同型半胱氨酸對實驗性結腸炎大鼠血栓調節蛋白和內皮細胞蛋白C受體表達的影響

陳 義，丁少楨，梅 俏，劉曉昌，胡 靜，韓 瑋，許建明

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同型半胱氨酸對實驗性結腸炎大鼠血栓調節蛋白和內皮細胞蛋白C受體表達的影響

陳 義，丁少楨，梅 俏，劉曉昌，胡 靜，韓 瑋，許建明

目的 探討同型半胱氨酸(Hcy)對實驗性結腸炎大鼠結腸黏膜中可溶性血栓調節蛋白(sTM)、蛋白C(PC)、游離蛋白S(fPS)水平及血栓調節蛋白(TM)、內皮細胞蛋白C受體(EPCR)mRNA表達的影響。方法 SD大鼠分為正常組:組1[生理鹽水(NS)皮下注射+NS灌腸]、組2(Hcy皮下注射+NS灌腸)；TNBS模型組：組1(NS皮下注射+TNBS灌腸)、組2(Hcy皮下注射+TNBS灌腸)。實驗結束時采用ELISA法檢測大鼠結腸黏膜中sTM、fPS、PC水平，采用RT-qPCR法檢測大鼠結腸黏膜中TM、EPCR mRNA的表達水平。結果 與TNBS模型組1相比，TNBS模型組2大鼠血漿及結腸Hcy水平均顯著增高，大鼠結腸黏膜中sTM、PC和fPS水平降低(P<0.05)，大鼠結腸黏膜中TM、EPCR mRNA表達水平降低(P<0.05)。結論 Hcy可以加重大鼠結腸炎癥損傷，其機制可能是影響PC的抗炎與抗凝功能，引起腸道微循環血栓前狀態。

同型半胱氨酸；可溶性血栓調節蛋白；蛋白C；游離蛋白S；內皮細胞蛋白C受體

在炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的病理生理過程中，腸道炎癥合成的炎癥介質加重炎癥損傷，同時刺激內皮細胞激活機體凝血系統，形成血栓前狀態，內皮細胞在炎癥與血栓前狀態之間具有重要作用。在生理條件下，由血栓調節蛋白(thrombomodulin，TM)、內皮細胞蛋白C受體(endothelial protein C receptor，EPCR)、蛋白C( protein C，PC)和蛋白S(protein S, PS)等組成的PC系統是機體調控凝血機制的重要途徑。TM是表達于血管內皮細胞表面的一種糖蛋白，TM與凝血酶結合，在PS和EPCR的作用下激活PC轉化為具有抗凝和抗炎作用的活性蛋白C(activiated protein C，aPC)[1]。因此，PC途徑在IBD 的發病機制中發揮抗凝和抗炎的重要作用。同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一種含硫氨基酸，是體內蛋氨酸代謝的重要中間產物。IBD患者血栓性疾病發生率較高，可能與IBD患者血漿和結腸黏膜組織中Hcy含量增高有關[2]。研究[3-5]表明，Hcy可以損傷血管內皮細胞，引起血管平滑肌細胞增生和血小板凝集等作用，同時Hcy參與血管內皮細胞炎癥，上調血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)和單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)的表達，促進p38磷酸化[6]。Hcy作為促凝血因子，通過抑制TM和EPCR的表達，降低PC抗凝和抗炎作用，在心腦血管系統疾病的血栓形成過程中具有重要影響。由于IBD患者腸道黏膜中Hcy水平較高，并且微血栓形成在IBD病理進程中具有重要作用[7]，Hcy是否通過影響腸道黏膜組織中微血栓形成過程中的相關因素如可溶性血栓調節蛋白(soluble thrombomodulin，sTM)、PC、游離蛋白S(free protein S，fPS)及EPCR的表達，加重結腸炎癥過程目前尚不明確，因此，該研究擬在建立大鼠三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS)/乙醇結腸炎模型的基礎上，探討Hcy對實驗性結腸炎大鼠結腸黏膜中sTM、PC、fPS水平和EPCR表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥品 SD大鼠，SPF級，雄性，(200±20) g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，在室溫、光照周期12 h:12 h條件下適應性飼養1周后使用。TNBS(貨號：031M5021)、DL-同型半胱氨酸(貨號：121M39044)均購自美國Sigma公司。

1.2 實驗分組 大鼠分為4組，每組8只。正常組：組1[生理鹽水(NS)皮下注射+NS灌腸]、組2(Hcy皮下注射+NS灌腸)；TNBS模型組：組1(NS皮下注射+TNBS灌腸)、組2(Hcy皮下注射+TNBS灌腸)。各組給藥劑量見下文。

