多種呼吸道病原體的多重實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

邸紅芹，楊永輝，康麗菲，安曉穎，李曉霞，張 輝

(河北省胸科醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050041)

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·論 著·

多種呼吸道病原體的多重實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

邸紅芹，楊永輝，康麗菲，安曉穎，李曉霞，張 輝*

(河北省胸科醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050041)

目的建立多種呼吸道病原體的多重實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(multiplex real-time-PCR， MRT-PCR)檢測方法。方法根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果選定各種呼吸道病原體的靶序列，建立MRT-PCR檢測體系。構(gòu)建質(zhì)粒標準品，檢測建立體系的敏感度、特異度和重復(fù)性，并運用MRT-PCR和單熒光定量PCR檢測臨床樣本進行對比分析。結(jié)果成功建立了多種呼吸道病原體的MRT-PCR檢測體系；該方法特異度較好，最低檢測限為10 copies/μL，重復(fù)性良好，變異系數(shù)為0.99%～2.50%，530例臨床樣本中，MRT-PCR檢測的陽性率為59.2%(314/530)，單熒光定量PCR檢測的陽性率為61.1%(324/530)，陽性檢出率差異不大。結(jié)論建立快速、敏感、特異、穩(wěn)定的MRT-PCR檢測體系，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

呼吸道感染；聚合酶鏈反應(yīng)；敏感性與特異性

呼吸道感染是全球范圍內(nèi)的常見病和多發(fā)病，嚴重威脅著人類健康和生活質(zhì)量。呼吸道病原體來源極為復(fù)雜,包括病毒、細菌、支原體、衣原體、軍團菌等微生物，且傳播迅速，臨床表現(xiàn)相似，患者均表現(xiàn)為發(fā)熱和呼吸道感染癥狀，單從臨床表現(xiàn)很難區(qū)分感染病原體，以致某些患者病情加重錯過最佳治療時機[1]。傳統(tǒng)的檢測方法有病原體分離培養(yǎng)法和免疫檢測法，由于其操作過程繁瑣、敏感度低以及檢測時間較長，無法滿足快速診斷的要求[2]。近年來，隨著分子生物學(xué)檢測方法的介入，給臨床疾病診斷和治療提供了很大的幫助。熒光定量PCR技術(shù)具有高敏感度、高特異度且操作快速簡便等優(yōu)點，在呼吸道病原體診斷中有廣闊的應(yīng)用前景。然而，傳統(tǒng)的熒光定量PCR每次只能擴增一種病原體核酸，要準確檢測致病病原體費時費力，多重實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(multiplex real-time-PCR， MRT-PCR)可以有效彌補這一缺陷，并且成本低廉。本研究建立并評價可同時檢測多種呼吸道病原體的MRT-PCR，旨在實現(xiàn)呼吸道病原體的快速、特異檢測，報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源 選取2015年6月—2016年1月在我院就診的呼吸道感染患者530例。呼吸道病原體來源于疾病控制中心以及我院檢驗科的分離培養(yǎng)，包括甲型流行性感冒病毒(influenza A，IFA)、乙型流感病毒(influenza B，IFB)、副流行性感昌病毒(parainfluenza，PIV)Ⅰ～Ⅳ型、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、冠狀病毒(229E、OC43和NL63)、腺病毒(adenovirus，ADV)、肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)、肺炎衣原體(chlamydia pneumonia，CP)、銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa， PAE)、肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae，SPN)、軍團菌(legionella pneumophila，LPN)、金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，KPN)、結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)、流感嗜血桿菌(haemophilus influenzae，HIN)。整個過程完成按照國家傳染性病原體的安全操作規(guī)范進行。

1.2 呼吸道病原體核酸提取 根據(jù)DNA(QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen，Germany)和RNA(QiaAmp Viral RNA Mini Kit，Qiagen，Germany)試劑盒說明書，提取呼吸道病原體DNA或RNA，并置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 質(zhì)粒標準品構(gòu)建 從美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)下載各呼吸道病原體及亞型的全基因序列，采用MEGA 4.0 同源比對，進化樹分析，篩選保守序列，采用PCR和TA克隆構(gòu)建保守序列標準品。慶用核酸定量儀(Eppendorf)測定質(zhì)粒濃度并根據(jù)公式計算其拷貝數(shù)，通過公式計算質(zhì)粒原始拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(copies/μL)=6.02×1 023×質(zhì)粒濃度(ng/μL)/(堿基數(shù)×660)，再用無核酸酶水(RNA-free ddH2O)按10倍系列稀釋(106～10 copies/μL)，作為各病原體的標準品，用于評價MRT-PCR檢測體系。

1.4 呼吸道病原體檢測引物及探針 根據(jù)各病原體的保守序列，首先采用Beacon designer 8.0設(shè)計MRT-PCR引物及探針，然后使用AutoDimer 和primer 5等軟件分析引物之間的干擾、發(fā)卡結(jié)構(gòu)和二聚體，最后在NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性分析。各探針引物序列見表1，均送往上海生工生物合成。

