應用反相高效液相色譜法測定馬血漿中維生素B2及其輔酶的含量

陳俊宏，何雪曼，謝景龍，劉紅菊，王根，楊開倫

(新疆農業大學/新疆肉乳用草食動物營養重點實驗室，烏魯木齊 830052)

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應用反相高效液相色譜法測定馬血漿中維生素B2及其輔酶的含量

陳俊宏，何雪曼，謝景龍，劉紅菊，王根，楊開倫

(新疆農業大學/新疆肉乳用草食動物營養重點實驗室，烏魯木齊 830052)

【目的】建立適用于動物血漿中維生素B2、FMN和FAD含量的測定的反相高效液相色譜法，并測定半歲、一歲、兩歲馬匹血漿中維生素B2、FMN和FAD的含量?！痉椒ā可V條件：ZORBAX Eclipse XDB-C185 μm，4.6×250 mm反相色譜柱；10 mM磷酸二氫鉀緩沖液(含有15 mM 乙酸鎂)與乙腈85∶15(V∶V)，用85%磷酸調節pH至3.4；流速1 mL/min，柱溫25 ℃，上樣量為10 μL，檢測波長熒光檢測，λex=445 nm，λem=530 nm。【結果】昭蘇馬場半歲馬血漿中維生素B2含量(nmol/L)：24.25～29.51；FMN含量(nmol/L)：23.42～25.99；FAD含量(nmol/L)：6.79～10.18。昭蘇馬場一歲馬血漿維生素B2含量(nmol/L)：26.61～35.49；FMN含量(nmol/L)：41.72～66.95；FAD含量(nmol/L)：7.45～13.56。昭蘇馬場二歲馬血漿維生素B2含量(nmol/L)：26.18～32.35；FMN含量(nmol/L)：36.21～44.77；FAD含量(nmol/L)：6.88～9.14?！窘Y論】應用反相高效液相色譜法具有樣品處理簡單、分離效果良好(維生素B25.9 min、FMN 3.5 min、FAD 3.0 min)，易于區分、靈敏度高(維生素B23.32 nmol/L、FMN 6.875 nmol/L、FAD 0.484 nmol/L)和精密度良好(維生素B2、FMN和FAD保留時間相對標準偏差分別為0.17%、0.12%和0.75%；峰面積RSD分別為2.25%、3.6%和4.03%)的特點。

反相高效液相色譜；維生素B2；FMN；FAD；血漿；馬

0 引 言

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要儀器

SHIMADZU高效液相色譜儀，包括：二元洗脫系統(LC-20AB)、RF-20A熒光檢測器、CTO-10AS柱溫控制箱。

色譜柱(ZORBAX Eclipse XDB-C185 μm，4.6×250 mm，Agllent Technologles公司)；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；超聲波清洗儀(KQ5200型)，昆山市超聲儀器有限公司產；漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司產；Eppendorf AG(minspin plus)離心機；AL204電子天平(0.000 1 g)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產；電熱恒溫水槽(SSW-420-2S型，)上海博迅實業有限公司醫療設備廠；PL2002電子天平(0.01 g)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產；JB-3A型定時恒溫磁力攪拌器(上海雷詞磁創意儀器表有限公司)容量瓶(1 000 mL)；pH儀(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產)微量進樣器(50 μL)；Eppendorf管。

1.1.2 主要試劑

維生素B2(Sigma公司，純度99%)，FMN(Sigma公司，純度99%)，FAD(Sigma公司，純度99%)，磷酸二氫鉀(分析純，天津市福晨化學試劑)，乙酸鎂(分析純，天津市登科化學試劑)，三氯乙酸(分析純，天津市致遠化學試劑)，乙腈(色譜純，SK chemicals公司)，甲醇(色譜純，SK chemicals公司)，二次蒸餾水(雙蒸水)，自制。