1.3 模型制備和給藥方法 參照文獻[8]方法，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，用橡膠管經肛門插入大鼠結腸內約8 cm，注入以等體積乙醇溶解的TNBS(100 mg/kg)溶液。正常組灌腸等體積NS。DL-Hcy溶于NS，滴定pH至7.4，參照文獻[9]劑量自TNBS模型制備后第1天起皮下注射Hcy(0.03 μmol/g)，每天2次，間隔8 h，連續30 d。正常組1及TNBS模型組1皮下注射等體積NS。

1.4 標本采集 大鼠經10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血后以3 000 r/min離心10 min，取上清液保存于-80 ℃。分別切取遠端結腸，沿縱軸剪開腸管，冰生理鹽水沖洗干凈后取部分結腸進行檢測。

1.5 樣品檢測 ELISA法檢測大鼠結腸黏膜中sTM、PC、fPS水平。實時熒光擴增檢測(Real-Time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法檢測大鼠結腸黏膜組織TM和EPCR mRNA表達：提取結腸黏膜組織mRNA、去除基因組DNA、合成cDNA后，按試劑盒說明書進行加樣：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s退火，72 ℃延伸，40個循環。分析方法為：相對定量試驗，分析指標為2-ΔΔCt。TM引物序列F：5′-TGCAAAGGATGTGGTTGTCT-3′，R：5′-ACGACCCATAGGACACTTCC-3′，產物長度122 bp；EPCR引物序列F：5′-GGACACCTGTGTGCAGTACC-3′，R：5′-TGAAACAGCCCATCAGGATA-3′，產物長度113 bp。

2 結果

2.1 各組大鼠血漿和結腸黏膜組織中Hcy水平的變化 與正常組1比較，TNBS模型組1的大鼠血漿(3.59±0.49vs11.40±0.94)和結腸組織Hcy(1.22±0.10vs1.69±0.20)的水平明顯增高(P<0.01)。與正常組2比較，TNBS模型組2大鼠血漿(20.73±0.94vs2.26±0.16)及結腸組織Hcy水平(23.44±1.40vs3.06±0.30)顯著增加(P<0.01)。各組血漿Hcy水平比較差異有統計學意義(F=432.915,P<0.01)；各組結腸Hcy水平比較差異有統計學意義(F=69.819,P<0.01)。

2.2 Hcy對結腸炎大鼠結腸黏膜中sTM、fPS和PC水平的影響 與正常組1相比，TNBS模型組1大鼠結腸黏膜sTM、PC水平明顯降低，fPS水平亦降低，但差異無統計學意義，與TNBS模型組1相比，TNBS模型組2大鼠結腸黏膜sTM、PC、fPS水平顯著下降(P<0.05)。各組間sTM水平差異有統計學意義(F=5.633,P<0.01)；各組間PC水平差異有統計學意義(F=6.97,P<0.01)；各組之間fPS水平差異有統計學意義(F=10.542,P<0.01)。見表1。

2.3 Hcy對結腸炎大鼠結腸黏膜中TM和EPCR mRNA表達的影響 經單因素方差分析，各組結腸黏膜中TM和EPCR mRNA表達的差異有統計學意義(F=11.112，9.798，P<0.05)。見圖1、2。

3 討論

正常血管內皮細胞表面表達TM，與凝血酶結合激活PC系統，形成aPC發揮抗凝和抗炎功能，PS可增強PC的抗凝功能。aPC具有抑制核轉錄因子kappaB(NF-κB)活性，降低血管內皮細胞凋亡和穩定血管內皮細胞屏障作用，抑制炎細胞對血管內皮細胞的黏附等[10]。降低TM表達可引起低水平aPC，促進腸道局部炎癥和凝血紊亂狀態。炎癥條件加重時，PS和PC水平降低，凝血級聯反應增強，炎性介質可引起血管內皮細胞合成和釋放纖溶酶原激活抑制物，促進血栓形成。

