氧化苦參堿干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用研究*

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院呼吸科(沈陽110016) 劉 蕾 馬 壯 謝 華 孫文武

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·論著·基礎(chǔ)研究·

氧化苦參堿干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用研究*

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院呼吸科(沈陽110016) 劉 蕾 馬 壯 謝 華 孫文武

目的：探討氧化苦參堿(Oxy)對轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用，期望為肺纖維化治療提供新的候選藥物。方法：選用0.25、0.5、1 mg/ml氧化苦參堿預(yù)處理A549細(xì)胞30 min后，再給與(5 ng/ml)TGF-β1共孵育培養(yǎng)48 h，MTT法檢測細(xì)胞增殖變化，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，Western blot檢測TGF-β1下游信號分子Smad2/3磷酸化變化和EMT標(biāo)志分子E-candherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)變化。結(jié)果：氧化苦參堿能有效干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)變化，抑制TGF-β1介導(dǎo)的Smad2/3磷酸化和E-candherin表達(dá)下調(diào)、N-cadherin和Vimentin表達(dá)上升。結(jié)論：氧化苦參堿能有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，氧化苦參堿可以作為抗肺纖維化治療的候選藥物。

肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是各種不同病因所致肺部疾病的共同結(jié)局，包括特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)、結(jié)節(jié)病、塵肺、過敏性肺炎、藥物和放射線導(dǎo)致肺纖維化以及與膠原血管病有關(guān)的致肺纖維化肺泡炎等。肺纖維化的致死率高，5年生存率僅次于肺癌，且其發(fā)病率正呈逐年上升趨勢[1]。肺纖維化的發(fā)病機制復(fù)雜，目前研究認(rèn)為上皮細(xì)胞受損后發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，同時成纖維細(xì)胞發(fā)生異常增殖是肺纖維化形成的兩個主要環(huán)節(jié)[2]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor，TGF-β1)是一種重要的致纖維化生長因子，能夠通過其下游TGF-β受體以及Smads蛋白刺激成纖維細(xì)胞增殖和膠原的合成，促進(jìn)膠原蛋白、纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸、蛋白聚糖等在細(xì)胞外基質(zhì)中沉淀，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，在很多器官纖維化疾病中都被認(rèn)為是纖維化的“總開關(guān)”[3]。研究報道指出，TGF-β1介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞EMT是介導(dǎo)肺纖維化的主要機制之一[4]。氧化苦參堿(Oxymatnine, Oxy)，又稱苦參堿，是從豆科植物苦參(Sophora flavescens ait)或萍科植物廣豆根(Sophora subprostrata)中分離出來的生物堿。研究表明其能夠直接抑制乙型肝炎的復(fù)制，并能夠阻斷肝細(xì)胞的凋亡同時抑制肝纖維化的發(fā)生[5]。本研究中，我們體外培養(yǎng)人肺泡II型上皮細(xì)胞A549，TGF-β1誘導(dǎo)其發(fā)生EMT，使用氧化苦參堿干預(yù)處理，觀察對細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞EMT發(fā)生的影響,期望為肺纖維化治療提供新的候選藥物，有效提高肺纖維化患者的治療效果和生存率。

材料和方法

1 實驗材料 人肺泡II型上皮細(xì)胞A549購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞庫；TGF-β1重組蛋白購自 Sigma公司(純度分別 >99%)；氧化苦參堿購自Baomanbio公司(純度分別>99%)；兔抗人Smad2/3、p-Smad2/3、E-candherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin 多克隆抗體和HRP 標(biāo)記羊抗兔 IgG 購自沈陽萬類科技有限公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒為 Pierce 公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)培養(yǎng)基為 Gibco 公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)所用胎牛血清購自Hyclone公司；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)： 人肺泡A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于飽和濕度，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞長至80%融合時進(jìn)行消化傳代。

2.2 實驗分組： 對數(shù)生長期A549細(xì)胞隨機分為5組：A：對照組(Control)；B：TGF-β1處理組(TGF-β1)；C:TGF-β1+氧化苦參堿低劑量組(TGF-β1+L-Oxy)；D:TGF-β1+氧化苦參堿中劑量組(TGF-β1+M-Oxy)；E:TGF-β1+氧化苦參堿高劑量組(TGF-β1+H-Oxy)。氧化苦參堿預(yù)處理30 min后，再給與(5 ng/ml)TGF-β1共孵育培養(yǎng)48 h，氧化苦參堿參考劑量分別為0.25、0.5、1 mg/ml。

