α-硫辛酸對潰瘍性結腸炎小鼠Th17相關炎癥因子表達影響研究*

中國醫科大學附屬第一醫院消化內科(沈陽 110001) 孫 菁 孫明軍

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α-硫辛酸對潰瘍性結腸炎小鼠Th17相關炎癥因子表達影響研究*

中國醫科大學附屬第一醫院消化內科(沈陽 110001) 孫 菁 孫明軍△

目的：探討α-硫辛酸(α-lipoic acid，ALA)對潰瘍性結腸炎小鼠Th17相關炎癥因子表達的影響。方法：將雄性Balb/c小鼠(22～25 g)隨機分為對照組(Control)、ALA對照組(ALA)、潰瘍性結腸炎組(UC)、ALA治療組(UC+ALA)四組，每組10只，觀察各組小鼠疾病活動指數(DAI)評分，比較結腸質量指數及結直腸組織病理變化；酶聯免疫吸附(ELISA)檢測小鼠血清中IL-17、IL-21分泌情況，RT-PCR檢測結腸組織TNF-α、TGF-β mRNA表達情況。結果：結腸質量指數、DAI及組織病理學評分在對照組及ALA組中無明顯差異，但在UC組中顯著升高，在UC+ALA組中明顯降低(P<0.05)；IL-17、IL-21在對照組及ALA組小鼠血清中的水平無明顯差異，但在UC組中顯著升高，在UC+ALA組中明顯降低(P<0.05)；TNF-α、TGF-β mRNA在對照組及ALA組小鼠結腸組織中的表達水平無明顯差異，但在UC組中顯著升高，在UC+ALA組中明顯降低(P<0.05)。結論：α-硫辛酸能夠降低TNBS引起的潰瘍性結腸炎小鼠IL-17、IL-21、TNF-α、TGF-β等Th17相關炎癥因子的表達水平，改善炎癥反應及病理損傷。

潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)病因及發病機制尚未完全闡明，如何有效緩解UC值得深入研究[1]。近期研究發現炎癥反應以及免疫因素在UC發生發展過程中存在重要影響[2]。輔助性T細胞(T Helper cell，Th)17是有別于Th1及Th2的Th細胞亞群，分泌白細胞介素-17(IL-17A)等細胞因子參與UC發病[3]。α-硫辛酸(α-lipoic acid，ALA)是一種強效抗氧化劑，具有較好的抗氧化應激及降低炎癥反應作用。筆者前期研究發現ALA在TNBS誘導的UC模型中具有保護作用，但其發揮治療作用機制尚未明確。本文在前期研究基礎上，探討ALA干預潰瘍性結腸炎小鼠過程中對Th17相關細胞因子以及炎癥反應的影響，進一步確定ALA在UC治療中的分子機制。

材料及方法

1 材 料 雄性BALB/c小鼠，22～25 g，由中國醫科大學動物中心提供；三硝基苯磺酸(TNBS)、α-硫辛酸(ALA)購自Sigma(美國)；小鼠白介素-17 ELISA試劑盒、小鼠白介素-21 ELISA 試劑盒均購自博士德(武漢)；總RNA提取試劑盒購自天根生化(北京)；M-MLV逆轉錄酶購自百泰克(北京)；RIPA裂解液、-30 ℃低溫切片機購自Leica(德國)，體式顯微鏡購自Motic(廈門)，凝膠電泳及成像系統購自北京六一。

2 動物分組及處理 將雄性Balb/c小鼠(22～25 g)共分為四組：對照組(Control)，ALA對照組(ALA)，潰瘍性結腸炎模型組(UC)，ALA治療組(UC+ALA)，每組10只。采用結腸灌注三硝基苯磺酸(Trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)誘導建立UC模型，對小鼠禁食24 h后進行乙醚麻醉，3 mg TNBS溶解于0.12ml乙醇，并通過長約4 cm導管緩慢經小鼠肛門灌注入小鼠結腸，灌注完成后將小鼠倒立維持2～3 min；Control及ALA組灌注50%乙醇進行假手術處理；灌注后，ALA及UC+ALA組給予80 mg/kg bw/day ALA處理，持續7 d；Control及UC組給予等體積2 %DMSO處理，持續7 d；觀察小鼠生理狀況，參考Cooper等的方法，觀察測量大鼠、精神狀態、腹瀉情況、以及體重變化，綜合評價疾病活動指數(Disease activity index，DAI)；實驗結束后處死小鼠并稱重，切除結腸組織并稱重，計算結腸質量指數(結腸質量/體重)。收集結腸組織凍存或固定用于后續實驗。