1.1.3 樣品采集

試驗所使用的馬駒分別來自新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇軍馬場。早晨空腹頸部靜脈采集血樣，將采集的血樣用離心機(3 500 r/min 離心15 min)分離制得血漿，并將血漿冷凍-20℃保存，待測。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理

將血漿樣品充分解凍，混勻后取0.5～1.5 mL Eppendorf管中，加入等體積的15 mM乙酸鎂溶液，充分混勻，65 ℃溫浴15 min。然后加入0.25 mL 10%TCA混勻，10 000 r/min，離心10 min。取上清液，避光放置于4 ℃冰箱，供HPLC分析。

1.2.2 試劑配制1.2.2.1 流動相的配制

緩沖液A：10 mM磷酸二氫鉀和15 mM乙酸鎂(pH 3.4)：稱取KH2PO41.360 9 g；Mg(CH3COO)2·4H2O 3.216 9 g；加入1 000 mL雙蒸水充分溶解，用磷酸調pH至3.4。

量取緩沖液A：850 mL加入色譜純乙腈150 mL，混勻，用0.45 μm的有機濾膜過濾，超聲波脫氣30 min。

1.2.2.2 標準溶液的配制

(1)FMN(MW=455.34，1 mg)：稱取1 mg用4 mL雙蒸水溶解(0.25 mg/mL，即0.55 mM/L)，將0.55 mM/L作為貯備液1，并用50 %甲醇：流動相(v/v)稀釋至110 nM/L作為標準品濃度1。

(2)FAD-2Na(MW=829.51，10 mg)：取10 mg用10 mL雙蒸水溶解(1 mg/mL，即1.21 mM/L)，將1.21 μM/L作為貯備液1，并用50%甲醇：流動相(v/v)稀釋至24.2 nM/L作為標準品濃度1。

(3)維生素B2(MW=376.36)：稱取10 mg維生素B2，用雙蒸水溶解定容到100 mL(0.1 mg/mL，即0.265 7 mM/L，265.7 μM/L)，作為貯備液2，并用50 %甲醇：流動相(v/v)稀釋至53.14 nM/L作為標準品濃度1。

1.2.2.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 5 μm，4.6×250 mm。柱溫箱25 ℃；流速1 mLmin進樣量10 μL。洗脫方式：一元等梯度洗脫。熒光檢測，檢測波長：λex=445 nm，λem=530 nm。

1.2.2.4 標準曲線的制作

將FMN的濃度1分別進行2、4、6、8，10倍稀釋，使FMN的含量(nM/L)分別為110、55、27.5、13.75、6.875。

將FAD的濃度1分別進行2、4、6、8，50倍稀釋，使FAD的含量(nM/L)分別為24.2、12.1、6.05、3.025、0.484。

將維生素B2的濃度1分別進行2、4、6、8，10倍稀釋，使維生素B2的含量(nM/L)分別為53.14、26.57、13.285、6.642 5、3.321 25。上樣量10 μL，采用峰面積外標法進行定量，建立標準曲線。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相的組成

由于維生素B2、FMN和FAD是強極性物質，且結構十分相似，因此在普通反相色譜法中很難實現有效分離。對比了分別在緩沖液加入四丁基氫氧化銨和15 mM 乙酸鎂的分離效果，流動相含有15 mM乙酸鎂可使維生素B2、FMN和FAD得到很好的分離。流動相10 mM磷酸二氫鉀緩沖液(含有15 mM 乙酸鎂)與乙腈85∶15(V∶V)，并用磷酸調節pH至3.4，可使維生素B2、FMN、FAD的色譜峰完全分離，干擾較小。

2.1.2 流速的選擇

流動相的流速會影響組分的保留時間和峰形，進而影響單位時間內出峰的密度和組分分離度。試驗在0.4～1.5 mL/min的流速范圍內分析流速對各組分保留時間和分離度的影響，最終選擇最佳流速為1 mL/min。

