羊糞低溫沼氣發酵細菌群落多樣性分析

代金平，陳競，古麗·艾合買提，買爾哈巴，楊新平，馮蕾

(新疆農科院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091)

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羊糞低溫沼氣發酵細菌群落多樣性分析

代金平，陳競，古麗·艾合買提，買爾哈巴，楊新平，馮蕾

(新疆農科院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091)

【目的】研究不同處理羊糞低溫沼氣發酵液的細菌群落多樣性，為羊糞低溫沼氣發酵菌劑制備提供理論依據。【方法】對不同處理羊糞沼液總DNA進行16S rDNA V3區PCR擴增，擴增產物進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分離、回收、測序，BLAST軟件比對分析，構建發育樹；同時利用Biolog-ECO法對沼液樣本進行微生物功能多樣性分析。【結果】PCR-DGGE方法結果顯示，在低溫條件下(15℃)，在發酵各階段均存在共有優勢菌群，包括梭菌屬 (Clostridiumsp.)、擬桿菌屬(Bacteroidalesbacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、Proteiniphilumsp.等，其中菌劑III處理的4號為最優發酵試驗組，主要為梭菌屬(Clostridiumsp.)表現有較高的豐度；Biolog-ECO法分析結果顯示，在15℃培養條件下，產氣高峰期處理2、3和4中，碳代謝活性相對較高，產氣量也比對照組高。通過微生物群落的多樣性分析發現，處理2的均勻性指數均高于其它處理組。處理3和4的微生物群落的豐富度、優勢度指數相對較高?！窘Y論】在低溫條件下(15℃)的不同處理中，添加配伍III(配伍I+2 g ZHC固體菌劑)發酵效果最優。

羊糞；沼氣；細菌；低溫；PCR-DGGE；16S rDNA；多樣性

0 引 言

【研究意義】沼氣發酵過程是一個極其復雜的過程。包括水解階段、產酸階段和產甲烷階段。在不同階段中微生物菌群結構也不同。變性梯度凝膠電泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)是根據DNA的接連特性、DNA雙螺旋結構的不同堿基的組成發生變性所需要的變性劑濃度不同，在變性梯度凝膠電泳時，隨著濃度的不斷增加，電泳的遷移率也不同，從而分離不同DNA分子。Biolog板培養方法中，可由顏色平均變化率來反應單一碳源代謝活性。平均顏色變化率( AWCD)是判斷土壤微生物群落利用碳源能力的重要指標之一，代表微生物的代謝活性?！厩叭搜芯窟M展】對沼氣池中細菌群落的研究表明，微生物群落在沼氣池的不同層次上呈現出空間分布多樣性的差異，經過富集培養后，微生物群落的多樣性及特異性會發生很大的差別[1-3]?！颈狙芯壳腥朦c】利用PCR-DGGE技術對不同發酵階段羊糞沼液細菌優勢菌群多樣性變化規律進行分析，利用 Biolog-ECO法對發酵高峰期的細菌群落功能多樣性進行分析?！緮M解決的關鍵問題】研究低溫條件下，分析羊糞沼氣發酵細菌優勢菌群多樣性變化規律及功能，為羊糞低溫沼氣發酵促進劑的制備提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 材料的準備與取樣

稱取自然晾干，粉碎后的羊糞220 g分別裝于2 L模擬發酵瓶中，再分別加入自篩促進菌劑配伍，其中ZHC菌為實驗室自篩菌株巴氏醋桿菌(Acetobacterpastcurianum)[4](配伍I添加Fe3+∶Ni2+0.1∶0.02 mg/L·d))；配伍II(配伍I+2 g 固體醬渣)；配伍III(配伍I+2 g ZHC固體菌劑))，最后加水至1 500 g，混勻，連接集氣裝置，制備模擬沼氣發酵罐，處理1、2、3、4置于15 ℃恒溫培養，處理5置于30 ℃恒溫培養。分別在發酵第0、30、60、180 d取發酵沼液樣品進行分析。表1

表1 不同樣品處理
Table 1 Different sample processing table

編號No.處理(℃)processing菌劑的組成Componentofhandleah115(對照)215配伍I(Fe3+∶Ni2+0.1∶0.02mg/L·d)315配伍Ⅱ(配伍I+2g固體醬渣)415配伍Ⅲ(配伍I+2gZHC固體菌劑)530(對照)

