不同pH對嗜酸乳桿菌分選酶相關基因表達及菌體黏附能力的影響

王 剛,吳 振,彭劉楊,潘道東,2,*,王文文,曾小群

(1.寧波大學浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室,浙江寧波 315211;2.南京師范大學食品科學與營養系,江蘇南京 210097)

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不同pH對嗜酸乳桿菌分選酶相關基因表達及菌體黏附能力的影響

王 剛1,吳 振1,彭劉楊1,潘道東1,2,*,王文文1,曾小群1

(1.寧波大學浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室,浙江寧波 315211;2.南京師范大學食品科學與營養系,江蘇南京 210097)

為探究嗜酸乳桿菌在小腸中黏附調控機制,嗜酸乳桿菌黏附與細胞壁分選酶及其相關蛋白的基因表達之間的關系。實驗構建體外模型研究了不同pH培養條件下嗜酸乳桿菌的黏附能力、測定了分選酶基因和分選酶相關蛋白基因相對表達差異。實驗結果表明:在pH5.5～7.5培養條件下,隨著pH升高嗜酸乳桿菌菌體黏附性顯著增加,srt基因及其相關蛋白的基因表達量顯著上調。研究結果為pH對嗜酸乳桿菌的黏附效應的影響機制提供了相關理論依據。

嗜酸乳桿菌,pH,黏附性,分選酶,表達差異

乳酸菌被廣泛應用于發酵食品中,尤其是酸乳、泡菜等[1-2]。乳酸菌作為一類重要的腸道定植型益生菌,能夠促進、維護人體腸道健康。乳酸菌的黏附一方面可以通過競爭性占位形成生物屏障,阻止病原菌與腸黏膜和上皮細胞的結合[3-5];另一方面可以提高乳酸菌在宿主體內的駐留時間,有助于乳酸菌的益生功能發揮[6]。乳酸菌的益生性,主要通過平衡宿主腸道內的微生物群落,提高機體利用乳糖的能力,增強機體對腸道內膽汁的耐受性等方面,來提升機體的免疫功能[7-9]。目前研究主要認為菌體表面黏附蛋白對乳酸菌的黏附有重要影響。關于pH對乳酸菌黏附差異的研究目前主要集中在表面凝聚力和疏水性方面,而對黏附蛋白影響研究較少。

菌體黏附功能發揮需要黏附蛋白的參與,其中分選酶相關黏附蛋白(Sortase-dependent proteins,SDPs)主要包括黏液黏附蛋白(Mucus binding protein,mub),甘露糖特異性黏附蛋白(Mannose-specific adhesin,msa),脂蛋白信號肽酶(Lipoprotein signal peptidase,lspA)在黏附中發揮重要作用[10-11]。這類菌體表面蛋白在菌體細胞壁上的錨定過程,需要這類與膜結合的分選酶(Sortase,Srt)催化完成[12-14]。這類蛋白具有保守的C端信號肽LPXTG的表面蛋白,分選酶負責酶切蘇氨酸和甘氨酸(TG)之間的肽鍵,然后將表面蛋白中暴露的蘇氨酸末端與肽聚糖肽橋結構中的氨基酸催化形成肽鍵,從而將分選酶相關的蛋白錨定在菌體細胞壁上發揮黏附作用[15-18]。研究發現鼠李糖乳桿菌中與Srt酶相關的含有LPXTG肽段的蛋白在其定植到腸道中起到重要作用[6];植物乳桿菌中的mub蛋白可以幫助其駐留腸道及在宿主腸道與致病菌形成競爭性占位[19]。還有研究將分選酶srt基因敲除后,缺失的分選酶基因的乳酸桿菌、金黃色葡萄球菌等用于動物模型毒力檢測時,出現了毒力減弱的現象[20-21]。

圖1 分選酶催化G+菌表面蛋白錨定的過程[15]Fig.1 The process of Sortase catalyzed surface protein anchoring in Gram-positive bacteria[15]