3 病理切片HE染色觀察 對各組小鼠同一結腸區域組織進行甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，對根據HDS炎癥分級標準對各組切片進行組織損傷學評分[4]。對病理切片進行觀察，200倍光鏡下，隨機選取8個視野進行觀察和評分。評分標準如下：視野中正常腸粘膜記為0分；缺少1/3隱窩記為1分，缺少2/3隱窩記為2分；上皮層保持完整，存在少量炎癥細胞浸潤，記為3分；黏膜層、黏膜下層以及肌層炎癥細胞增多且明顯存在炎癥細胞浸潤，隱窩及上皮層均消失，記為4分。對8個視野進行評分后取平均值作為該組樣本總的組織病理學評分。

4 ELISA檢測血清樣本中IL-17、IL-21水平 取各組小鼠血清適當稀釋，并對L-17及IL-21標準品進行倍比稀釋，參照ELISA試劑盒說明進行操作，酶標儀450nm波長檢測各組吸光值OD450，制作標準曲線，計算血清樣本中細胞因子IL-17、IL-21濃度，每樣本檢測6次，取均值計算。

5 RT(逆轉錄)-PCR檢測TNF-α、TGF-β mRNA表達情況 收集各組小鼠結腸黏膜組織樣本，利用總RNA提取試劑抽提各組小鼠結腸黏膜組織RNA，經M-MLV逆轉錄酶反應合成cDNA第一鏈，加入相應檢測引物進行PCR檢測TNF-α、TGF-β 基因mRNA表達水平，根據NCBI提供基因序列信息設計，TNF-α上游引物序列： 5’- GAGTCCGGGCAGGTCTACTT -3’；TNF-α下游引物序列： 5’- CCAGGTCACTGTCCCAGCATC -3’；TGF-β上游引物序列： 5’-GCCAGATCCTGTCCAAACTA-3’；TGF-β下游引物序列： 5’-GTTGTTGCGGTCCACCATTA-3’；以β-actin為內參基因，其上游引物序列為： 5’-GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’； β-actin下游引物序列為：5’- GATGTCACGCACGATTTCC -3’；設置PCR反應條件為：95℃，預變性3 min；95℃，變性30 s；58 ℃，退火30 s；72℃，延伸30 s；循環數30。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，掃描分析光密度值，計算TNF-α、TGF-β對β-actin的相對表達量。

6 統計學方法 采用SPSS16.0統計學軟件，數據以平均數±標準差(Mean±sd)表示，兩組間數據比較采用t檢驗，多組間數據比較采用單因素方差分析；P<0.05為存在統計學差異。

結 果

1 小鼠結腸炎活動程度評估 Control組及ALA對照組小鼠飲食正常、精神狀態良好，大便性狀未改變，體重略有增加，結腸質量指數無明顯變化；UC組小鼠造模給藥后，逐漸出現懶動、厭食、腹瀉便血，體重減輕，結腸質量指數增加，DAI評分顯著上升(P<0.05)；而在UC+ALA治療組，進行ALA干預后，相比UC組，小鼠厭食情況有所減輕，體重下降程度減緩，便血逐漸減少或隱血，結腸質量指數下降，DAI評分有所下降(P<0.05)。提示ALA對TNBS誘導的潰瘍性結腸炎具有一定保護作用。

表1 各組小鼠結腸質量指數及DAI評分

2 小鼠腸粘膜組織學病理情況變化 HE染色結果顯示，Control及ALA組小鼠結腸組織黏膜表面光滑，未見明顯充血及炎性水腫，肌層完整；UC組小鼠經TNBS誘導后，小鼠結腸黏膜組織高度充血水腫，上皮細胞損傷脫落，出現間斷性潰瘍面，結腸厚度增加，黏膜中存在大量炎性細胞浸潤，肌層完整性受到破壞，病理評分顯著升高；UC+ALA組小鼠腸粘膜充血水腫癥狀相對UC模型組明顯減輕，潰瘍程度減低，炎癥細胞浸潤程度減輕，有輕微滲出，病理評分相比UC組降低(P<0.05)(圖1)。

