L-精氨酸對全血血小板膜GP2b/3a表達影響與臨床檢驗學研究

尚曉東劉曉華宋明慧崔乃凡楊 琨

（1 遼寧省遼陽市康復醫院檢驗科，遼寧 遼陽 111000；2 遼寧省遼陽市中心醫院檢驗科，遼寧 遼陽 111000；3 遼寧省人民醫院中心實驗室，遼寧 沈陽 110016）

L-精氨酸對全血血小板膜GP2b/3a表達影響與臨床檢驗學研究

尚曉東1劉曉華2宋明慧2崔乃凡2楊 琨3

（1 遼寧省遼陽市康復醫院檢驗科，遼寧 遼陽 111000；2 遼寧省遼陽市中心醫院檢驗科，遼寧 遼陽 111000；3 遼寧省人民醫院中心實驗室，遼寧 沈陽 110016）

目的 研究分析L-精氨酸對正常人血小板膜GP2b/3a表達的影響與臨床意義。方法 建立全血血小板膜GP2b/3a表達的流式細胞術（FCM）測定方法，觀察L-精氨酸在靜息和活化狀態下對正常人血小板膜GP2b/3a表達的影響。結果 L-精氨酸對靜息血小板膜GP2b/3a表達無明顯影響；而顯著抑制凝血酶、膠原活化的血小板膜GP2b/3a的上調表達，且該效應呈劑量和時間依賴性。結論 L-精氨酸可抑制血小板膜GP2b/3a的表達。

L-精氨酸；GP2b/3a；流式細胞術；檢驗分析

近來年研究發現，一氧化氮（NO）具有多種生物學活性，如舒張血管、抑制血小板活性[1-2]等。目前有關一氧化氮對血小板膜糖蛋白表達的影響報道甚少，而L-精氨酸（一氧化氮的供體）體外作用于全血血小板的研究尚未見報道。本實驗采用流式細胞術檢測全血血小板膜糖蛋白GP2b/3a。表達的方法，觀察體外L-精氨酸在不同因素作用下對血小板膜GP2b/3a表達的影響及作用機制，為尋找防治心血管疾病方法提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料：40例健康青年人[男女各20例，18～32歲，平均年齡（26.2±1.8）歲]，2周內未服用任何藥物。

1.2 主要試劑：L-精氨酸（100毫克/瓶，干粉，Sinma公司）：兔抗人纖維蛋白原抗體（1∶5，Fg-Ab，軍事醫學科學院），純化小鼠ⅠgG（軍事醫學科學院），異硫氰酸熒光素（FⅠTC）標記的羊抗兔ⅠgG（軍事醫學科學院）；HEPES（Sigma公司）HEPES緩沖液（單位mmol/L：NaCl145，KCl 5，MgSO4，1，HEPES10，pH7.4）；凝血酶（Sigma公司）；膠原（蘇州醫學院血栓與止血室）；2%福爾馬林鹽液（37%福爾馬林鹽濃2 mL與1000 mL生理鹽水混勻）。

1.3 實驗方法：參照Janes和武藝[3-4]等方法，使用兔抗人纖維蛋白原抗體，建立全血血小板膜GP2b/3a表達的流式細胞術（FCM）測定方法。

采用真空采血器（WZK-9NC型，含3.8%枸椽酸鈉）由專人經肘正中靜脈取清晨空腹血液（不扎止血帶，l次采血成功），棄去首2 mL，采集l mL脈血（血液∶抗凝劑＝9∶l）。靜置2～3 min，取5 μL全血

分別加至3支含50 μL HEPES緩沖液的1.5 mL離心管中。其中，1號管不含激動劑，2號管含0.5 U/mL凝血酶10 μL，3號管含100 μg/mL膠原10 μL，室溫下孵育20 min后，于各管中分別加入飽和濃度的Fg-Ab（l∶5）10 μL和FⅠTC-ⅠgG（l∶5）10 μL，各孵育20 min，之后用2%福爾馬林鹽液1 mL固定20 min，取l mL樣品入FCM專用測試管內測定靜息相、活化相全血血小板膜GP2b/3a表達，作自身對照。用同樣方法檢測L-精氨酸（1.0 mmol/L）對靜息相、活化相全血血小板膜GP2b/ 3a表達和L-精氨酸在0、0、1、1.0、10 mmol/L濃度下對0.5 U/mL凝血酶誘導的血小板膜GP2b/3a表達的量效關系以及L-精氨酸孵育0、10、20、30 min后對0.5 U/mL凝血酶誘導的血小板膜GP2b/3a表達的時效關系。空白對照組用緩沖液代替GP2b/3a，陰性對照組用純化小鼠ⅠgG代替GP2b/3a。