目前研究證明嗜酸乳桿菌可以通過胃部酸性環境進入小腸[22],食物和嗜酸乳桿菌進入小腸后長時間小腸環境對嗜酸乳桿菌的黏附性影響還不清楚。小腸道環境呈弱堿性(pH7.4～7.6),當機體腸道出現炎癥及潰瘍等疾病時pH會降低,腸道功能發生紊亂[23]。為此探究小腸酸堿度對嗜酸乳桿菌黏附調控的關系,實驗用磷酸鹽緩沖液配制不同pH的培養基以維持菌體營養供給和實驗所需酸堿環境,建立體外模型評價不同pH條件下的菌體黏附能力,測定srt基因及Srt相關蛋白基因表達情況。探究不同pH環境下的菌體黏附能力、黏附能力與分選酶相關蛋白基因表達之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LactobacillusacidophilusATCC4356、HT-29細胞 均為本實驗室保存;srt基因、mub基因、msa基因、lspA基因及gapdh基因引物 英濰捷基(上海)貿易有限公司;黏液蛋白Ⅱ型 美國SIGMA公司;細菌總RNA提取試劑盒 美國OMEGA公司;DNA Mark、Trans DNA Mark II、細菌基因組DNA試劑盒、反轉錄PCR試劑盒、qRT-PCR試劑盒 北京全式金生物技術有限公司;南美胎牛血清 上海依科賽生物制品有限公司。

Multigene Thermal Cycler型PCR儀 Labnet公司;Centerifuge 5415R型臺式高速冷凍離心機 Eppendorf公司;Universal HoodⅡ型凝膠成像分析系統 Bio-Rad公司;M200 PRO型TECAN酶標儀 瑞士TECAN公司;Mini Drop ExCell Bio公司;IX53型熒光倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司;LightCycler? 96型熒光定量PCR 瑞士Roche公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同pH條件下嗜酸乳桿菌的生長曲線和pH曲線測定 將嗜酸乳桿菌菌種活化后,以2%的接種量接種到使用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制的pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的200 mL MRS培養基中。37 ℃連續靜置培養,每隔3 h使用平板菌落計數法對各實驗組菌液進行計數并測定培養基的pH,記錄實驗數據。分析實驗數據后繪制各實驗組的嗜酸乳桿菌生長曲線和pH變化曲線。

1.2.2 蛋白黏附性實驗 用PBS(50 mmol/L,pH7.2)將豬II型黏蛋白稀釋至濃度為2 mg/mL。100 μL/孔的蛋白液量加入Costar 96孔透明板中,37 ℃孵育1 h后,用PBS洗三次以除去未與板孔結合的蛋白。移除孔中上層液后,將96孔板在55 ℃烘箱中烘干20 min。在各pH條件下培養的嗜酸乳桿菌在37 ℃恒溫培養10 h,離心PBS洗滌三次,調整菌液密度至1.0(OD600)。100 μL/孔加入菌懸液,恒溫培養箱中37 ℃孵育3 h,使得菌體沉降至黏蛋白表面,板孔中未黏附的菌體用50 mmol/L PBS(0.05% Tween 20,pH7.2)洗滌3次。用1 mg/mL的結晶紫溶液對黏附菌體染色100 μL/孔,室溫下孵育45 min,過量的結晶紫用PBS洗滌三次,100 μL/孔,后在板孔中加入100 μL/孔的PBS于恒溫培養箱中37 ℃搖動孵育1 h,酶標儀中595 nm處測定所得溶液的吸光值,吸光值與黏附細菌數量成正比,統計分析實驗數據[24]。

1.2.3 細胞黏附性實驗 HT-29細胞培養皿加入含有雙抗(青霉素和鏈霉素1×)的細胞全培,置于5%的CO2培養箱中37 ℃常規貼壁培養,待細胞長滿培養皿底面積的80%后傳代培養,實驗過程中均用指數生長期細胞。

