蘆薈大黃素對體外膠質瘤細胞生物學行為的影響

陜西省商洛市鎮安縣醫院神經外科(鎮安711500) 李向忠 李 銀 吳德文

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蘆薈大黃素對體外膠質瘤細胞生物學行為的影響

陜西省商洛市鎮安縣醫院神經外科(鎮安711500) 李向忠 李 銀 吳德文△

目的：探討蘆薈大黃素(Aloe emodin，AE)在體外對膠質瘤SHG44細胞增殖、細胞周期、黏附、遷移和侵襲能力的影響。 方法：將體外人腦膠質瘤細胞分為兩組，實驗組經AE處理(AE濃度分別為20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L和160μmol/L),同時設對照組(未經藥物處理)。采用CCK-8法檢測AE處理后SHG44細胞的增殖情況；流式細胞儀分析細胞周期變化；細胞黏附實驗檢測細胞黏附能力，通過Transwell小室方法檢測AE對SHG44細胞遷移和侵襲能力的影響。 結果：與對照組相比，AE處理膠質瘤SHG44細胞后，CCK-8法及流式細胞儀分析結果顯示AE能抑制SHG44細胞增殖，并呈劑量依賴和時間依賴效應關系；對于細胞周期的影響主要變現為引起細胞發生S期阻滯；AE處理后能降低SHG44細胞的粘附能力；Transwell小室實驗表明AE處理后的SHG44細胞遷移和侵襲能力明顯降低。 結論：AE能通過阻滯細胞周期于S期而抑制膠質瘤SHG44細胞的增殖，并且下調膠質瘤細胞的黏附能力，降低細胞體外遷移及侵襲能力。

腦膠質瘤作為難治性腫瘤之一，發病率在腦腫瘤中占40%～50%[1]，具有侵襲性強和易復發等特點，手術難以完全切除，藥物化療和放射治療也無法高度特異性地殺傷腫瘤細胞。因此，尋求新的治療膠質瘤的方法具有極其重要的意義。蘆薈大黃素(Aloe emodin，AE)作為傳統中藥中的一種生物活性成分,具有多方面作用[2],對腫瘤也有一定的抑制作用[3-4]。但目前有關AE對膠質瘤細胞生物學行為方面的研究鮮見文獻報道。本研究在體外通過細胞培養,觀察AE對體外人膠質瘤細胞株SHG44生物學行為的影響，為使用AE治療膠質瘤提供實驗依據。

材料與方法

1 細胞株及試劑 人腦膠質瘤SHG44細胞由西安醫學院第一附屬醫院中心實驗室提供。蘆薈大黃素(純度>95%)、DMSO試劑購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，DMEM培養基與胎牛血清購自美國Hyclone公司，細胞周期檢測試劑盒購自Becton Dickinson(BD)公司，Matrigel購自BD Biosciences公司，Transwell培養小室購自Millipore公司。

2 細胞培養 將膠質瘤SHG44細胞應用加入10%胎牛血清及100μg/ml青、鏈霉素的DMEM培養液培養，培養條件：37℃、5%CO2及飽和濕度。取對數生長期細胞進行實驗。

3 CCK-8法檢測膠質瘤細胞的增殖 選取對數期生長的SHG44細胞，經胰酶消化、計數，調整細胞濃度后以1×105個/ml濃度接種于96孔培養板內，每孔100μl，每組設5個復孔，24h后，加入不同濃度藥物，使AE終濃度為20、40、80、160μmol/L，以等體積的DMSO溶液代替藥物設置對照組，繼續孵育。用CCK-8分別測定0、24、48和72h時細胞的增殖活性。檢測前2 h，向每孔加入10μl CCK-8溶液，再在培養箱內37℃孵育2 h，用酶標儀測定450nm處各孔的吸光度值A值。計算細胞增殖抑制率。

細胞增殖抑制率=(1-實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%

4 流式細胞儀檢測細胞周期 按照上述培養處理方法，將對照組及AE處理組培養48 h的細胞收集，2000 r/min離心5 min，棄上清液，加冰浴預冷的70%乙醇溶液并振蕩，4℃固定，12h后用PBS洗去殘留的乙醇，每管細胞樣品中各加入15μl碘化丙啶(PI)染色液，室溫條件下反應20 min，上機進行細胞周期檢測。