2.3 MTT法檢測氧化苦參堿干預(yù)對TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞增殖的影響： 選擇對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按2000/孔的密度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后換液為無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別加入濃度為0、0.25、0.5、1 mg/ml氧化苦參堿預(yù)處理30 min后，再給與(5 ng/ml)TGF-β1共孵育48 h，每組設(shè)置5個復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后分別加入5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h，棄去上清，加入DMSO 150 μl，充分震蕩20 min，于酶標(biāo)儀上測定其在490 nm處的吸光度值。

2.4 Western blot檢測各組細(xì)胞TGF-β信號通路以及EMT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)： 收集各組細(xì)胞后加入蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40 min，4℃ 12000 rpm/min離心40 min，取上清，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白樣品，于10%聚丙烯酰胺凝膠上行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后100 V電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將PVDF膜放入封閉液中37℃封閉1 h，稀釋一抗4℃孵育過夜。PBS洗膜4次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的稀釋二抗孵育，37℃震搖1 h，洗膜。ECL發(fā)光法曝光成像，掃描入電腦并進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件。各組實驗測試指標(biāo)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗呈正態(tài)分布，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)F檢驗證實方差齊。采用單因素方差分析，組間的兩兩比較均采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氧化苦參堿干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞增殖 MTT法檢測細(xì)胞增殖，測量OD490值代表細(xì)胞數(shù)的多少，體現(xiàn)細(xì)胞增殖能力的變化。按照實驗分組干預(yù)處理48h得到氧化苦參堿(Oxy)干預(yù)后，TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞增殖能力逐漸減弱，低中高Oxy干預(yù)組與TGF-β1處理組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。表明Oxy能有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞增殖,見表1。

表1 氧化苦參堿干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞增殖的影響

2 氧化苦參堿干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞形態(tài)變化 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，得到與對照組細(xì)胞相比，TGF-β1處理細(xì)胞與鄰近細(xì)胞分離，細(xì)胞形態(tài)從鵝卵石狀轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形，由上皮性細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞狀。低中高濃度Oxy干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)變化有所緩解，其中高濃度Oxy干預(yù)效果最佳，細(xì)胞形態(tài)與對照組相比未有明顯改變(圖1)。表明Oxy能有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞間充質(zhì)狀轉(zhuǎn)化。

3 氧化苦參堿干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 TGF-β1活化Smad2/3信號調(diào)控上皮細(xì)胞EMT發(fā)生。Western blot 法檢測Smad2/3、p-Smad2/3表達(dá)得到，TGF-β1處理后 p-Smad2/3表達(dá)上調(diào)，使用Oxy干預(yù)后，能有效抑制p-Smad2/3，高濃度Oxy作用后p-Smad2/3表達(dá)下調(diào)最明顯(圖2A)。表明Oxy能有效干預(yù)TGF-β1/Smad2/3信號活化。同時檢測EMT標(biāo)記分子的表達(dá)變化，得到TGF-β1處理后，A549細(xì)胞上皮標(biāo)記分子E-candherin表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)記分子N-cadherin和Vimentin的表達(dá)上調(diào)，Oxy干預(yù)能有效恢復(fù)E-candherin表達(dá)，降低N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，高濃素Oxy作用效果更明顯(圖2B)。表明氧化苦參堿能有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其可能的機制為干預(yù)TGF-β1/Smad2/3信號活化。

圖2 氧化苦參堿干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[A：Western blot 法檢測TGF-β1下游信號Smad2/3的活化(p- Smad2/3的表達(dá))；B：Western blot 法檢測細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志分子E-candherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)]

討 論

EMT在肺纖維化發(fā)生中發(fā)揮重要作用，抑制EMT發(fā)生有助于緩解肺纖維化[6]。本研究通過使用TGF-β1體外處理肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549，誘導(dǎo)細(xì)胞EMT發(fā)生；通過氧化苦參堿干預(yù)，得到氧化苦參堿能夠有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)的改變；并檢測得到氧化苦參堿能夠有效抑制TGF-β1下游信號分子Smad2/3的磷酸化，抑制間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，恢復(fù)E-candherin的表達(dá)。這些提示氧化苦參堿可能通過干預(yù)TGF-β1介導(dǎo)的Smad2/3的活化，抑制A549細(xì)胞EMT；氧化苦參堿可以作為抗肺纖維治療獲選藥物。

