永登枸杞鮮果晾曬過程中霉腐病原真菌的分離鑒定

袁惠君,李虎軍,賈鴻震,鞏慧玲,馮再平

(蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050)

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永登枸杞鮮果晾曬過程中霉腐病原真菌的分離鑒定

袁惠君,李虎軍,賈鴻震,鞏慧玲,馮再平

(蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050)

以永登枸杞鮮果晾曬過程中產生的霉腐果為材料,分離、純化、鑒定了導致霉腐病發生的病原真菌。結果表明,枸杞鮮果鋪在曬床上2～4 d內出現霉腐病初期癥狀,發病部位常在果柄端或擦傷處。鏈格孢(Alternariaalternata)和戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)是導致霉腐病發生的病原真菌。

枸杞,鏈格孢,戴爾凱氏有孢圓酵母,鑒定

枸杞(LyciumbarbarumL.)是一種在西北地區廣泛栽培的、有重要經濟價值的多年生落葉灌木,其成熟果實作為一種名貴中藥和滋補品[1],已有3000多年的藥用和食用歷史[2],具有補腎養肝、潤肺明目,增強免疫力、防衰老、降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗氧化等多方面的藥用和保健價值,在國內外享有盛譽[3-4]。但是,枸杞鮮果不耐貯藏,常溫下3～5 d內即有30%～90%的鮮果霉爛。目前枸杞鮮果采收后主要的加工方法是晾曬干制[5]。由于鮮果晾曬周期較長,一般夏果需要4～5 d,秋果7～9 d才能達到干制成品的要求[5],所以晾曬過程中常發生大面積霉腐,特別在陰雨天溫度低、濕度大的情況下,可導致60%～100%霉爛,造成巨大經濟損失,已成為制約枸杞產業發展的關鍵問題之一。研究表明:導致新疆枸杞鮮果采后霉腐的病原真菌主要有青霉屬(Penicilliumsp.)、鏈格孢屬(Alternariasp.)、木霉屬(Trichodermasp.)、曲霉屬的黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(Aspergillusflavus)[6]。由于不同地域的氣候、濕度等條件存在差異,同一個作物品種導致霉腐的病原微生物類群可能不同。永登枸杞鮮果干制過程中霉腐病原菌方面的研究未見報道。

本研究分離、鑒定了永登枸杞鮮果晾曬過程中導致霉腐的病原真菌,將為科學防治枸杞果實霉腐,降低枸杞子加工的成本,提高成品品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞霉腐果實 2014年8月采自甘肅省蘭州市永登縣上川鎮枸杞生產合作社曬床,置于無菌安倍瓶中當天運至本校實驗室進行處理;次氯酸鈉(10%) 上海普瑞生物研究所;無水乙醇(≥99.0%)分析純(AR) 天津市大茂化學試劑廠;葡萄糖 分析純(AR),天津市光復科技發展有限公司;瓊脂粉 生化試劑(BR),天津市科密歐化學試劑有限公司。

MGC-1000HP-2型人工氣候箱 上海一恒科學儀器有限公司;SW-CJ-1FD型超凈工作臺 吳江市凈化設備總廠;GZX-9030MBE型烘箱 上海博訊醫療設備廠;YX-24LDJ型手提式高壓滅菌鍋 江陰濱江醫療設備有限公司;AB104-N型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;BCD-551WKM型冰箱 美的集團有限公司;日立HITACHI S-3400N型掃描電鏡 日本Hitach公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 永登枸杞果實霉腐癥狀及病原菌的分離和純化 隨機選取枸杞鮮果,每10粒一組置于無菌培養皿中,在露天自然通風條件下晾曬2、4、6 d后觀察霉腐癥狀。

病原菌的分離和純化采用組織分離法[7],選擇晾曬3 d病斑典型的發病果實沖洗干凈后,在病健交界處剪下5 mm×5 mm的小塊組織,先用2%的次氯酸鈉表面消毒8 min,無菌水洗5遍,再用75%的酒精消毒30 s,無菌水洗8遍后,移至滅菌培養皿中加1 mL無菌水搗碎,用接種環蘸取含菌組織液在PDA平板上劃線,28 ℃培養并挑取單菌落,連續純化3次后的純培養物保存于PDA斜面培養基上置于4 ℃冰箱貯存備用[8-9]。

1.2.2 病原真菌的形態學鑒定 將代表菌株分別置于不同的培養基上。霉菌在馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養基(PCA)25 ℃下培養5～7 d,酵母菌在麥芽汁瓊脂培養基28 ℃下培養3 d,觀察記載菌落培養性狀。挑取霉菌菌絲和酵母制成水裝片,在普通光學顯微鏡下觀察形態;挑取霉菌菌絲和酵母,粘在樣品臺上,置于液氮中速凍后在掃描電鏡下觀察孢子、細胞等形態特征。