5 細胞黏附實驗 將Matrigel(50μg/ml)均勻鋪于6孔板底部(100μl/孔)，對照孔加等體積1% BSA，于37℃孵育2h，棄去上清，4℃保存備用。收集預先經不同濃度AE處理24 h的SHG44細胞，制成單細胞懸液，以1×106個/孔的劑量接種于6孔板中，培養2 h后棄去培養液，PBS洗脫3次，用胰蛋白酶消化后重新收集細胞。計數細胞，以3個平行復孔的平均數作為黏附細胞數，計算黏附率：黏附率(%)=黏附細胞總數/總細胞數×100%。

6 細胞遷移實驗 將膠質瘤細胞接種于6孔板，用不同濃度AE培養48h，分別收集各組細胞，調整細胞密度為1×105個/ml，將200μl細胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，孵箱中繼續培養24h，取出Transwell小室，洗滌，用多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色15min，PBS漂洗3次，倒置光學顯微鏡下選取5個視野觀察計算小室膜下的細胞數目，計算每個視野的平均細胞數，即表示細胞的遷移能力。

7 細胞侵襲實驗 采用8μm孔徑、6.5mm直徑的Transwell小室，上室和下室之間以Matrigel膠和聚偏二氟乙烯(PVPF)膜模擬體內的基質和基底膜，其它步驟同遷移實驗，最后計數5個視野穿膜細胞數，計算平均細胞數，表示腫瘤細胞的侵襲能力。

結 果

1AE對膠質瘤細胞增殖的抑制 經酶標儀檢測各組的吸光度值并計算細胞增殖抑制率，表明AE在20～160μmol/L范圍內能夠抑制SHG44細胞的增殖,呈現一定的劑量依賴和時間依賴效應關系(圖1)。

圖1 不同濃度AE對SHG44膠質瘤細胞增殖抑制率

2AE對膠質瘤細胞周期的影響 經AE處理48h后，流式細胞術檢測細胞周期，結果顯示20、40、80、160μmol/LAE處理組被阻滯于S期的細胞數量分別為(9.93±0.38)%、(15.13±0.67)%、(21.59±0.94)%和(28.69±0.59)%，均較對照組(5.24±0.48)%明顯增加(P<0.05)，各組實驗組G0/G1期比例也略微增加，而G2/M期細胞比例則明顯減少，差別具有統計學意義(P<0.05)(圖2)。說明AE作用后可以影響膠質瘤SHG44細胞周期的進程，阻斷膠質瘤細胞增殖周期于S期。

3AE對SHG44細胞粘附能力的影響 細胞粘附實驗結果顯示，20、40、80、160μmol/L的黏附率分別為(38.24±5.16)%、(31.82±4.02)%、(23. 21±3.27)%、(14.03±3.15)%，與對照組(46.39±5.54)%比較，有統計學差異(P均<0.05)，說明AE處理后能抑制SHG44細胞的粘附(圖3)。

圖2 流式細胞儀檢測不同濃度AE處理后細胞周期的變化(1：對照組；2：20μmol/L組；3：40μmol/L組；4：80μmol/L組；5：160μmol/L組)

圖3 各組膠質瘤細胞黏附率比較(*P<0.05)

4AE對SHG44 細胞遷移及侵襲能力的影響 各處理組在AE作用48h后進行Transwell實驗，結果如附表所示，AE各濃度均能減少遷移及侵襲實驗中的穿膜細胞數，差異均具有統計學意義(P<0.05)，說明AE可以降低膠質瘤細胞的遷移、侵襲能力。

附表 不同濃度AE對膠質瘤SHG44細胞遷移及侵襲的影響

討 論

腦膠質瘤是原發性中樞神經系統腫瘤中最常見的類型，盡管臨床上有手術、藥物及放化療等各種治療手段，但其病死率、復發率仍居高不下。AE是蓼科大黃屬植物中的活性成分,屬于蒽醌類物質,目前國內外已經報道了AE在體外對胃癌[5]、甲狀腺癌[6]、乳腺癌[7]、黑色素瘤[8]和口腔癌[9]等多種腫瘤細胞的增殖都有抑制作用,但是對不同的細胞系, 抗擴增的機制并不相同[4]。楊大慶[10]報道，蘆薈大黃素通過抑制腫瘤細胞蛋白質合成所需的肽鏈延長因子eFF-2和肽轉移酶的活性，抵制腫瘤細胞的增殖。

