CXCR4抑制劑AMD3100對非小細胞肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

樊冀閩 鄭正榮

（福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，福建 泉州 362000）

CXCR4抑制劑AMD3100對非小細胞肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

樊冀閩 鄭正榮

（福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，福建 泉州 362000）

目的 探討CXCR4抑制劑AMD3100對非小細胞肺癌95D細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。方法 分別采用不同濃度（0、10、25、50、100 nmol/L）AMD3100處理高表達CXCR4的非小細胞肺癌95D細胞24、48、72和96 h后用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測增殖抑制率變化，并用Transwell小室內(nèi)法檢測不同濃度AMD3100處理48、96 h后的95D細胞侵襲及遷移能力變化。結(jié)果 AMD3100可不同程度抑制非小細胞肺癌95D細胞增殖，且抑制效應呈濃度依賴性；AMD3100可縮短95D細胞遷移距離和減少穿膜細胞數(shù)（P＜0.05），其效應亦呈濃度依賴性。結(jié)論 CXCR4抑制劑AMD3100可抑制非小細胞肺癌95D細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

CXCR4抑制劑;非小細胞肺癌;侵襲轉(zhuǎn)移;

趨化因子受體（chemokine receptor）在正常的生理狀態(tài)和和非正常生理狀況下都有著重要的作用，它們是一類含有七個跨膜區(qū)的G蛋白藕聯(lián)受體，表達于不同類型細胞上，通過與趨化因子結(jié)合的而表達其功能[1]。趨化因子及趨化因子受體廣泛表達于多種腫瘤細胞，并受趨化因子及其受體網(wǎng)絡的調(diào)控[2]。趨化因子受體CXCR4與腫瘤的侵襲生長及轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究正成為一個新的熱點。趨化因子CXC亞家族的受體有一位成員——CXCR4，它與其特異性配體相作用可觸發(fā)細胞內(nèi)多種信號傳導，從而介導細胞發(fā)揮各種功能行為，包括有造血干細胞的歸巢、炎性細胞的移動等諸多各種生理和病理過程[3]。國內(nèi)外的前期研究發(fā)現(xiàn)趨化因子受體CXCR4及其配體SDF-1α（CXCL12）在多種腫瘤細胞上有所表達，并有著差異性，且對腫瘤生物學行為有著重要調(diào)節(jié)的作用。

有研究證實CXCR4在肺癌組織存在差異性表達，是肺癌細胞表面重要的功能分子。CXCR4在侵襲和轉(zhuǎn)移能力較強的腫瘤細胞中呈現(xiàn)出高表達，且與腫瘤分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)相關(guān)性[4]。AMD3100是CXCR4的特異性抑制劑，是與CXCR4結(jié)合最有效的小分子非肽類抑制劑，它通過與CXCR4第二膜外環(huán)的負電荷區(qū)域結(jié)合，阻斷趨化因子受體CXCR4與其配體相結(jié)合，從而起到抑制SDF-1/CXCR4軸發(fā)揮作用。本研究應用CXCR4特異性抑制劑AMD3100抑制SDF-1/CXCR4軸，探討其對非小細胞肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器：小牛血清、培養(yǎng)基胰蛋白酶1640購自美國Gibco公司；AMD3100購自Sigma公司；非小細胞肺癌95D細胞購自中國科學院上海細胞所；四甲基偶氮唑鹽（MTT）二甲基亞砜（DMSO）購自美國Fluka公司。儀器設(shè)備：ELX800型全自動酶標儀（Bio-tek公司美國）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)95D細胞株行常規(guī)培養(yǎng)：含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基的25 mL培養(yǎng)瓶中，每3～5 d傳代1次，置于37 ℃CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)成功順利傳代后，取對數(shù)生長期細胞進行下一步實驗步驟。