1.2 方 法

1.2.1 沼氣日產氣量測定

產氣量的測定采用液壓原理，當反應裝置的壓力過大時，會迫使裝滿水的容器中的水溶液移至到另一空瓶中，每隔24 h測量量筒水的體積即為相對日產氣量，連續測量180 d。

1.2.2 沼液樣品總DNA提取及16S rDNA V3片段 PCR擴增

沼液總DNA提取方法參考陳競等[5]的方法。

沼液總DNA 16S rDNA V3片段以341F-GC(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGC GGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCGA-3')和 518R (5'-ATTACCG CGGCTGCTGG-3')為引物進行PCR擴增[6]，引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

PCR 反應體系為：DNA模板1 μL，引物各1 μL，2×PCR mix 25 μL，ddH2O 22 μL。PCR擴增條件為：95℃，4 min；94℃，30 s；63℃，40 s；72℃，30 s，30個循環；72℃，10 min。PCR產物在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

1.2.3 16S rDNA V3區域的兩種膠濃度DGGE分析

參考胡宇容等[7]方法，DGGE的濃度為8%，變性劑梯度為40%～60% (100%的變性劑濃度為：尿素7 mol/L、甲酰胺40%)，回收DGGE圖譜最下端條帶，對其再次擴增后進行變性劑濃度為50%～70%梯度分離。電泳條件為60℃、75V電泳16～18 h，經EB染色后，應用GK-330C凝膠成像系統進行觀察分析。

1.2.4 不同處理階段沼液樣品DGGE優勢條帶回收及測序

回收DGGE優勢條帶和不同處理的差異條帶，采用柱式PAGE膠DNA回收試劑盒進行回收，并以此為模板，以不帶GC夾板的引物341F和518R分別進行PCR擴增，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。送北京六合華大基因科技股份有限公司進行純化測序。將測序結果提交至NCBI，Blast找出最相近的細菌種類，利用MEGA5.0軟件，以鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)繪制進化樹。

1.2.5 Biolog-ECO微平板法測定沼液微生物功能多樣性

采用Biolog-ECO平板法對發酵高峰期樣品的碳源代謝特征進行分析。取50 μL不同處理樣品上層液，加入9 mL 0.9%的生理鹽水中，混勻后，倒入加樣槽，用排槍取150 μL，逐一加入 Biolog 板中，每個樣加4排。接種好的平板置于25℃恒溫培養箱內。每隔24 h測定OD590和OD750。連續培養7 d。

2 結果與分析

2.1 沼氣不同階段產氣量

研究表明，在15℃培養條件下，在發酵0～30 d，產氣總量相比較為處理4>處理2>處理3>處理1，其中處理4產氣量達到764 mL；在發酵31～90 d，產氣總量相比較為處理4>處理1>處理3>處理2，其中處理4產氣量達到4 300 mL；在發酵91～180 d，產氣總量相比較為處理4>處理2>處理3>處理1，其中處理4產氣量達到11 500 mL。在30℃培養條件下的試驗組的啟動期產氣量較大，產氣量在0～30 d達到14 500 mL。圖1

圖1 不同處理不同階段產氣總量
Fig.1 Different samples at different stages of the total gas production

2.2 沼液細菌基因組DNA的提取

提取沼液總DNA結果顯示，提取DNA片段大小約為20 kb以上，目標條帶較好，可進行下一步實驗。圖2

圖2 沼液總 DNA 部分電泳圖
Fig.2 A part of Agarose gel electrophoresis of total DNA

2.3 16S rDNA V3可變區域的PCR擴增結果

2.3.1 細菌16S rDNA V3可變區域的PCR擴增結果

以純化的沼液總DNA為模板，進行16S rDNA V3區域的PCR擴增，獲得PCR產物約為240 bp左右，與預計大小一致。經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與目的條帶一致，可進行后續試驗。圖3

2.3.2 細菌V3可變區片段DGGE分析

按照1.4所述方法進行DGGE電泳，電泳結果表明，隨著發酵不同階段，各條帶從弱到強再到弱的過程，處理2中，條帶3、4、11在發酵30 d有較高豐度，2、5、7、9在發酵90 d條帶豐度明顯，其中5和9號條帶豐度最高。處理3中，條帶4、11在發酵30 d有較高豐度，條帶3、4、10在發酵180 d條帶豐度明顯。處理4中條帶較為豐富，條帶12、13在發酵起始豐度較明顯，條帶3在發酵30 d豐度明顯增強，6、8、9、12、13在發酵90 d條帶豐度明顯，其中6和9號條帶豐度最高。處理5(30℃)中也隨著發酵時間的增長，菌群的條帶逐漸減少， 3、4、11號條帶在發酵30 d有較高豐度，發酵90 d僅4號條帶豐度明顯。同時，分別回收下層膠兩個條帶(上和下)，對其再次進行DGGE 50%～80%膠濃度分離鑒定。圖4

