 h能夠明顯抑制HepG2細胞增殖，并隨著藥物作用時間延長和濃度增加抑制HepG2細胞增殖作用增強。為了觀察人參皂苷Rk3對HepG2凋亡的影響，本研究使用Annexin V和PI雙標經流式細胞儀檢測，結果顯示人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L)能夠增加HepG2細胞凋亡，同時cleaved-Caspase-3的mRNA和蛋白表達顯著升高。

死亡受體分子DR4和DR5與TRAIL結合后，通過招募Caspase-8傳遞死亡信號，能夠誘導腫瘤細胞凋亡[12]。本研究顯示給予人參皂苷Rk3后，DR4和DR5的表達明顯增加，提示人參皂苷Rk3能夠誘導HepG2的凋亡可能與DR4和DR5有關。Bcl-2是一種原癌基因，能夠增強細胞對大多數DNA損傷因子的抵抗性，抑制細胞的凋亡，而其同源的Bax能夠促進細胞凋亡[13]。Bax的過表達可拮抗Bcl-2的保護效應而使細胞凋亡。本研究結果表明人參皂苷Rk3能夠降低Bcl-2的mRNA和蛋白表達，增加Bax的表達。上述結果提示，人參皂苷Rk3誘導HepG2細胞的凋亡可能是通過上調DR4、DR5及調控凋亡相關蛋白的表達。

圖4 人參皂苷Rk3對HepG2細胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5 蛋白表達的影響

A～D:人參皂苷Rk3 0、20、40、80 μmol/L; E: 5-Fu 50 μg/ml; 與人參皂苷Rk3 0 μmol/L比較：*P<0.05，**P<0.01

綜上所述，本研究結果證實人參皂苷Rk3對荷瘤鼠肝癌有一定的抑制作用，并可能通過影響DR4、DR5和凋亡相關蛋白的表達誘導HepG2細胞的凋亡，但具體機制尚需進一步研究。

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Effect of ginsenoside Rk3 on apoptosis of HepG2

Fan Jie1,2,3, Zhang Lei1,2, Wang Xiao4

(1SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032;2AnhuiProvincialKeyLaboratoryofNatureMedicines,Hefei230032;3PharmaceuticalPreparationSection,TonglingPeople’sHospital,Tongling244000;4DeptofRadiology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

ObjectiveTostudytheeffectofginsenosideRk3onapoptosisofHepG2.MethodsTumorbearingmice model of liver cancer was prepared inoculating HepG2 cells in axilla of nude mice subcutaneously. The nude mice were grouped into saline group, ginsenoside Rk3 (25, 50 ,100 mg/kg) group and 5-Fu (20 mg/kg) groupinvivo. And the HepG2 cells were divided into normal group, ginsenoside Rk3(20, 40, 80 μmol/L) group and 5-Fu(50 μg/ml) groupinvitro. The inhibition rate of HepG2 cells was evaluated by MTT assay. The apoptosis distribution of HepG2 cells was detected by flow cytomtric analysis. The mRNA expressions of Bax, Bcl-2, cleaved- Caspase-3, DR4 and DR5 in HepG2 cells were detected by RT-PCR. The protein expressions of Bax, Bcl-2 cleaved-Caspase-3, DR4 and protein in HepG2 cells were observed by Western blot.ResultsGinsenoside Rk3(100 mg/kg) significantly inhibited tumor weight(P<0.05). Ginsenoside Rk3(20, 40 and 80 μmol/L) significantly inhibited the proliferation and induced apoptosis in HepG2 cells. Ginsenoside Rk3(20, 40 and 80 μmol/L) significantly increased Bax, cleaved-Caspase-3 DR4 expression and DR5 mRNA and protein, reduced the expression of Bcl-2 mRNA and protein. The difference was statistically significant.ConclusionGinsenoside Rk3 can induce apoptosis of HepG2 cells possibly through the DR4 and DR5.

ginsenoside Rk3; HepG2; apoptosis

國家自然科學基金青年科學基金項目(編號：81100302)；安徽高校省級自然科學研究重點項目(編號：KJ2014A124)

1安徽醫科大學藥學院，合肥 2300322安徽省天然藥物活性成分研究重點實驗室，合肥 2300323銅陵市人民醫院藥劑科，銅陵 2440004安徽醫科大學第一附屬醫院放射科，合肥 230022

范 潔，女，主管藥師，碩士研究生； 張 磊，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：zhangl@ahmu.edu.cn； 王 嘯，男，博士，副主任醫師，責任作者，E-mail：hfwangxiao@aliyun.com

時間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.011.html

R -332; R 735.7

A

1000-1492(2016)11-1604-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.011

2016-06-10接收