研究顯示，在多種肺疾病中，例如哮喘、慢性阻塞性肺病、先天性肺纖維化、博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化等病理損害誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維母細(xì)胞分化通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，喪失正常表皮完整性，細(xì)胞粘附分子E-candherin和ZO-1表達(dá)丟失；增加間質(zhì)表型分子的表達(dá)如N-cadherin和Vimentin，增強細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生能力，介導(dǎo)肺纖維化的發(fā)生[7]。在PF早期階段肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量和活性增多，合成釋放大量具有多種活性的細(xì)胞因子、前炎性介質(zhì)、趨化因子及蛋白酶類；TGF-β1是關(guān)鍵的纖維相關(guān)因子，其能有效誘導(dǎo)上皮性細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，增殖分化為肌成纖維細(xì)胞母細(xì)胞，誘導(dǎo)肺纖維組織的細(xì)胞外基質(zhì)大量產(chǎn)生，當(dāng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞慢性接觸TGF-β1后細(xì)胞將經(jīng)歷EMT[8]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在百草枯處理的大鼠血清和肺組織增加，TGF-β1 mRNA表達(dá)水平逐漸增加在第7天達(dá)到一個峰值，且TGF-β1增加在羥基脯氨酸和膠原蛋白增加之前，干預(yù)TGF-β1/Smads信號活化后將有效抑制肺纖維化，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生[11]。本研究中，體外培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549，使用TGF-β1處理，觀測得到TGF-β1處理能有效促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞間粘附減少，細(xì)胞呈長梭形，表現(xiàn)間質(zhì)樣表型；同時檢測細(xì)胞EMT標(biāo)記分子得到E-candherin表達(dá)降低、N-cadherin和Vimentin表達(dá)增加。表明已成功建立TGF-β1誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化。

氧化苦參堿具有廣泛的抗腫瘤、抗心律失常、抗炎以及抗病毒等多種藥理作用，苦參堿及其制劑的開發(fā)與應(yīng)用已成為近年來藥學(xué)領(lǐng)域的熱門課題之一[10]。馬鵬等[11]報道，氧化苦參堿能夠改善晚期肝癌患者肝功能，降低AFP、CEA和CA125,延長患者生存時間。張靜等[12]報道，氧化苦參堿可使慢性中度乙肝患者肝功能復(fù)常，膠原纖維下降及凝血酶原活動度恢復(fù)得到明顯改善。已有的研究提示氧化苦參堿能夠通過抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3的磷酸化和核轉(zhuǎn)移有效抑制瘢痕纖維母細(xì)胞膠原蛋白的表達(dá)[13]，通過抑制NF-κB通路減少炎性細(xì)胞因子生成，進(jìn)而抑制腎纖維化[14]。我們的前期研究證實氧化苦參堿能夠通過有效緩解小鼠肺纖維化，抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，下調(diào)炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，降低MPO活性和MDA水平，并能有效抑制TGF-β1的表達(dá)及其下游信號分子Smad2/3的活化[15]。本研究中，通過使用高、中、低三個濃度的氧化苦參堿干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化，得到氧化苦參堿能有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的增殖、細(xì)胞形態(tài)的間質(zhì)變化，恢復(fù)E-candherin的表達(dá)，降低N-cadherin和Vimentin表達(dá)，且可能的機制亦與干預(yù)Smad2/3的活化有關(guān)。表明氧化苦參堿能有效干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞上皮機制轉(zhuǎn)化，可能成為有效的抗肺纖維化藥物。

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(收稿：2016-01-14)

Effect of oxymatnine on TGF-β1 inducing A549 epithelial to mesenchymal cell transition Department of Respiratory Diseases,Shenyang Military Region General Hospital

(Shen yang 110016) Liu Lei Ma Zhuang Xie Hua et al

Objective: We investigated the effect of Oxymatnine (Oxy) on TGF-β1 inducing alveolar epithelial to mesenchymal cell transition, and hope to provide a new candidate for the treatment of pulmonary fibrosis. Methods: After treatment with 0.25, 0.5, 1 mg/ml Oxy separately for 30 min , A549 cells were co-incubation with TGF-β1 (5 ng/ml) for 48h to detecte the cell proliferation changes by MTT, observed the cell morphological changes through microscopy, and analyzed the expression of phosphorylation of Smad2/3and EMT marker molecules E-candherin, N-cadherin and Vimentin by Western blotting. Results: Oxy could effectively interfere with the cellular proliferation and cell morphological changes, inhibited the expression phosphorylation of Smad2/3, E-candherin down-regulated,and N-cadherin and Vimentin up-regulated mediated by TGF-β1. Conclusion: Oxymatrine could inhibit TGF-β1 induced A549 cells epithelial - mesenchymal transition, Oxymatrine could been used as a new candidate drugs for treatment of pulmonary fibrosis.

Oxymatrine Pulmonary fibrosis/physiopathology Transforming growth factor beta 1 Epithelial cells Cell line,transformed

*遼寧省博士啟動基金資助項目(20141175)

氧化苦參堿 肺纖維化/病理生理學(xué) 轉(zhuǎn)化生長因子β1 上皮細(xì)胞 細(xì)胞系，轉(zhuǎn)化

R364.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.001