圖3 16S rDNA V3 區 PCR 產物部分電泳圖
Fig.3 A part of Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA V3

注：1.1、1.2、1.3、1.4為處理1發酵第0、30、90和180 d取相同體積的菌泥所提取的總DNA的16S rDNA V3片段PCR擴增產物的DGGE分析圖譜(處理2、3、4、5為相同處理方法及編號)

圖4 不同菌劑處理發酵過程中細菌動態變化 DGGE 電泳圖
Fig.4 Changes of bacterial count of DGGE electrophoresis diagram of different microbes treatment in the fermentation process(40%-60%)

經切膠回收條帶DNA作為模板進行PCR擴增、測序及分析，結果表明，1、3為紫單胞菌屬(Prophyromonadaceaebacterium)，2、4、5、6、7、8為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，9為梭菌屬(Clostridiumsp.)，10、12為擬桿菌屬(Bacteroidetesbacterium)， 11為德庫菌屬(Desemizasp.)，13為毛螺菌屬(Lachnospiraceaesp.)。

2.3.3 細菌V3可變區片段下層膠DGGE分析

DGGE膠濃度為40%～60%時，底層有2個條帶豐富度較高，但回收后大部分無法測序，因此，回收底層豐富度較高的上和下2個條帶，分別對其再次進行膠濃度為50%～80%的DGGE分離鑒定，結果表明，發酵過程中在發酵90 d時相對優勢菌群條帶比較豐度，其中處理2中d、e、k條帶出現較高的豐度，處理3中f、g、h、n、o條帶表現較高的豐度，處理4中f、g、h、n、o、m條帶都具有較高的豐度，處理5在發酵30 d時條帶最為豐富。圖5

圖5 下層膠不同菌劑處理發酵過程中細菌動態變化 DGGE 電泳
Fig.5 Changes of bacterial count of DGGE electrophoresis diagram of different microbes treatment in the fermentation process(50%-80%)

經BLAST對比檢測：c為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，n、f、d、e、g、h為梭菌屬(Clostridiumsp.)，j、k為毛螺菌科(Lachnospiraceaesp.)。a、b條帶序列無同源性對比結果。l、m、o未檢測出結果。表2

2.3.4 細菌16S rDNA V3 可變區優勢基因擴增及系統進化

回收上述優勢條帶和變化較明顯的條帶進行測序分析，所測得的序列在 GenBank 數據庫中進行BLAST 比對分析，并采用MEGA5.0軟件繪制系統進化樹。進化樹結果表明：28條帶中分屬于3個菌門4個綱6個屬，其中，假單胞菌屬(Proteiniphilumsp.)占29%，梭菌屬(Clostridiumsp.)占25%，擬桿菌屬(Bacteroidetessp.)占7.1%。圖6

表2 條帶序列的BLAST結果
Table 2 BLAST results of the sequences

編號No.序列比對Sequencecomparison登陸號Accession最大相似性Maximumidentity(%)種屬Identifiedspecies13HQ142902.19999Prophyromonadaceaebacterium245678JX997896.1999999999999cKF157653.197Pseudomonassp.hgedJN792384.1919389899nfHE610248.1909090Clostridiumsp.1012KJ703058.19596Bacteroidetesbacterium11JX286454.194Desemizasp.13jkJQ997794.1998989Lachnospiraceaesp.

圖6 不同處理羊糞沼氣發酵優勢細菌進化樹
Fig.6 The cladogram of bacteria predominant under the different processing of cattles and sheep dung biogas fementation

2.3.5 不同處理微生物群落代謝平均顏色變化率及多樣性指數

不同處理下，單一碳源代謝活性可由顏色平均變化率來反應。平均顏色變化率(AWCD)是判斷土壤微生物群落利用碳源能力的重要指標之一，代表微生物的代謝活性。5組處理樣品接種培養后，每隔24 h測定吸光值，消除原始菌濃影響后計算平均吸光值，連續7 d后，得到平均吸光值動態變化，結果表明，樣品在24 h后，碳源利用強度開始上升。處理3和4的碳代謝活性較高，處理2在碳代謝水平較弱，處理5由于取樣時間是在發酵末期，因此在碳代謝水平上也表現最弱。圖7