表1 各種病原體檢測引物及探針

表1 (續(xù))

1.5 呼吸道病原體MRT-PCR檢測體系建立 每一份樣本進行7組MRT-PCR反應(yīng)(A～G，表1)，每組反應(yīng)檢測3種病原體，采用Taqman Fast Virus One-step Master Mix(Invitrogen)作為MRT-PCR的反應(yīng)液(13.5 μL)，其中含有預(yù)混的Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP及RNase抑制劑；然后向反應(yīng)中分別加入1.5 μL各引物/探針(終濃度為0.4 μmol/L)以及10 μL各種病原體樣本或陰性對照(RNA-free ddH2O)，最后將各反應(yīng)管按以下程序在合適的實時熒光PCR儀(如Roche 480)上進行PCR反應(yīng)：50 ℃，15 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；95 ℃，10 min(熱啟動)；95 ℃，15 s(變性)，60 ℃，45 s(退火/延伸， 采集熒光信號)，進行35個循環(huán)。使用熒光定量PCR儀自帶軟件進行結(jié)果分析，所有陰性樣本的信號值都應(yīng)低于閾值；環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)值>35，樣本低于檢測閾值線，報告為陰性；Ct值<35，報告為陽性。

1.6 臨床樣本檢測 采用MRT-PCR和單熒光定量PCR 2種方法對收集的臨床樣本進行檢測，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計，分析MRT-PCR和單熒光定量PCR陽性率，評估MRT-PCR臨床檢測效果。

2 結(jié) 果

2.1 MRT-PCR體系敏感度分析 為了方便評價MRT-PCR檢測呼吸道病原體，以A組為研究對象，進行病原體檢測并分析。將IFA、IFB和PIV1的梯度稀釋標準品(106～1 copies/μL)1∶1∶1混合，作為A組敏感度標準品，同時單熒光定量PCR體系作為陽性對照，陰性對照為水。結(jié)果顯示，A組PCR體系各通道(FAM、VIC和ROX)的擴增曲線都呈“S”形，隨著質(zhì)粒濃度的梯度遞減，擴增的Ct值與其呈正相關(guān)關(guān)系，所建立的MRT-PCR體系的檢測敏感度(最低檢測限)為10 copies/μL，與單熒光定量PCR體系的敏感度相比差異不大(圖1)。其他各組(F～G組)MRT-PCR體系各通道的擴增曲線“S”形，檢測極限均達到10 copies/μL，各反應(yīng)之間引物探針的交叉干擾較小，能夠同時擴增不同病原體的靶序列，故能滿足單一體系中多種病原體檢測的要求。

圖1 MRT-PCR體系敏感度檢測

A.單熒光定量PCR體系；B. IFA擴增曲線；C. IFB擴增曲線；D. PIV1擴增曲線

圖中“1～7”代表106～1 copies/μL 質(zhì)粒標準品

Figure 1 Sensitivity to detect of MRT-PCR system

2.2 MRT-PCR體系特異度分析 以MRT-PCR體系的A組為研究對象，向反應(yīng)體系中分別加入濃度為105 copies/μL的18種呼吸道病原體(IFA、IFB和PIV1除外)質(zhì)粒標準品。結(jié)果顯示A組體系各通道均無擴增，其他各組的結(jié)果都與A組一致，表明各組引物探針的特異度良好。見表2。

表2 呼吸道病原體MRT-PCR檢測體系引物和探針特異度分析

表3 呼吸道病原體MRT-PCR檢測體系重復(fù)性分析

2.4 臨床樣本檢測 對我院收集的530例呼吸道感染患者標本進行MRT-PCR檢測，同時進行單重實時熒光定量PCR分析。結(jié)果顯示，530例標本中，MRT-PCR檢測的陽性率為59.2%(314/530)，單重?zé)晒舛縋CR檢測的陽性率為61.1%(324/530)，陽性檢出率差異不大，同時各類呼吸道病原體均檢測到陽性。