1.3 MTT檢測：以1×10/mL細胞濃度，取對數(shù)生長期細胞，每孔加入

100 μL，接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃ 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，時間期限為24 h，細胞貼壁之后，加入（0、10、25、50、100 nmol/L）不同濃度的AMD3100，在培養(yǎng)24、48、72和96 h后的時間里，每孔逐次加入（20 μL/孔）MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，靜置10 min后，在酶標儀上檢測各孔的吸光數(shù)值（A）。按以下公式計算細胞增殖抑制率（%）=（1－A10～100 nmol/L/A0 nmol/L）×100%。（每個濃度均設(shè)平行重復6孔，并重復實驗3次。）

1.4 人工劃痕實驗：取經(jīng)過不同濃度梯度CXCR4抑制劑AMD3100處理后48、96 h的細胞，分別接種于6孔板中（以5×105/孔的密度），每組設(shè)置2個復孔，常規(guī)培養(yǎng)至形成細胞單層，接著用移液器吸頭在培養(yǎng)板底部劃痕，以倒置顯微鏡觀察、拍攝劃痕邊緣區(qū)域的情況并測量、記錄其相對距離。

1.5 Transwell小室內(nèi)法測定腫瘤細胞的侵襲能力：分別取不同濃度梯度CXCR4抑制劑AMD3100處理后48、96 h的95D細胞，用DMEM清洗3遍，以含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細胞至5×105個/mL，在Transwell小室的上室加入200 μL細胞懸液，在下室中加入600 μL含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵24 h，用棉簽輕輕擦拭，去除Transwell小室上室的細胞，移去聚碳酸酯膜，倒置，風干。24孔板中加入500 μL含0.1%結(jié)晶紫染色，將Transwell小室放置其中，30 min后取出，大量PBS清洗，高倍顯微鏡下取4個視野，拍照記錄，并計算穿膜細胞數(shù)值。

1.6 統(tǒng)計學分析：采用SPSS18.0版軟件對數(shù)據(jù)進行處理。以P＜0.05為有顯著性差異。組間比較采用配對t檢驗，計量資料采用均數(shù)±標準差計算，多組之間的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 AMD3100對95D細胞增殖的影響：95D細胞經(jīng)梯度濃度（0、10、2、50、100 nmol/L）AMD3100處理后，分別于不同時間點（處理后24、48、72、96 h）行MTT檢測，結(jié)果顯示，AMD3100可抑制95D細胞的增殖，并且顯示在10～100 nmol/L的濃度范圍內(nèi)，細胞增殖率隨作用時間延長而有所升高；而在24～96 h內(nèi)的不同時間時限上，增殖抑制率也伴隨著藥物濃度的逐步增加而逐步升高；總體上AMD3100對肺癌95D細胞的增殖抑制呈現(xiàn)出濃度依賴性和時間依賴性的方式，見圖1。

圖1 不同濃度AMD3100處理95D細胞后的增殖抑制曲線

2.2 AMD3100對95D細胞遷移能力的影響：95D細胞經(jīng)梯度濃度（0、10、2、50、100 nmol/L）AMD3100處理后，分別于處理后48、96 h行劃痕實驗進行檢測，以0 nmol/L抑制劑AMD3100為參考，在10～100 nmol/L濃度梯度范圍內(nèi)，隨著AMD3100濃度的升高，95D細胞的遷移距離逐步縮短，這種效應初步顯示出濃度依賴的方，各種濃度間處理結(jié)果差異均具有顯著性（P＜0.05）見表1。

2.3 AMD3100對95D細胞侵襲能力的影響：95D細胞經(jīng)梯度濃度（0、10、2、50、100 nmol/L）AMD3100干預后，分別于處理48、96 h行Transwell檢測，以0 nmol/L AMD3100干預為基線，在濃度為10～100 nmol/L范圍內(nèi)，穿膜細胞數(shù)隨著干預濃度的逐步升高而呈現(xiàn)出細胞數(shù)減少的現(xiàn)象，顯示出濃度依賴性，以上結(jié)果均具有顯著性差異（P＜0.05），見表1。