1.2.3 病原真菌的分子生物學鑒定 將供試菌株接種到PDA培養基上于25 ℃培養3～5 d后送至大連寶生物工程有限公司進行菌株基因組DNA提取、PCR擴增和測序,將所得序列與GenBank核酸數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行比對。并用MEGA 5.1進行系統發育分析和進化樹構建,用Neighbor joining法構建進化樹,自展次數為1000次。

1.2.4 致病性測定 25 ℃條件下,純化的培養物在PDA培養基上培養3～5 d后用打孔器鉆取直徑5 mm菌餅備用。挑選健康完整的永登縣上川鎮枸杞生產合作社生產的枸杞干果,用無菌水浸泡1 h復水模擬晾曬3 d的枸杞果實,用2%的次氯酸鈉表面消毒8 min,無菌水洗5遍,再用75%的酒精消毒30 s,無菌水洗8遍后,用無菌解剖針刺傷果實,將直徑5 mm菌餅覆蓋在傷口處置于無菌培養皿中在25 ℃的培養箱內培養5 d后觀察并記載發病情況[10],以傷口處覆蓋瓊脂餅的果實為對照。

2 結果與分析

2.1 永登枸杞晾曬過程中果實霉腐病癥狀

從53份發病枸杞果實樣品中共分離得到107個菌落。根據菌落特征主要為霉菌和酵母兩類真菌,各霉菌菌落形態上沒有顯著差異,酵母菌菌落為白色。從出現頻率來看,霉菌菌落92個,占菌落總數的86%;白色酵母菌菌落15個,占菌落總數的14%。枸杞鮮果干制過程中的霉腐主要發生在鮮果鋪在曬床上2～4 d內。發病初期,常在果柄端或擦傷、破皮處長出白色至灰白色菌絲,果實病變部位由鮮紅色轉為暗紅色至黑色(圖1B、圖1C);嚴重時病斑不斷擴大,深入果實內部,使局部或整粒果實軟腐變黑,表面被霉菌菌絲包裹,并擴散感染鄰近的健康果實(圖1D)。

圖1 果實的霉腐病癥狀Fig.1 Rot symptoms of the Yongdeng barbary wolfberry fruits注:A:永登枸杞鮮果;B:晾曬2 d(B)、 C:晾曬4 d、D:晾曬6 d后果實。

圖2 霉腐病原菌鏈格孢的菌落(A,B)、 分生孢子和分生孢子梗(C,D)形態特征Fig.2 Colony(A,B),conidia and conidiophores (C,D)of the pathogen A. alternata 注:A、B:霉腐病原菌鏈格孢的菌落; C、D:分生孢子和分生孢子梗。

2.2 病原真菌的形態特征及分子生物學鑒定

從92個霉菌菌落中隨機挑選g7菌株和g16菌株作為代表菌株,25 ℃條件下,在PCA培養基上培養5 d形成直徑為54～57 mm的圓形菌落。菌落平展,灰色至暗青褐色,表面密絨狀,邊緣整齊背面灰白色至黑褐色,有同心輪紋(圖2A,B)。菌絲有分隔,多分枝;分生孢子梗單生或分枝,直立,直或微彎曲;分生孢子單生或形成短鏈,倒棒形,卵形,倒梨形或近橢圓形,黃褐色,表面光滑或有微刺,具有3～7個橫膈,0～3個縱或斜隔膜,主分隔處不隘縮或略隘縮,孢身長10～40 μm,寬5～12 μm;短喙柱狀或錐狀(圖2C,D)。用 rDNA-ITS區引物對g7和g16菌株進行PCR擴增,得到481 bp的rDNA-ITS序列,與GenBank中收錄的序列進行BLAST比對,結果表明:該菌與鏈格孢(Alternariaalternata)和細極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)的rDNA-ITS序列相似性均達100%,但是細極鏈格形成超過10個孢子連成的無分支孢子鏈,而本研究中g7和g16菌株分生孢子單生或形成短鏈(圖2),與鏈格孢分生孢子形態和產孢表型相符[11]。根據上述菌株的形態特征和ITS序列分析結果(圖3),將g7和g16菌株鑒定為鏈格孢(Alternariaalternata)。

圖3 以ITS-rDNA 基因序列 為分子標記的g7和g16菌株系統進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of g7 and g16 strain based on ITS-rDNA sequence