圖7 不同處理生態板AWCD

Fig. 7 Ecological different treatments plate AWCD

研究表明，在發酵高峰階段處理3和處理4的Simpson 指數(D)和Shannon-Wiener 指數(H’)均高于其他組，分別為0.980 2、0.979 5和4.798 7、4.735 8，處理2的McIntosh 指數(U)均高于其它組。在15℃培養條件下的處理樣品的Simpson 指數(D)和Shannon-Wiener 指數(H’)均高于30℃培養條件下的處理5樣品。表3

表3 有機肥微生物多樣性指數
Table 3 Diversity indices of organic fertilizer microorganisms

樣品號Sample平均吸光度AWCD優勢度指數Simpson(D)豐富度指數Shannon-Wiener(H)均勻性指數Mclntosh(U)1(15℃)0.84090.97914.69230.93242(15℃)0.80730.97854.58820.9333(15℃)1.12700.98024.79870.9324(15℃)1.02780.97954.73580.9325(30℃)0.54550.97044.26160.932

3 討 論

3.1 研究通過PCR-DGGE技術，采用兩種梯度濃度的分離方法，對不同處理羊糞沼氣發酵液細菌多樣性進行了對比分析研究。鑒定出的羊糞沼氣優勢菌群主要有，擬桿菌屬菌、紫單胞菌科細菌、假單胞菌，梭菌屬菌等，不同處理的樣品在菌群的種類和數量上都有所變化。(1)在15℃條件下，添加菌劑處理后的反應器中優勢菌的豐度比對照組中更高，在發酵前期中期和末期，細菌群落變化明顯。(2)從回收的28條帶中鑒定出的梭菌屬(Clostridumsp.)占25%、擬桿菌屬(Bacteroidetessp.)占7.1%、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)占29%。(3)在30℃條件下，優勢菌群主要有Bacteroidalesbacterium、Pseudomonassp、Clostridialesbacterium。

實驗中產氣量最高的是添加菌劑Ⅲ的處理4，其優勢條帶在發酵前、中、后期變化明顯，尤其是在發酵90 d后產氣高峰期，優勢條帶變化明顯，其中梭菌屬(Clostridiumsp.)和假單胞菌(Pseudomonassp.)均表現有較高的豐度。同樣的結果也出現在發酵90 d后產氣較高的處理2樣品中，其中梭菌屬(Clostridiumsp.)條帶亮度變化尤為明顯。初步證明在低溫條件下添加配伍III可能改變沼液中優勢微生物種類和豐度的變化，尤其是梭菌屬(Clostridiumsp.)的變化。

進化樹結果也表明，回收的28條帶中梭菌屬(Clostridiumsp.)比例較高，菌劑處理對發酵體系微生物區系的影響還需進一步的研究。相關研究結果也表明，沼氣池中微生物種類豐富，并且擁有優勢群落，各細菌種類不同發酵層、不同發酵時間對微生物多樣性存在影響[8]。假單胞菌(Pseudomonassp.)和擬桿菌(Bacteroidessp.)菌群在有機物的高效降解中發揮重要作用[9]。蔣建林等[10]對農村戶用沼氣池中細菌種類的研究結果表明，占優勢的類群分別為Firmicutes(28%)、Delta-proteobacteria(18%)、Bacteroidetes(17%)，大多數16 S rDNA序列與GenBank數據庫中未培養細菌相似性最高(91%～99%)。宋金龍等[3]對沼氣池的古菌和細菌研究結果也表明，微生物群落在沼氣池的不同層次上呈現出空間分布多樣性的差異，經過富集培養后，微生物群落的多樣性及特異性發生了很大的差別。序列比對的結果顯示，沼氣池中的優勢細菌為梭菌屬(Clostridialessp.)和互養菌屬(Syntrophussp.)。

3.2 利用DGGE分析復雜處理時，獲得高分辨率的圖譜是重要的前提條件。影響DGGE分辨率的因素很多，如DNA(或RNA)的提取、PCR擴增、電泳時間、電泳溫度、凝膠濃度、變性劑梯度、染色方法等，在DGGE操作過程中的每一個環節都會對后續分析產生影響，沼液里的微生物群落結構龐大復雜，即使同樣的發酵底物，來自不同處理的總DNA經DGGE分析，群落結構也會存在差異。因此，為了獲得DGGE的最大分辨率，必須對全部環節進行優化，這一技術對實驗試劑、儀器，操作人的要求都較高，需經過反復摸索才能掌握實驗操作要領。后續將對低溫下添加微生物菌劑對產甲烷古生菌的影響進行研究，為低溫沼氣發酵菌劑的進一步完善，提供理論指導。