2.1.3 流動相梯度

在試驗確定的色譜條件下維生素B2、FAD和FMN的保留時間分別為5.9、3.0和3.5 min。標準品和樣品色譜峰峰形完整，無拖尾現象，三種物質的色譜峰均能很好的分離，樣品與標準品保留時間基本保持一致。圖1～4

2.2 標準曲線的建立

在確立的色譜條件下，以相應濃度值的色譜峰的峰面積為縱坐標，維生素B2、FMN和FAD的濃度為橫坐標 (nM/L)，進行回歸計算，結果表明，在所測濃度范圍內，維生素B2、FMN、FAD物質的量濃度與峰面積線性關系良好。圖5～7

注：圖中1-FAD

Note: 1-FAD

圖1 FAD外標法色譜
Fig.1 Chromatography of FAD

注：圖中2-FMN

Note: 2-FMN

圖2 FMN外標法色譜
Fig.2 Chromatography of FMN

注：圖中3-維生素B2

Note: 3-Riboflavin

圖3 維生素B2外標法色譜

Fig.3 Chromatography of Riboflavin

注：圖中1-FAD；2-FMN；3-維生素B2

Note: 1-FAD;2-FMN;3-Riboflavin

圖4 馬血漿樣品色譜
Fig.4 Chromatography of plasma sample of horse

圖5 維生素B2的標準曲線Fig.5 Calibration curve of Ribovain

圖6 FMN標準曲線Fig.6 Calibration curve of FMN

圖7 FAD標準曲線
Fig.7 Calibration curve of FAD

2.3 回收率測定

取血漿0.25 mL分別加入到兩個1.5 mL離心管中，再向兩個離心管中分別加入0.25 mL標準濃度2、標準濃度3，再分別加入0.5 mL 15 nM 乙酸鎂，混勻，65 ℃溫浴15 min，加入0.25 mL 10 % TCA混勻10 000 r/min離心10 min，取10 μL上機分析。表1

采用峰面積外標法進行定量，根據樣品加標回收率的計算方法，計算FMN、FAD和維生素B2的回收率。研究表明，三種物質的平均回收率均大于90%，說明樣品中的FMN、FAD和維生素B2均被抽提出，方法可靠。表1

2.4 精密度測定

取標準工作液濃度3，即維生素B2、FMN和FAD的濃度分別為13.285、27.5和6.05 nM/L，進樣量10 μL連續進樣3次。維生素B2、FMN和FAD保留時間相對標準偏差(RSD)分別為0.17%、0.12%和1.1%；以峰面積RSD分別為2.25%、3.6%和4.03%說明儀器精密度良好，可以滿足測定的要求。

表1 FMN、FAD和維生素B2的回收率

Table 1 The recovery rate of Riboflavin, FMN and FAD(n=2)

成分Component樣品中含量(nM/L)Contentinsamples加入量(nM/L)Added測定量(nM/L)Measured回收率(%)Recovered平均回收率(%)AverageRecovery維生素B2Riboflavin7.406.6413.7295.186.1813.2919.0897.0796.13FMN12.8013.7526.1497.0211.8227.538.9898.7697.89FAD1.743.034.5392.081.323.034.2596.7094.39

2.5 穩定性測定

取一歲馬血漿樣品3個，按1.2.1的樣品處理方法制備供試品溶液，分別于制備后0、24、48 h各進樣一次，進樣量10 μL。維生素B2、FMN和FAD峰面積相對標準偏差(RSD)分別為3.62%、4.01%和3.51%，表明供試樣品在48 h內穩定，穩定性良好。表2

2.6 馬血漿中維生素B2、FMN和FAD的含量

測得昭蘇半歲馬、1歲馬和2歲馬血漿中維生素B2、FMN和FAD的含量為，昭蘇半歲馬血漿中維生素B2、FMN、FAD含量范圍分別是：24.25～29.51、23.42～25.99和6.79～10.18 nM/L。一歲馬血漿中維生素B2、FMN、FAD含量范圍分別是：26.61～36.47、53.21～10.94和10.11～2.09 nM/L。兩歲馬血漿中維生素B2、FMN、FAD含量范圍分別是：26.18～32.35、36.21～44.77、6.88～9.14 nM/L。表3