各實驗組嗜酸乳桿菌培養10 h,離心(5000 r/min,15 min)PBS洗滌菌體兩次,并將菌液密度調至1.0(OD600)。取10 mL菌液,離心(5000 r/min,15 min)加入10 mL無雙抗細胞培養基,震蕩混勻后于細胞六孔培養皿中每孔加入1 mL菌液,置于細胞培養箱中37 ℃混合培養2 h,移除上層菌液后PBS清洗三次。置于顯微鏡下觀察各組嗜酸乳桿菌的黏附情況,統計各實驗組平均每兩個細胞所黏附的菌數[25]。

1.2.4 嗜酸乳桿菌在不同pH條件下srt基因及分選酶相關蛋白基因表達差異 NCBI中獲得目的基因和內參基因的基因序列,使用primer 5.0軟件進行相應分選酶及分選酶相關蛋白基因和內參基因gapdh基因的引物設計,引物設計結果如表1所示:

嗜酸乳桿菌總RNA的提取及cDNA合成,使用OMEGA公司提供的細菌總RNA提取試劑盒(Bacterial RNA kit),按照試劑盒說明書提取各實驗組培養10 h的菌體總RNA。

表1 qRT-PCR基因引物設計Table 1 Primer design for qRT-PCR

然后根據核酸電泳RNA純度鑒定結果及各組測得總RNA濃度,按照Transgen cDNA合成試劑盒操作說明合成cDNA。實驗采用20 μL反應體系,體系各組份組成如下:Total RNA 1000 ng;5×TransScript? All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL;gDNA Remover 1 μL;RNase-free Water To 20 μL。將各組樣品輕輕混勻,點甩離心后放入普通PCR儀中,實驗參數設置:42 ℃孵育15 min,85 ℃加熱5 s失活TransScript? RT/RI和gDNA Remover,冷卻階段4 ℃恒溫放置。cDNA樣品,4 ℃保存備用。

實驗用qRT-PCR LightCycler? 96儀器,采用20 μL反應體系,體系各組份組成如下:Template(cDNA)1 μL;Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μL;Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL;2×TransStart? Top/Tip Green qPCR SuperMix 10 μL;ddH2O 8.2 μL;Toal volume 20 μL;實驗用Roche專用96孔板加樣后封膜,點甩后進行qRT-PCR擴增。實驗參數設置:94 ℃預變性30 s,循環一次;94 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,循環45次;在60 ℃退火30 s時采集熒光值。之后增加熔解曲線分析步驟:95 ℃變性10 s,65 ℃退火60 s,97 ℃變性1 s,循環一次;在97 ℃變性1 s時連續采集熒光值。冷卻階段:37 ℃孵育600 s,不進行熒光信號采集。

1.3 數據統計與分析

每個實驗均重復三次,實驗數據使用SAS V8版本統計軟件分析,方差分析采用Duncan's Multiple Range Test分析比較,用origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同pH條件下嗜酸乳桿菌的生長曲線和培養基pH變化曲線測定結果

各實驗組嗜酸乳桿菌生長曲線及對應培養基pH變化曲線測定分析結果如圖2所示:

圖2 嗜酸乳桿菌不同條件下的生長曲線及pH變化曲線Fig.2 The growth and pH variation curves for Lactobacillus acidophilus in different MRS medium

由圖2可知,pH過低和過高培養條件下嗜酸乳桿菌調整期較長,靜置培養5 h左右進入對數生長期,細菌大量增殖,25～30 h各組活菌數達到最大,最大菌數有差異。連續監測培養10 h各組菌處于對數生長期,菌液pH與初始pH偏差均小于0.25,pH處于穩定可控范圍。

培養基pH在10 h內穩定可控主要由于緩沖溶液能中和菌體代謝產生的H+,后期嗜酸乳桿菌大量繁殖,產生大量乳酸、乙酸超出了緩沖溶液緩沖能力,導致培養基環境pH急劇下降。嗜酸乳桿菌能夠在低pH條件下生長繁殖,主要原因是低pH下細胞膜對H+轉運能力提高和產堿酶活力提高,降低了環境對菌體產生危害[22]。