3.3 利用Biolog-ECO法分析樣品時，碳代謝活性反映了發酵微生物群落結構的變化，分析結果表明，在15℃培養條件下，產氣高峰期處理2、3和4樣品碳代謝活性相對較高，產氣量也比對照組高。通過微生物群落的多樣性分析發現，處理2的均勻性指數均高于其它處理組。處理3和4的微生物群落的豐富度、優勢度指數均高于其他處理組。而且在處理2產氣高峰期樣品中條帶5和9豐度較高，經BLAST對比分析為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和梭菌屬(Clostridiumsp.)；在處理4的產氣高峰期樣品中條帶6和9為優勢條帶，豐度較高，為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和梭菌屬(Clostridiumsp.)，這兩種菌群可能對低溫條件下甲烷的產生具有一定的促進作用。

4 結 論

微生物群落結構多樣性可能影響了發酵微生物群落功能的多樣性。不同處理下，羊糞低溫沼氣發酵細菌群落比較豐富，添加配伍III的試驗組4號為最優試驗組，產氣量效果為：配伍III>配伍I>配伍II。處理2、3和4對碳源的綜合利用率較高，且其AWCD、物種豐富度、均勻度和優勢度也較高。利用DGGE分子生物學技術對其分析結果為：在低溫條件下(15℃)中，在發酵各階段，群落結構均有所變化，但仍然存在共有優勢菌群，主要包括梭菌屬菌(Clostridiumsp.)、擬桿菌屬(Bacteroidalesbacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、Proteiniphilumsp.等。羊糞低溫沼氣發酵過程中細菌群落的分析表明，梭菌屬(Clostridiumsp.)和假單胞菌屬菌(Pseudomonassp.)對低溫條件下沼氣的發酵具有較好的促進作用。

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Fund project:Supported by NSFC (31260016) and NSFC(21666038)

Analysis of the Diversity by Using Molecular Ecology Techniques for Sheep Slurry Bacterial Communities under Low Temperature Conditions

DAI Jin-ping, CHEN Jin, Guli Ahamat, Marhaba, YANG Xing-ping, FENG Lei

(ResearchInstituteofAppliedMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences，Urumqi830091,China)

【Objective】 The experiment aims to provide a theoretical basis of low-temperature test in sheep biogas fermentation microbial diversity for the preparation of sheep cryogenic methane fermentation agents.【Method】The total DNA 16S rDNA sheep manure slurry V3 region by different treatments was amplified by PCR and the amplified products were separated, recycled and sequenced by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), and phylogenetic trees were constructed with BLAST alignment analysis software. At the same time, the microbial functional diversity of biogas slurry samples was analyzed by biolog-eco method.【Result】PCR-DGGE method results showed that at low temperature (15℃) in the various stages of fermentation, there were dominant bacteria in each stage of fermentation, includingClostridiumsp.,Bacteroidalesbacterium,Pseudomonassp., andProteiniphilumsp. Among them, Sample No. 4 was the optimum treatment agents in test group III. Especially clostridium (Clostridiumsp.) showed a higher abundance; Biolog-ECO assay showed that the peak of gas production in 2, 3 and 4, the carbon activity was relatively high, and the gas production was higher than the control group at a low temperature (15℃). By microbial community diversity analysis, the process uniformity index of treat 2 was higher then others. The microbial community richness and dominance index of treat 3 and 4 was relatively high.【Conclusion】Compatibility III ( compatibility I+2 g ZHC solid microbial agent)is the best in different processing at a low temperature (15℃).

bacteria; low-temperature; PCR-DGGE; 16S rDNA; diversity

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.10.015

2016-04-21

國家自然科學基金項目(31260016)；國家自然科學基金項目(21666038)

代金平(1987-)，女，新疆烏魯木齊人，助理研究員，研究方向為酶工程，(E-mail)383691178@qq.com

馮蕾(1967-)，女，新疆烏魯木齊人，研究員，研究方向為生物能源，(E-mail)fl_xj03@sina.com

S188+.4

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1001-4330(2016)10-1885-09