1.4 觀察和測量：應用流式細胞儀（美國EPⅠCS ELⅠTE型）對全血血小板膜GP2b/3a進行熒光定量，設置空白對照組用緩沖液取代GP2b/3a，陰性對照組用ⅠaG代替GP2b/3a，以消除本底熒光的影響。每例樣本測定10000個血小板，測量每例樣本血小板平均熒光強度（MFⅠ），單位為陽性熒光道數，以此作為血小板膜GP2b/3a的表達量，凡大于正常人血小板膜表面熒光強度的99%的血小板定為陽性血小板，即為活化血小板，陽性血小板百分率（FC%）＝陽性血小板數/10000。

1.5 統計學處理：實驗數據用SPSS統計軟件中配對t檢驗、多個樣本均數比較方差分析、兩兩比較SNK方法進行統計，P＜0.05差異具有統計學意義。

2 結 果

2.Ⅰ L-精氨酸對正常人全血血小板膜GP2b/3a表達（FC%）的影響：表1結果顯示：靜息血小板膜GP2b/3a表達含量（FC%）很低，凝血酶、膠原活化后GP2b/3a表達顯著增加（P＜0.05。L-精氨酸（lmmol/L）對靜息血小板膜表達無明顯影響（P＞0.05）。但顯著抑制凝血酶、膠原活化誘導的血小板膜GP2b/3a（P＜0.05）。

表1 L-精氨酸對血小板膜GP2b/3a表達（FC%）的影響（）

表1 L-精氨酸對血小板膜GP2b/3a表達（FC%）的影響（）

注：#P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.05

Group resting thrombin collagen Control 11.21±1.35 77.23±1.90** 73.35±1.20** L-arg 11.60±1.31# 41.52±1.66* 38.80±1.78*

2.2 L-精氨酸對凝血配誘導的血小板膜GP2b/3a表達的量效、時效關系：表2結果顯示，L-精氨酸在0-10mmol/L范圍內對凝血酶誘導的GP2b/3a表達具有抑制作用，且效應該呈劑量依賴性，線性關系良好（R2=0.9635），方差分析表明，各組之間有顯著的統計學差異（P＜0.05）。SNK法顯示各級間兩兩比較有顯著的統計學差異（P＜0.05）。表3結果表明，1 mmol/L的L-精氨酸與全血血小板孵育0～30 min范圍內對凝血誘導的GP2b/3a表達具有抑制作用，且效應呈時間依賴性，線性關系良好（R2=0.8935），方差分析表明，各組之間有顯著的統計學差異（P＜0.05）。

表2 L-精氨酸對凝血酶誘導的GP2b/3a表達的量-效關系（）

表2 L-精氨酸對凝血酶誘導的GP2b/3a表達的量-效關系（）

注：n=10，#P＜0.05vs group1，*P＜0.05vs group2，△P＜0.05vs group3

GROUPS GPⅡb/Ⅲa Group1(0mmol/L) 58.40±1.20 Group2(0.1mmol/L) 47.10±1.50#Group3(1mmol/L) 32.42±1.14#* Group4(10mmol/L) 28.02±1.27#*△

表3 L-精氨酸對凝血酶誘導的GP2b/3a表達的時-效關系（）

表3 L-精氨酸對凝血酶誘導的GP2b/3a表達的時-效關系（）

注：n=10，#P＜0.05vs group1， P＜0.05vs group2，△P＜0.05vs group3

GROUPS GPⅡb/Ⅲa Group1(0 min) 58.40±1.20 Group2(10 min) 54.90±3.18#Group3(20 min) 32.42±1.14#* Group4(30 min) 29.08±1.10#*△

3 討 論

L-精氨酸為合成NO的前體，可通過NO途徑抑制血小板活性，研究表明，血小板表面具有L-arg運輸系統，給予L-精氨酸后血小板合成NO增加77%。本研究首次在體外證明，L-精氨酸對正常青年人經血小板激動劑凝血酶和膠原活化的全血血小板GP2b/3a的表達具有抑制作用，并呈時間和劑量依賴性。本實驗為全血中研究NO對血小板的作用機制提供了一條新途徑，同時也為飲食中補充適量精氨酸防治心血管病提供了理論依據。

[1] 慕容洋洋,邊彤,蘇寧. L-精氨酸對全血血小板膜GP2b/3a表達影響與檢驗學研究[J].中華醫學檢驗雜志,2015,38(3):166-168.

[2] 白繼文,王長印.檢驗醫學問答[M].北京:人民衛生出版社,2008: 161-169.

[3] 陳杰,孫靜,李華麗.L-精氨酸對血小板膜GP2b/3a表達影響的臨床檢驗學研究[J].中國衛生檢驗雜志,2015,38(3):31-33.

[4] 武藝,左連富,曹雪笠,等.冠心病患者血小板膜結合纖維蛋白原免疫熒光定量研究[J].中華心血管病雜志,2015,43(3):200-202.

R

B

1671-8194（2016）32-0092-02