表2 FMN、FAD和維生素B2穩定性

Table 2 The s
Table of Riboflavin, FMN and FAD(n=3)

成分Component0h峰面積0hPeakArea24h峰面積24hPeakArea48h峰面積48hPeakArea平均數±標準差mean±S.D.RSD/%維生素B2 VB23578±151.133846±181.793699±148.543707.67±134.213.62FMN2156±283.092245±239.152072±304.072157.67±86.514.01FAD1382±93.641355±45.081450±94.881395.67±48.953.51

表3 馬血漿中維生素B2、FMN和FAD含量Table 3 The content of Riboflavin, FMN and FAD in plasma of horse(nM/L)

3 討 論

3.1 馬血漿中維生素B2、FMN和FAD含量測定方法的建立

采用高效液相色譜法測定血液中維生素B2含量的方法較多。韋京豫等[18]建立了鼠血漿和全血中維生素B2含量的高效液相色譜分析方法；劉麗燕等[19]采用C18反相色譜柱，以甲醇和磷酸鹽緩沖溶液作流動相，建立測定人血清中維生素B2的方法，但是關于同時測定維生素B2及其輔酶含量的方法較少。Zempleni[16]提出了利用反相高效液相色譜硫酸銨-甲醇流動相，檢測維生素B2和FMN。但是此方法樣品前處理繁瑣，未能檢測出FAD的含量，不能全面的反應出機體維生素B2的水平。

維生素B2、FMN和FAD都含有異咯嗪和D-核糖醇的強極性物質[20]，且結構十分相似，因此在普通反相色譜法中很難實現有效分離。試驗選用了10 mM磷酸二氫鉀緩沖液(含有15mM 乙酸鎂)與乙腈(pH 3.4)作為流動相，流速1 mL/min，柱溫25℃，熒光檢測，檢測波長：λex=445 nm，λem=530 nm[17]，在上述色譜條件下維生素B2、FMN和FAD的保留時間分別為3.0、3.5和5.9 min，FMN、FAD和維生素B2反相色譜柱的分離效果良好，檢測限為維生素B23.32 nM/L、FMN 6.875 nM/L、FAD 0.484 nM/L?；厥章蕿榫S生素B296.13%±1.34%、FMN 97.89%±1.23%、FAD 94.39%±3.27%，說明樣品處理方法可靠。維生素B2、FMN和FAD保留時間相對標準偏差(RSD)分別為0.17%、0.12%和1.1%；以峰面積RSD分別為2.25%、3.6%和4.03%說明儀器精密度良好，可以滿足測定的要求。樣品中維生素B2、FMN和FAD峰面積相對標準偏差(RSD)分別為3.62%、4.01%和3.51%，表明供試樣品在48 h內穩定，穩定性良好。

3.2 馬血漿中維生素B2、FMN和FAD的含量

有關測定血液中維生素B2的研究已有很多文獻報道，不同動物血漿中維生素B2含量均不同，韋京豫等[16]試驗可知，在大鼠血漿及全血中維生素B2的含量分別為5.9～75和52～76 nmol/L。劉麗燕等[19]測得人血清中維生素B2的含量為14.16～29.33 nmol/L。試驗對馬血漿中維生素B2、FMN和FAD同時進行測定，結果表明，昭蘇馬場半歲馬血漿中維生素B2含量含量：24.25～29.51 nM/L；FMN含量：23.42～25.99 nM/L；FAD含量：6.79～10.18 nM/L。昭蘇一歲馬血漿維生素B2含量：26.61～35.49 nM/L；FMN含量：41.72～66.95 nM/L；FAD含量：7.45～13.56 nM/L。昭蘇二歲馬血漿維生素B2含量：26.18～32.35 nM/L；FMN含量：36.21～44.77 nM/L；FAD含量：6.88～9.14 nM/L。維生素B2含量與上述報道相接近。Steinar等[7]檢測了人類血漿中維生素B2、FMN和FAD的濃度分別為10.5、6.6和7.4 nM/L，其中維生素B2的含量比FMN和FAD高。試驗檢測的FMN含量較高可能是由于FAD不穩定，在酸性條件下易水解生成FMN，FMN和FAD含量的總和也可以反映出維生素B2的水平，所以這并不影響利用該方法對機體維生素B2營養水平的評價[21]。