2.2 黏附實驗結果與分析

2.2.1 蛋白黏附實驗結果 體外模型下的蛋白黏附實驗結果如圖3所示:

圖3 黏蛋白對各處理組嗜酸乳桿菌的黏附情況Fig.3 Adhesion conditions of Lactobacillus acidophilus under differnt treatment groups on the mucin注：標注不同字母表示差異極顯著(p<0.01), 標注相同字母表示差異不顯著(p>0.05),圖5同。

表2 各實驗組嗜酸乳桿菌對HT-29細胞的黏附情況Table 2 Adhesion conditions to HT-29 cell of different groups

注:黏附細胞數采用平均值±標準誤;a、b、c表示差異性顯著(p<0.01)。由圖3可知pH5.5～6.5各實驗組與對照組之間黏附于黏蛋白的菌體數量無顯著差異(p>0.05),由于嗜酸乳桿菌具有較強耐酸性,而在弱酸性低梯度范圍內培養條件對菌體生長影響較小,所以差異并不顯著。在pH7.0～7.5培養條件下,菌體黏附于黏蛋白的數量相對于其他組顯著增加(p<0.01),菌體對黏蛋白黏附隨著pH的增加逐漸增強。

2.2.2 細胞黏附性實驗結果 各實驗組嗜酸乳桿菌對HT-29細胞的黏附情況,統計分析實驗結果如表2所示:

圖4 各基因的熔解曲線Fig.4 The dissociation curve of each gene注:a、b、c、d、e分別是srt、mub、msa、lsp、gapdh基因的熔解曲線。

由表2可知各組對比結果表明pH7.5時菌體的黏附數量最多,pH6.5～7.5與其他各實驗組相比細菌黏附數量顯著增加(p<0.01),嗜酸乳桿菌對HT-29細胞的黏附性增強。

菌體黏附到黏蛋白是與宿主細胞相互作用引起特定反應的第一步[26]。蛋白黏附實驗和細胞黏附實驗測定在pH4.5～7.5黏附能力增強,菌體更多的黏附于腸道蛋白上則有利于菌體進一步于小腸道細胞相互作用。實驗結果與王彥,孟祥晨等人研究pH對雙歧桿菌的黏附能力研究結果具有一致性,但引起黏附能力改變的因素除表面凝聚力和疏水性方面外還有待進一步的證實[27]。由于菌體在腸道黏附定植需要菌體表面黏附蛋白的參與,據此探究了菌體表面相關黏附蛋白基因表達量的變化。

2.3srt基因與相關蛋白基因相對表達差異結果

LightCycler 96分析軟件,編輯樣品孔后導出各基因熔解曲線(如圖4所示)及擴增的Cq值。采用2-ΔΔCt法,以gapdh基因為內參基因,計算各實驗組相對于pH5.5組的各基因相對表達量,分析各組實驗數據,結果如圖5所示:

圖5 不同pH培養條件下各基因相對表達量Fig.5 The relativity quality of each gene in different pH

由圖5可以看出:在從pH5.5～7.5變化過程中,srt基因、mub基因、msa基因及lspA基因相對表達量均上調。在pH7.5時相對于pH4.5條件下srt基因、mub基因、msa基因、lspA基因表達量分別顯著上調了17.1倍、5.9倍、2.6倍、2.5倍(p<0.01)。

Emma K. Call等人研究將乳酸桿菌中分選酶基因敲除后菌體黏附性降低[20]。由于分選酶負責分選酶相關蛋白的加工錨定,因此分選酶基因表達量及分選酶相關蛋白基因表達量的變化可影響菌體黏附性。嗜酸乳桿菌細胞壁分選酶及相關黏附蛋白基因表達量增加,實驗結果與菌體黏附性變化趨勢一致。