圖1 結腸組織病理學觀察(HE，200×)

表2 結腸組織病理學評分

3 血清IL-17、IL-21水平變化 ELISA檢測結果顯示，IL-17及IL-21在Control及ALA組小鼠血清中含量無明顯差異，但在UC組中水平明顯上調(P<0.05)，而經ALA干預，UC+ALA組，與UC模型組比較，IL-17與LI-21水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

4 結腸黏膜TNF-α、TGF-β mRNA表達情況 Control組與ALA組小鼠結腸組織TNF-α、TGF-β mRNA表達水平無顯著差異；與Control組比較，UC模型組小鼠結腸組織中TNF-α、TGF-β表達有所增加，存在顯著差異，而ALA干預后，UC+ALA組小鼠結腸組織中TNF-α、TGF-β表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

表3 各組小鼠血清IL-17、IL-21含量比較(pg/ml)

圖2 結腸粘膜組織中TNF-α、TGF-β mRNA表達(A：RT-PCR檢測結腸粘膜TNF-α、TGF-β mRNA表達；B：結腸粘膜TNF-α、TGF-β mRNA相對表達量；與Control組比較，a P<0.05；與UC組比較，b P<0.05)

討 論

潰瘍性結腸炎(UC)是炎癥性腸病(IBD)的一種，以結直腸黏膜及黏膜下炎癥病變及潰瘍為主要表征，有惡變的危險。全球范圍內，流行病學研究顯示UC的患病率成逐漸上升趨勢。目前臨床治療UC主要采用氨基水楊酸類、免疫抑制劑抗生素類、以及激素類等傳統藥物，但均具有一定程度副作用，開發新的藥物及治療靶點仍然是UC治療的研究焦點。α-硫辛酸(ALA)是一種公認的全能天然抗氧化劑，不僅能夠直接清除自由基，同時還可以促進其他抗氧化劑再生，對于急慢性炎癥均有良好的抗炎功效。目前α-硫辛酸(ALA)對UC的保護作用研究還處于起步階段，相關分子機制仍需要深入探討[5]。筆者前期通過研究發現,ALA能夠抑制TNBS誘導的UC小鼠模型中氧化應激反應以及MAPK信號通路活化，抑制細胞凋亡，減少組織損傷，另有報道指出MAPK及STAT3信號通路的激活能夠促進Th17細胞分化[6]。因此，本實驗在前期研究基礎上進一步探討在ALA對UC模型作用過程中Th17相關細胞因子表達及分泌的影響。

本研究結果顯示，Control組及ALA對照組小鼠生理狀態良好，而UC組小鼠造模給藥后，逐漸出現精神萎靡、厭食、體重逐漸減輕，腹瀉便血，結腸質量指數增加，DAI評分顯著上升，結腸組織病理評分顯著升高；而在UC+ALA治療組，進行ALA干預后，相比UC組，小鼠精神狀態好轉，厭食減輕，體重下降減少，便血輕微或隱血，結腸質量指數下降，DAI評分有所下降，結腸組織病理評分有所降低，提示ALA能夠抑制TNBS誘導的潰瘍性結腸炎病情進展。