本實驗使用體外細胞模型研究了AE對SHG44細胞增殖、細胞周期、轉移及侵襲能力等生物學行為的影響。研究結果顯示，AE作用于SHG44細胞后，細胞增殖速度減慢，生長受到抑制，S期細胞所占比例增高，證實AE通過阻滯細胞周期于S期，減慢細胞周期進程，從而抑制膠質瘤細胞的增殖。

對于不同的腫瘤類型，AE產生細胞周期阻滯的階段并不完全一樣。在胃癌SGC-7901細胞[11]及鼻咽癌細胞[12]中，AE使得細胞周期阻滯于G2/M期，其機制可能涉及cyclinB1和周期蛋白依賴性激酶1(cdk1)的升高。而在人膠質瘤U87株細胞[13]及U-373MG細胞[14]中AE阻滯細胞周期于S期，其機制則可能與蛋白激酶C(PKC)活性的抑制有關。本研究在膠質瘤SHG44細胞中的關于細胞周期進程的研究結果與文獻基本一致，但其具體機制尚需進一步研究。

侵襲與轉移是惡性腫瘤的特征，癌細胞通過粘附、局部蛋白酶水解、運動3個步驟的反復進行，導致腫瘤向深部組織侵襲及轉移。本文黏附實驗結果表明AE作用后能降低膠質瘤細胞黏附基底膜的能力,既往HeTP等在高轉移人卵巢癌細胞系HO-8910PM中也發現AE可以顯著性抑制腫瘤細胞的黏附能力[15]。關于粘附特性在腫瘤行為中的作用，一方面，腫瘤細胞必須與原來的腫瘤組織脫粘附，才能開始侵襲，故粘附在腫瘤細胞侵襲中起抑制作用；另一方面，腫瘤細胞需要依靠粘附才能在新的部位與基底膜成分結合，形成新的轉移灶，故粘附在腫瘤細胞轉移中起促進作用。本研究顯示AE抑制SHG44細胞粘附Matrigel基質膠，然而這種作用究竟是促進還是抑制膠質瘤細胞的侵襲和轉移，尚需進一步研究。

有研究報道，用鼻咽癌[12]和乳腺癌[7]、膀胱癌[16]和卵巢癌[15]等細胞研究AE的抗腫瘤作用，結果表明AE能抑制腫瘤細胞侵襲和轉移。但是，在結腸癌SW620細胞中的研究與上述情況則剛好相反，即AE的作用能增強腫瘤細胞侵襲能力[17]。以上情況表明AE在不同的腫瘤細胞中的作用不全相同，這提示我們必須進一步研究以明確AE在各種類型腫瘤細胞中的實際效果。

本實驗中，筆者通過Transwell小室的實驗方法利用細胞模型在體外證實AE具有降低膠質瘤SHG44細胞侵襲及遷移能力的作用。有研究證實，在鼻咽癌[12]、黑色素瘤[17]、舌癌[18]及結腸癌[19]中AE可以通過下調MMP-2及MMP-9等的表達來抑制腫瘤的遷移和侵襲。MMP-2與MMP-9是與腫瘤浸潤及轉移關系最為密切的MMPs家族[20]。MMP-2 主要通過特異性降解基膜的主要成分Ⅳ、Ⅴ型膠原，對腫瘤的侵襲轉移有重要作用[21]。MMP-9 可降解多種基質成分，破壞基膜，導致腫瘤細胞的浸潤轉移[22]。

本文實驗結果表明，AE能通過抑制細胞增殖、阻滯細胞周期、降低遷移及侵襲能力等多種途徑發揮抗膠質瘤作用，提示AE有望成為抗膠質瘤藥物。當然，體外實驗與體內腫瘤組織的生物學行為存在很大差異，還需在腫瘤動物模型上進一步探討和驗證，并對其作用機制進行深入研究，從而為臨床應用AE治療膠質瘤提供實驗依據。

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(收稿：2016-05-23)

蘆薈大黃素/藥理學 神經膠質瘤/病理生理學 細胞增殖抑制或刺激藥(中藥) 體外發生 細胞遷移 抑制

R915

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.006

△西安醫學院第一附屬醫院神經外科