3 結論

嗜酸乳桿菌的黏附性研究對了解乳酸菌益生作用機制具有重要意義。嗜酸乳桿菌在pH5.5～7.5的培養條件下,菌體對黏蛋白和HT-29細胞的黏附性增強。原因可能是分選酶基因表達上調后,分選酶合成量增加,能夠催化錨定較多SDPs蛋白到嗜酸乳桿菌細胞壁表面。由于嗜酸乳桿菌在機體腸道內黏附功能的發揮需要SDPs的參與,所以在正常小腸弱堿性環境中菌體更易黏附定植于人體小腸上皮細胞表面,延長嗜酸乳桿菌在小腸內的駐留時間,促進益生功能發揮。實驗為pH對分選酶及分選酶相關基因表達和嗜酸乳桿菌黏附性影響提供相關理論依據,對于pH對嗜酸乳桿菌黏附效應影響除分選酶相關黏附蛋白因素外,還可以通過基因組學及蛋白組學技術進一步探究pH對菌體黏附差異影響的機制。

[1]張國華,何國慶. 傳統發酵食品中乳酸菌多樣性及其功能特性[J]. 中國食品學報,2013,13(9):174-181.

[2]陳功,張其圣,余文華,等. 四川泡菜乳酸菌多樣性及其功能特性[J]. 食品與發酵工業,2013,39(3):1-4.

[3]Bron P A,Peter V B,Michiel K. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa[J]. Nature Reviews Microbiology,2011,10(1):66-78.

[5]Mobili P,Gerbino E,Tymczyszyn E E,et al. S-layers in lactobacilli:structural characteristics and putative role in surface and probiotic properties of whole bacteria[J]. Current research,technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Formatex Research Center,Badajoz,2010:1224-1234.

[6]von Ossowski I,Satokari R,Reunanen J,et al. Functional characterization of a mucus-specific LPXTG surface adhesin from probioticLactobacillusrhamnosusGG[J]. Applied & Environmental Microbiology,2011,77(13):4465-4472.

[7]Sengupta R,Altermann E,Anderson R C,et al. The role of cell surface architecture of lactobacilli in host-microbe interactions in the gastrointestinal tract[J]. Mediators of Inflammation,2013,2013(1):74-75.

[8]Hyn?nen U,Palva A. Lactobacillus surface layer proteins:structure,function and applications[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,2013,97(12):5225-5243.

[9]Lebeer S,Vanderleyden J,De Keersmaecker SC. Host interactions of probiotic bacterial surface molecules:comparison with commensals and pathogens[J]. Nature Reviews Microbiology,2010,8(3):171-184.

[10]Hanne J,Stefan R,Hans J,et al. Role ofLactobacillusreutericell and mucus-binding protein A(CmbA)in adhesion to intestinal epithelial cells and mucusinvitro[J]. Microbiology,2014,160(4):671-681.

[11]章文明. 仔豬源高粘附性乳酸桿菌的分離鑒定、腸道定植及其粘附相關表面蛋白功能分析[D]. 杭州：浙江大學,2014.

[12]Marraffini L A,Dedent A C,Schneewind O. Sortases and the Art of Anchoring Proteins to the Envelopes of Gram-Positive Bacteria[J]. Microbiology & Molecular Biology Reviews,2006,70(1):192-221.

[13]Mazmanian S K,Liu G,Ton-That H,et al.Staphylococcusaureussortase,an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall[J]. Science,1999,285(5428):760-763.

[14]Zhang J,Wu W,Liu S. Antiinfective therapy with a small molecule inhibitor ofStaphylococcusaureussortase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2014,111(4):13517-13522.

[15]譚祥龍,許玲,石景,等. 轉肽酶Sortase A在蛋白質修飾中的應用[J]. 化學進展,2014(10):1741-1751.

[16]Ilangovan U,Ton-That H,Iwahara J,et al. Structure of sortase,the transpeptidase that anchors proteins to the cell wall ofStaphylococcusaureus[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2001,98(11):6056-6061.