Th17細胞是近年來發現的一種Th1、Th2之外新的Th細胞亞群，以特征性分泌IL-17而得名，參與炎癥反應的發生。有研究認為，UC的發生與調節性T細胞(Treg)、Th17細胞之間的平衡破壞存在密切關聯[7]。上調DSS誘導的小鼠腸炎模型中IL-10水平，能夠促進Treg細胞分化而降低Th17細胞比例，重建Treg/Th17平衡，降低IL-17、IL-6、IL-23等炎癥因子水平，從而改善潰瘍性結腸炎癥反應[7]。IL-17是Th17細胞特異性分泌的細胞因子，具有多種生物學活性，是體內強效的炎癥因子之一，能夠誘導促炎癥因子IL-6、TNF-α等表達，參與組織炎癥進展，與多種自身免疫性疾病如多發性硬化、類風濕性關節炎、銀屑病以及炎癥性腸病等密切相關。除了IL-17以外，Th17細胞還分泌其他一些炎癥因子包括TNF-α、IL-21、IL-22等，進而活化中性粒細胞使之募集至炎癥部位，介導前炎癥反應[8]。Th17分化主要受到IL-6、IL-21、TGF-β等的調節作用。TGF-β是Th17細胞分化的重要因子之一，IL-21由Th17細胞大量自分泌后，與TGF-β協調作用，進一步作用于Th17細胞，促進細胞向Th17亞群分化[9]。大量研究表明，UC患者血清中IL-17水平顯著上升[10]。TNF-α作為一種重要的促炎癥因子，能夠促進其他炎癥因子釋放，進而放大炎癥反應，上調內皮細胞粘附因子表達水平，增加腸道通透性以及離子轉運加重腹瀉，參與UC炎癥反應過程以及免疫應答，在UC發病過程以及病程進展過程中扮演重要角色[11]。研究表明，TNF-α在UC發病期間表達水平顯著上升，與UC發生及發展具有重要關聯[12]。

本實驗ELISA檢測結果顯示，IL-17及IL-21在Control及ALA組小鼠血清中含量無明顯差異，但在UC組中水平明顯上調，而經ALA干預后，IL-17與LI-21水平顯著降低，差異有統計學意義；RT-PCR檢測結果顯示，TNF-α、TGF-β mRNA表達水平在Control組與ALA組小鼠結腸組織中無顯著差異，而在UC模型組小鼠結腸組織中表達顯著增加，經ALA干預后，UC+ALA組小鼠結腸組織中TNF-α、TGF-β表達明顯降低，差異有統計學意義。說明ALA可能通過抑制TGF-β及IL-21表達抑制Th17細胞分化，并通過反饋調節進一步抑制IL-17、 TNF-α以及IL-21等炎癥因子的表達分泌，抑制炎癥細胞的浸潤，促進組織損傷修復，起到治療UC的作用。

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(收稿：2016-04-27)

Effect of alpha acid-lipoic on the expression of Th17 related inflammatory factors in mice with ulcerative colitis Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital，China Medical University

(Shenyang 110001) Sun Jing Sun Mingjun

Objective: To investigate the effect of α-lipoic acid (ALA) on the expression of Th17 related inflammatory factors in mice with ulcerative colitis. Methods: The Balb/c mouse model with ulcerative colitis was induced by three sulfonic acid trinitrobenzene (TNBS). Male Balb/c mice (22～25 g) were divided into four groups, with control group (Control), ALA control group (ALA), ulcerative colitis group (UC), and ALA in the treatment of ulcerative colitis group (UC+ALA),10 mice in each group. The colonic mass index, the disease activity index (DAI) and the pathological score of HE (HDS) in each group were calculated. The secretion of IL-17 and IL-21 in mice serum was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The autophagy gene TNF-α, TGF-β mRNA level was detected by RT-PCR. Results: There was no significant difference between Control group and ALA group in the quality index, DAI and histopathology score, but it was significantly increased in the UC group, and significantly lower in the UC+ALA group (P<0.05). There was no significant difference between IL-17 and IL-21 in Control group and ALA group of mice serum levels, but increased significantly in the UC group, and significantly lower in the UC+ALA group (P<0.05). There was no significant difference in the expression levels of TNF-α, TGF-β mRNA and in Control group and ALA group, but significantly increased in the UC group, and significantly lower in the UC+ALA group (P<0.05). Conclusion: The α-lipoic acid can reduce the expression levels of IL-17, IL-21, TNF-α, TGF-β and other Th17 related inflammatory factors in ulcerative colitis mice induced by TNBS, and improve the inflammation, as well as promote pathological damage repair.

Colitis,ulcerative/immunology Thioctic acid @Th17 cells Inflammation mediators Mice

*遼寧省科技廳科技攻關項目(2013020198-202)

結腸炎,潰瘍性/免疫學 硫辛酸 @輔助性T細胞17 炎癥介導素類 小鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.003

△通訊作者