4 結 論

建立了測定馬血漿中維生素B2、FMN、FAD含量的反相高效液相色譜法，該方法具有簡便、快速、靈敏度高(維生素B23.32 nM/L、FMN 6.875 nM/L、FAD 0.484 nM/L)，精密度高(維生素B2、FMN和FAD保留時間相對標準偏差(RSD)分別為0.17%、0.12%和0.75%；峰面積RSD分別為2.25%、3.6%和4.03%)，分離效果好(維生素B2、FMN和FAD的保留時間分別為5.9、3.5和3.0 min。)的特點，且樣品前處理的方法簡便省時。

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Fund project:Supported by the "12th Five-Year" National Science and technology support program (2012BAD45B02)

Determination of Riboflavin and Riboflavin Cofactor by RP-HPLC in Plasma of Horse

CHEN Jun-hong, HE Xue-man, XIE Jing-long, LIU Hong-ju, WANG Gen, YANG Kai-lun

(XinjiangKeyLaboratoryofHerbivoreNutritionforMeat&MilkProduction,XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052,China)

【Objective】 To develop a rapid reversed-phase high-performance liquid chromatography method for the quantitative determination of riboflavin, FMN, and FAD in plasma of horses.【Method】The chromatographic conditions are: ZORBAX Eclipse XDB-C185 μm，4.6×250 mm reversed phase chromatographic column; Mobile phase 10 mM potassium dihydrogen phosphate(contains 15 mM magnesium acetate) and acetonitrile 85∶15 (V∶V), with 85% phosphoric acid to adjust pH to 3.4, On the flow rate of 1 mL/min, sample amount to 10 μL, column temperature 25℃, detection wavelength fluorescence detection: λex = 445 nm, λem = 530 nm.【Result】Content (nmol/L) of riboflavin, FMN and FAD in plasma of 6-month-aged horse was 24.25-29.51, 23.42-25.99 and 6.79-10.18, respectively; that of those in plasma of 1-year-aged horse was 26.61-35.49, 41.72-66.95, and 7.45-13.56, repectively; that of those in plasma of 2-year-aged horse was 26.18-32.35, 36.21-44.77 and 6.88-9.14, respectively.【Conclusion】The method is simple in sample processing, separation time and easy to distinguish between them (Riboflavin 5.9 min, FMN 3.5 min, and FAD 3.0 min), high sensitivity (Riboflavin 4.43 nmol/L, FMN3.67 nmol/L, FAD 2.02 nmol/L) and high precision (Riboflavin, FMN, and FAD retention time relative standard deviation was 0.17%, 0.12% and 0.17% respectively; peak area RSD were 2.25%, 3.6% and 2.25%, respectively).

RP-HPLC; riboflavin; FMN; FAD; plasma; horse

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.10.021

2016-04-26

“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAD45B02)

陳俊宏(1991-)，男，甘肅人，碩士研究生，研究方向為動物營養與飼料，(E-mail)63793760@qq.com

楊開倫(1966-)，男，云南人，教授，博士生導師，研究方向為動物營養代謝與飼料資源開發，(E-mail)yangkailun2002@aliyun.com.cn

S821.1

A

1001-4330(2016)10-1932-08