[17]Zong Y,Bice T T H,Schneewind O,et al. Crystal structures ofstaphylococcusaureussortase A and its substrate complex[J]. Acta Cryst D,2004,60(30):31383-31389.

[18]Ton-That H,Marraffini L A,Schneewind O. Protein sorting to the cell wall envelope of Gram-positive bacteria[J]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Cell Research,2004,1694(1):269-278.

[19]Kaushik J K,Kumar A,Duary R K,et al. Functional and probiotic attributes of an indigenous isolate of Lactobacillus plantarum.[J]. Plos One,2009,4(12):e8099.

[20]Call E K,Goh Y J,Selle K,et al. Sortase-deficient lactobacilli:effect on immunomodulation and gut retention.[J]. Microbiology,2015,161(2):311-21.

[21]Mazmanian S K,Liu G,Jensen E R,et al.Staphylococcusaureussortase mutants defective in the display of surface proteins and in the pathogenesis of animal infections[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2000,97(10):5510-5515.

[22]袁崢. 嗜酸乳桿菌耐酸機理研究[D]. 新鄉：河南科技學院,2013.

[23]王靜穎. 人體內的酸堿度[J]. 生物學通報,2004,39(7):62-62.

[24]de Wouters T,Jans C,Niederberger T,et al. Adhesion Potential of Intestinal Microbes Predicted by Physico-Chemical Characterization Methods[J]. PloS one,2015,10(8):e0136437.

[25]Uroic K,Novak J,Hynnoen U,et al. The role of S-layer in adhesive and immunomodulating properties of probiotic starter cultureLactobacillusbrevisD6 isolated from artisanal smoked fresh cheese[J]. LWT-Food Science and Technology,2016,69:623-632.

[26]Van Tassell M L,Miller M J. Lactobacillus adhesion to mucus.[J]. Nutrients,2011,3(5):613-36.

[27]王彥,孟祥晨,王麗群,等. 低pH處理對兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603黏附能力的影響[J]. 微生物學通報,2012,39(6):797-803.

Influence of pH on expression of sortase related genes and adhesion ability ofLactobacillusacidophilus

WANG Gang1,WU Zhen1,PENG Liu-yang1,PAN Dao-dong1,2,*,WANG Wen-wen1,ZENG Xiao-qun1

(1.Key Laboratory of Animal Protein Food Deep Processing Technology of Zhejiang Province,Ningbo University,Ningbo 315211,China;2.Food Science & Nutrition Department of Nanjing Normal University,Nanjing 210097,China)

TostudytheadhesionmechanismofLactobacillus acidophilusinthegutandtherelationshipofbetweenadhesionmechanismwithsortaseandsortasedependentproteinsgenes. In vitro,theadherencewasevaluated.Meanwhile,thesrtgeneandrelatedgenesexpressionweredeterminateunderdifferentpH.TheresultsshowedthatthegeneexpressionlevelsofsrtandrelatedproteinsincreasedsignificantlywiththerangeofpHfrom5.5to7.5.Also,theadhesivenessofLactobacillus acidophiluswasalsoenhanced.ItrevealedsomemechanismsofadhesionabilityinLactobacillus acidophilusupondifferentpHvalues.

Lactobacillus acidophilus;pH;adhesion;enzymeactivity;differentialexpression

2016-06-06

王剛(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：乳品微生物，E-mail:mcgangwang@163.com。

*通訊作者:潘道東(1964-)，男，博士，教授，研究方向：乳品科學，E-mail:daodongpan@163.com。

國家自然科學基金面上項目(31471598；41276121)；浙江省自然科學基金青年基金項目(LQ16C200002)；江蘇省自然科學基金項目(BK20141447)；國家科技部/星火計劃(2015GA701043)；浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室開放基金 (ZX2015000928)；學校人才工程項目(理)/人才引進(ZX2015000594)。

TS252.1

A

1002-0306(2016)21-0166-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.024