鏈格孢寄主范圍廣泛,是多種鮮果采后貯藏期間的病原菌[12-14]。蘭璞等[6]的研究結果表明鏈格孢屬(Alternariasp.)真菌是導致新疆枸杞采后霉腐病的主要病原菌之一,與本研究結果相符。鏈格孢屬(Alternariasp.)真菌也是寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)莖和果實內生真菌的優勢種群[15-16]。干制過程中可能由于溫度、濕度、創傷、離體果實抗病能力下降等原因,引發鏈格孢快速生長,導致霉腐病爆發,揭示其中的機理將為下一步有效地控制病原菌的生長繁殖、抑制病害發生、提高枸杞子品質提供理論依據。

從形成白色酵母菌菌落的菌株中隨機挑選g22W菌株為代表在28 ℃、麥芽汁瓊脂培養基上培養2 d形成直徑為0.5～1 cm的白色菌落,表面凸起,光滑,不透明;油鏡和掃描電鏡下單個菌體均為球形或近球形,直徑約2.5～5 μm,多邊芽殖(圖4)。用rDNA-ITS區引物進行PCR擴增,得到該菌株717 bp的rDNA-ITS序列,與GenBank中收錄的戴爾凱氏有孢圓酵母菌(Torulasporadelbrueckii)rDNA-ITS序列進行BLAST比對,序列相似度均達99%～100%。根據上述形態和分子生物學特征(圖5),將g22W菌株鑒定為戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)。

圖4 霉腐病原菌戴爾凱氏有孢圓酵母的 菌落(A)和細胞(B,C)形態Fig.4 Colony(A)and cell morphology(B,C)of the pathogen T. delbrueckii

圖5 以ITS-rDNA 基因序列為 分子標記的g22W菌株系統進化樹Fig.5 The phylogenetic tree of g22W strain based on ITS-rDNA sequence

枸杞鮮果富含多糖類物質[1,4],擦傷、破皮處和果肉暴露在空氣中的果柄端都極易受酵母菌侵染,導致果實發酵腐壞。

2.3 致病性測定

用針刺法接種病原真菌5 d后,果實傷口處均發病。在接種鏈格孢的針孔處形成圓形灰黑色小菌落,果實病變部位由鮮紅色轉為暗紅色至黑色(圖6);在接種戴爾凱氏有孢圓酵母的針孔處形成白色酵母菌菌落(圖6)。在接種部位取發病組織分離純化后再次獲得了接種菌。根據柯赫氏法則,表明鏈格孢(Alternariaalternata)和戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)是永登枸杞晾曬過程中果實霉腐病的致病菌。

圖6 針刺法接種病原真菌后傷口發病情況Fig.6 Symptoms of the diseased fruit after inoculation

3 結論

本研究結果表明,永登枸杞鮮果在晾曬過程中的霉腐病主要在鮮果鋪床后2～4 d內發生,發病部位常在果柄端或擦傷、破皮處,并能擴散感染鄰近的健康果實。鏈格孢(Alternariaalternata)和戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)是永登枸杞鮮果在晾曬過程中導致霉腐病發生的病原真菌。鏈格孢菌能產生毒素[17],本研究中從枸杞霉腐果中分離的鏈格孢菌是否產生毒素及其對人體的危害有待進一步研究,但具有潛在的食品安全風險。戴爾凱氏有孢圓酵母是果酒釀造中的常見酵母,能影響果酒的香氣[18-19],但在枸杞鮮果晾曬中出現可能影響枸杞子成品風味和營養價值。因此,應當全面制定在枸杞鮮果干制過程中主要霉腐菌污染的限量指標,保證食品安全和品質。

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Isolation and identification of the pathogen causing mildew rot of the Yongdeng barbary wolfberry in the air-drying process

YUAN Hui-jun,LI Hu-jun,JIA Hong-zhen,GONG Hui-ling,FENG Zai-ping

(College of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

Thepathogen,causingYongdengbarbarywolfberrymildewrotintheair-dryingprocess,wasisolatedfromdiseasedfruits.Theresultsshowedthatinitialsymptomsofthediseaseappearedwhenfruitswasputonbamboomattwoorfourdayslater.Themainpathogenicsiteswascarpopodiumsidesorscratches.Basedontheresultofpathogenicitytesting,Alternaria alternataandTorulaspora delbrueckiiwasthepathogenofYongdengbarbarywolfberrymildewrot.

barbarywolfberry;Alternaria alternata;Torulaspora delbrueckii;identification

2016-05-10

袁惠君(1974- )，女，碩士，副教授，主要從事果蔬生理及抗逆性研究，E-mail:gsyhj@163.com。

蘭州市科技發展計劃項目(2012-2-161) ；國家自然科學基金(31460629) 。

TS255.36

A

1002-0306(2016)21-0135-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.018