表1 不同濃度AMD3100干預48、96 h后的細胞穿膜能力和遷移能力的改變

3 討 論

趨化因子受體（chemokine receptor）是一類含有七個跨膜區(qū)的G蛋白耦聯(lián)受體，表達于不同類型細胞上，能與其配體趨化因子相結(jié)合而發(fā)揮功能作用。可參與多種生理和病理過程[1]。過去的研究認為，在G蛋白耦聯(lián)受體的激活、白細胞的歸巢和定向遷移等生理活動中，趨化因子及其受體起重要作用。近年的研究顯示，趨化因受體及配體在血管形成、腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中也扮演著及其重要的角色。

基礎(chǔ)研究表明腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導致臨床肺癌患者治療失敗和直接導致死亡的主要原因，也是肺癌細胞重要的惡性生物學行為之一[5]。Nature雜志發(fā)表Muller等[6]的研究，發(fā)現(xiàn)有趨化因子受體家族的CXCR4在人乳腺癌原發(fā)灶及其細胞系均有高表達，而在諸如淋巴結(jié)、肺、肝臟和骨髓等乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位，則發(fā)現(xiàn)其配體CXC12呈現(xiàn)高水平地表達，CXCR4可與其特異性配體以鎖鑰方式相結(jié)合，進行信號傳導，調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合和偽足形成，從而引起腫瘤細胞的趨化和侵襲，而通過不同方法進行功能性阻斷這一受體則可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。國內(nèi)學者蘇麗萍等人[7]通過鈣離子內(nèi)流實驗發(fā)現(xiàn)趨化因子受體CXCR4的特異性配體趨化因子SDF-1α可以刺激肺癌細胞內(nèi)短暫而迅速的鈣離子釋放，并能引起CXCR4+95D細胞的趨化性運動，而通過AMD3100這CXCR4特異性拮抗劑干預后，細胞的侵襲能力較未藥物干預組有明顯下降。從而推斷抑制劑AMD3100可能競爭性阻斷了趨化因子受體CXCR4與其特異性配體CXCL12的結(jié)合，起到了阻斷/CXCR4生物學軸的生理作用，并最終使得細胞內(nèi)外Ca2+動員及其他進一步相關(guān)的下游效應受阻，導致細胞的趨化運動能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力的下降[8]。

CXCR4/CXCL12生物學軸在非小細胞肺癌的器官特異性轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用，已經(jīng)在Phillips等[9]的研究中得到證實，在他的研究中外科手術(shù)切除的非小細胞肺癌組織標本及培養(yǎng)的細胞系均不同程度的表達有趨化因子受體CXCR4，在其特異性配體SDF-1α的誘導下，CXCR4陽性的非小細胞肺癌細胞系發(fā)生了趨化反應，而在肝臟、骨髓、腎上腺等肺癌腫瘤易轉(zhuǎn)移的靶靶器官中，CXCL12的表達比原發(fā)腫瘤、血清中均較高，從而在這些器官中形成了差異濃度梯度，這可能是促進腫瘤細胞的遷徙、轉(zhuǎn)移的重要因素。我們的研究結(jié)果表明AMD3100可抑制95D細胞增殖，且抑制效應呈濃度依賴方式；AMD3100可縮短細胞遷移距離和減少穿膜細胞數(shù)（P＜0.05），其效應呈濃度依賴性。顯示經(jīng)抑制劑AMD3100干預后的95D細胞的遷移距離有所縮短和穿膜細胞數(shù)目有所減少，此結(jié)果表明AMD3100可通過封閉細胞表面上表達的趨化因子受體CXCR4，從而抑制細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

總之，本實驗通過對趨化因子受體CXCR4抑制劑AMD3100，封

閉、抑制細胞表面CXCR4表達并可降低細胞惡性生物學活性可為臨床阻斷癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點，提示趨化因子受體CXCR4抑制劑AMD3100有望作為抗腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移藥物予以開發(fā)利用，值得進一步深入研究。將會對肺癌癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制有新的認知，從而開辟治療的新思路。

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1671-8194（2016）32-0028-03

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