表1 Hcy對實驗性結腸炎大鼠結腸黏膜sTM、PC、fPS水平的影響

與正常組1比較：**P<0.01；與TNBS模型組1比較：#P<0.05，###P<0.01

圖1 Hcy對實驗性結腸炎大鼠結腸黏膜中TM mRNA表達的影響

A：正常組1；B：正常組2；C：TNBS模型組1；D：TNBS模型組2；與正常組1比較：*P<0.05；與TNBS模型組1比較：#P<0.05

圖2 Hcy對實驗性結腸炎大鼠結腸黏膜中EPCR mRNA表達的影響

A：正常組1；B：正常組2；C：TNBS模型組1；D：TNBS模型2；與正常組1比較：*P<0.05；與TNBS模型組1比較：#P<0.05

IBD具有局部微循環高凝和血栓前狀態的特征，腸道炎癥和凝血機制存在相互聯系。腸道炎癥通過合成促凝物質，抑制抗凝物質等機制加重微循環高凝狀態，腸道炎癥加重時可出現凝血物質水平改變，如包括凝血因子V、VIII以及vWF因子水平增加，抗凝物質(包括PC、PS以及抗凝血酶)水平降低以及纖溶系統紊亂。同時，凝血酶通過促進MCP-1合成以及IL-6、IL-8等炎癥介質形成[2]。IBD中腸道炎癥與凝血功能是互相影響的生理和病理過程，通過PC系統調控腸道黏膜微血管炎癥過程。研究[11]顯示，IBD患者腸道微血管TM及EPCR等表達降低，經TNF-α及IL-1β處理人腸微血管內皮細胞(HIMEC)，發現HIMEC中TM和EPCR表達水平下降[12]。aPC可通過抑制TNF-α上調細胞黏附分子(CAM)表達發揮抗炎作用。因此，PC系統對IBD腸道局部高凝狀態和炎癥具有重要的調節作用。

研究[13]表明，Hcy處理血管內皮細胞可引起VCAM-1和MCP-1表達增加以及p38磷酸化，使血管內皮細胞與炎細胞更易黏附。同時，Hcy可以改變血管屏障功能，引起組織因子(TF)表達增加，降低TM、組織型纖溶酶元復合物(tPA)及aPC表達發揮促凝作用。Hcy可以抑制人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中TM表達，降低aPC水平。有高Hcy血癥的動物表現出TM活性降低，Hcy同時影響TM活化，促進血栓形成[14]。

本研究顯示，與TNBS模型組1比較，TNBS模型組2大鼠結腸黏膜中sTM、fPS、PC水平降低，大鼠結腸黏膜中TM與EPCR mRNA表達降低，初步提示Hcy可能通過影響PC途徑，引起腸道局部抗炎和抗凝功能紊亂，加重結腸炎大鼠腸道微循環高凝狀態和炎癥損傷，但Hcy如何調控腸道中PC途徑的具體機制有待進一步研究，因此，降低IBD中腸道黏膜Hcy水平有助于改善腸道PC系統功能，可能成為調控腸道炎癥的新靶點。

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Effects of homocysteine on the expression of TM and EPCR in rats colitis

Chen Yi, Ding Shaozhen, Mei Qiao, et al

(DeptofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,TheKeyLaboratoryofDigestiveDiseasesofAnhuiProvince,Hefei230022)

ObjectiveToinvestigatetheeffectsofhomocysteine(Hcy)onlevelofsolublethrombomodulin(sTM),proteinC(PC),freeproteinS(fPS)andmRNAexpressionsofthrombomodulin(TM)andendothelialproteinCreceptor(EPCR)inratswithexperimentalcolitis.MethodsSDratsweredividedinto4groups:normalgroup,normal+Hcygroup,TNBS/ethanolgroup,TNBS/ethanol+Hcygroup.ExperimentalcolitismodelwithhyperhomocystinemiawasestablishedinratswithintracolonicadministrationofTNBSandsubcutaneousinjectionofHcy.ThemRNAexpressionofTMandEPCRwasdetectedbyRT-qPCRmethod.ThelevelsofsTM,PCandfPSincolonmucosatissuesofratsweremeasuredbyELISAmethod.ResultsComparedwiththenormalgroup,thelevelsofHcyinplasmaandcolonmucosawereincreasedremarkablyinTNBS-inducedcolitisratswithHcyinjectionsimultaneously.Furthermore,thelevelsofsTM，PC，andfPSincolonmucosaweredecreasedsignificantly.RT-qPCRmethodshowedsignificantdecreaseinmRNAexpressionsofTMandEPCRincolonmucosatissuesinTNBS/ethanol+Hcygroup.ConclusionHcycouldpromotepathologicaldamageinTNBS-inducedcolitisrats,whichmayberelatedtoitseffectsontheanti-inflammatoryandanticoagulationofPCsystem,resultinginprothrombosisconditionincolonicmucosalmicrocirculation.

homocysteine;solublethrombomodulin;proteinC;proteinS;endothelialproteinCreceptor

國家自然科學基金(編號:81470809);安徽省自然科學基金(編號:1308085MH146)

安徽醫科大學第一附屬醫院消化內科，合肥 230022

陳 義，男，主治醫師，碩士研究生； 梅 俏，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：meiqiao@hotmail.com

時間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.015.html

R 322；R 322.45；R 341.7；R 364.5；R 574.62；R 977.4

A

1000-1492(2016)11-1621-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.015

2016-06-27接收