3 討 論

呼吸道感染是臨床最常見的疾病，呼吸道病原體的來源非常復(fù)雜，且臨床表現(xiàn)又極為相似，給臨床醫(yī)師的診斷帶來極大的困難。因此，快速準確鑒定呼吸道病原體是臨床治療合理用藥的依據(jù)。傳統(tǒng)的檢測方法如分離培養(yǎng)和血清學(xué)實驗，耗時長且檢測效率低。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，多種新的診斷方法被用于呼吸道病原體的檢測，如反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)[3-5]、熒光定量PCR[6-8]、巢式PCR、恒溫擴增技術(shù)[9-11]以及基因芯片[12-13]等。Kim等[14]采用巢式PCR和熒光定量PCR對199例石蠟包埋組織標本(包括137例結(jié)核分枝桿菌標本、17例非結(jié)核分枝桿菌標本以及45例其他疾病標本)中結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌特異度基因進行檢測，評估其檢測組織標本的可行性，結(jié)果顯示在結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌標本中，抗酸染色的敏感度為34.3%和17.6%，巢式PCR檢測的敏感度為70.1%和52.9%，熒光定量PCR的檢測敏感度為70.8%和35.3%，2種PCR的檢測敏感度要顯著高于抗酸染色，且都具有很高的特異度。羅思思等[15]基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)建立了禽流感病毒H7亞型和N9亞型的快速檢測方法，結(jié)果顯示該體系在63 ℃反應(yīng)1 h就能特異地檢測禽流感病毒H7亞型和N9亞型，對其他亞型禽流感均無擴增，且最低檢測限為10 copies/μL。目前，基于擴增子拯救PCR技術(shù)(Arm-PCR)的iCubate檢測系統(tǒng)已經(jīng)上市(芯片技術(shù))，該技術(shù)克服了多個靶點擴增條件不兼容，并創(chuàng)新性設(shè)計了一次性全封閉卡盒，以及配套的卡盒處理儀、閱讀儀及控制軟件。iCubate全自動多重微生物核酸檢測系統(tǒng)具有多重、自動、封閉、快速、隨機、敏感等技術(shù)特點，適合應(yīng)用于疾病預(yù)防控制機構(gòu)、出入境檢驗檢疫部門，用于開展病原體篩查、院內(nèi)感染監(jiān)測、環(huán)境監(jiān)測、檢驗檢疫工作、食品衛(wèi)生檢驗工作。

本研究采用MRT-PCR體系快速、高通量地檢測各種呼吸道病原體，經(jīng)一系列方法學(xué)驗證，MRT-PCR體系檢測敏感度良好(最低檢測閾值為10 copies/μL)，與單熒光定量PCR相比無顯著差異。這與Weltia等[16]的報道一致。本研究MRT-PCR反應(yīng)體系特異度好，各引物探針無交叉反應(yīng)，能夠特異地檢測靶序列，且MRT-PCR體系重復(fù)性分析得出CV為0.99%～2.50%，均<5%，重復(fù)性良好。向蕾等[17]根據(jù)4種呼吸道病毒(人腺病毒、人博卡病毒、人偏肺病毒及熱呼吸道合胞體病毒)的保守序列建立MRT-PCR快速檢測體系，體系優(yōu)化后，檢測敏感度為10 copies/μL，對臨床樣本檢測的特異度為100%，表明MRT-PCR體系敏感、特異且重復(fù)性良好，可用于臨床多種呼吸道病原體的檢測。另外，本研究530例臨床樣本中，MRT-PCR檢測的陽性率為59.2%(314/530)，單熒光定量PCR檢測的陽性率為61.1%(324/530)，MRT-PCR與單熒光定量PCR的檢測陽性檢出率相比差異不大，同時各種病原體均檢測到陽性。

總之，建立呼吸道病原體的MRT-PCR檢測體系是十分必要的，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

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(本文編輯：許卓文)

Establishment and application of multiplex real-time fluorescence quantitative PCR assay for detecting various respiratory pathogens

DI Hong-qin, YANG Yong-hui, KANG Li-fei, AN Xiao-ying, LI Xiao-xia, ZHANG Hui*

(Department of Clinical Laboratory, the Chest Hospital of Heibei Province，Shijiazhuang 050041， China)

Objective To develop multiplex real-time fluorescence quantitative PCR(MRT-PCR) assay for detecting various respiratory pathogens. Methods MRT-PCR assay was established with kinds of respiratory pathogenic genes, selected based on their relevant

trains by bioinformatics analysis, as target genes. Standard products and quality control samples were built to testing and analysising the sensitivity, specificity and reproducibility of this system. Clinical samples were used to evaluating MRT-PCR and single fluorescence quantitative PCR. Results The MRT-PCR detection system were successfully established which showed fine specificity. The detection limit of the assays was 10 copies/μL. Coefficient of variation was from 0.99% to 2.50%, which conducted to assess the reproducibility of the assays. Among 530 clinical specimens, the detectable rates of MRT-PCR and single fluorescence quantitative PCR were 59.2%(314/530) and 61.1%(324/530), respectively. Conclusion We developed a fast, specific, sensitive and stable MRT-PCR detection assay, which possessed good clinical application prospect.

espiratory tract infections; polymerase chain reaction; sensitivity and specificity

2016-09-23；

2016-10-18

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(20150147)

邸紅芹(1973-)，女，河北深澤人，河北省胸科醫(yī)院副主任檢驗師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床檢驗學(xué)研究。

*通訊作者。E-mail：zhanghui_4081@sina.com

R517.6

A

1007-3205(2016)11-1302-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.11.016