非小細胞肺癌中Twist通過TGF-β/Smad3信號通路促進EMT的發生

第四軍醫大學唐都醫院胸腔外科(西安 710038)

崔 凱 王武平△ 孫 盈 趙 芳 高貴洲 王曉東 倪云峰 張 濤 盧 強 李小飛

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非小細胞肺癌中Twist通過TGF-β/Smad3信號通路促進EMT的發生

第四軍醫大學唐都醫院胸腔外科(西安 710038)

崔 凱 王武平△孫 盈 趙 芳 高貴洲 王曉東 倪云峰 張 濤 盧 強 李小飛

目的：探討非小細胞肺癌(NSCLC)組織轉錄因子Twist調控TGF-β/Smad3的表達，促進上皮間質轉化(EMT)的發生機制。方法：采用免疫組織化學法檢測NSCLC組織樣本中Twist、TGF-β/Smad3以及EMT中代表性分子E-cadherin和Vimentin蛋白表達，并統計分析二者表達之間的相關性。結果：Twist、Smad3、Vimentin蛋白陽性著色定位于細胞質和細胞核內，E-cadherin蛋白陽性著色定位于細胞膜。Twist、Smad3、E-cadherin、Vimentin蛋白在NSCLC中陽性率分別為72.3%(120/166)、71.1%(118/166)、54.2%(90/166)、69.9%(116/166)，顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義。Twist與Smad3、Smad3與E-cadherin、Vimentin在NSCLC不同分化程度及不同TNM分期均呈顯著相關。結論：NSCLC中Twist可能通過TGF-β/Smad3信號通路促進EMT的發生。

Twist基因，一種堿性螺旋-環-螺旋轉錄調節因子，正常情況下主要表達于胚胎中胚層、胎盤和成人的某些中胚層來源的未分化組織[1]，但在某些腫瘤組織中如胃癌[2]、前列腺癌[3]、乳腺癌也出現高表達[4]，提示其可能與腫瘤形成相關。隨后研究學者發現Twist還是影響上皮間質轉化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)過程中的重要分子，即能夠抑制E-cadherin的轉錄而使得上皮細胞不能形成具有粘附特性的成熟上皮細胞，進而促使其向間質細胞轉化[5]，而EMT的形成能夠影響腫瘤細胞的侵襲和遷移[6]，由此推測Twist是一種癌基因。Twist基因作為一個高度保守的轉錄因子，通過何種分子調控肺癌EMT發生并不明確。

根據文獻報道，可誘導EMT發生的分子信號通路主要有TGF-β/SMAD3信號通路[7-8]、IL-6/STAT3信號通路[9-10]等。在細胞內，各種信號通路之間并不是孤立存在的，而是通過相互調控、相互制約作用形成一個復雜有序的網絡[11]。因此，本研究采用免疫組織化學法檢測非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)組織樣本中Twist、TGF-β/Smad3以及EMT中代表性分子E-cadherin和Vimentin蛋白表達，并統計分析這幾者表達之間的相關性，初步探討NSCLC中Twist調控EMT發生的分子機制，為闡明NSCLC侵襲轉移的分子機制提供依據。

材料與方法

1 材料選擇

1.1 病理資料和組織標本： 研究所用的石蠟包埋標本取自第四軍醫大學唐都醫院胸腔外科實驗室的組織標本庫。標本選取的對象為2006年1月至2009年1月在我院連續收治的行根治性切除手術的NSCLC患者，共計166 例，有以下情形之一者予以排除：術前曾接受過化療、放療或者同步放化療；術前曾接受過TKIs類藥物如吉非替尼、厄洛替尼等靶向藥物的治療。所有患者的術后病理結果均被證實為NSCLC。所有癌組織標本均有配對的正常肺組織標本作為對照。對應的166肺癌患者臨床資料信息保存完整，包括：年齡、性別、臨床表現、手術方式、腫瘤的大小、組織學類型、分化程度、淋巴結狀態等。另外，選取與實驗組相對應的50例癌旁正常肺組織標本作為對照組。該研究已通過第四軍醫大學臨床研究倫理委員會批準，所有患者臨床信息資料的獲得和腫瘤組織樣本的使用均得到患者或家屬的書面同意。

1.2 主要試劑、儀器及來源： Twist兔單克隆抗體(Abcam公司)，Smad3兔單克隆抗體(Abcam公司)，E-cadherin兔多克隆抗體(Gene tex公司)，Vimentin兔單克隆抗體(Gene tex公司)，β-actin單克隆抗體(Abcam公司)，兔Streptavidin-HRP試劑盒(帶DAB顯色液，北京康為世紀公司)，恒溫水浴箱(北京醫療設備廠)，移液器(賽默飛公司)，低溫冰箱(賽默飛公司)，漩渦混合儀(北京同方公司)，高速控溫離心機(貝克曼庫爾特有限公司)。

2 研究方法

2.1 免疫組化步驟：石蠟包埋的組織塊被切成厚度約為4μm切片經載玻片撈上后在烤片機上進行烤干。之后將石蠟切片在二甲苯中進行脫蠟，通過一系列的酒精梯度溶液進行再水化；用3mol/L的尿素進行消化30min，以暴露組織內的靶點抗原；加檸檬酸鹽溶液進行抗原修復；3%過氧化氫溶液避光條件下封閉30min，以消除過氧化物酶的活性；組織切片于山羊血清中封閉30min，以減少抗體與組織內其它抗原的非特異性結合；孵育一抗，置于4℃冰箱內過夜；次日37℃水溫箱內復溫45min；孵育二抗，37℃水溫箱內反應45min；加入C液，37℃條件下50min；采用DAB法顯色；蘇木素中浸泡90s，再用鹽酸酒精分化液中浸泡7s，脫水后樹膠封片。

2.2 免疫組織化學結果的判定：用光學顯微鏡放大200倍進行免疫組化染色切片的觀察，每張切片隨機選取5個光鏡下視野進行評分。染色面積和著色強度的乘積作為蛋白的免疫組化評分結果。其中染色面積的評分標準：51%～100%的染色面積比率記為3分、11～50%的染色面積比率記為2分、1%～10%的染色面積比率記為1分、1%以下染色面積或沒有染色的記為0分。染色強度的評分標準：無染色記為0分 、弱陽性記為1分、中等陽性記為2分、強陽性記為3分。乘積得分分別為0分、1分、2分、3分、4分、6分和9分。其中蛋白的染色結果≥ 4分者被判定為過表達，小于3分者被判定為陰性表達，介于兩者之間的被判定為弱表達。弱表達和過表達者均被認為是陽性表達。每張切片均由來自不同醫院的經驗豐富的2位病理科專家進行雙盲觀察并打分，最終結果求其平均值。

2.3 統計學方法：采用SPSS 17.0統計學軟件(SPSS, Inc.Chicago, IL)。組織中待測蛋白在臨床病理特點中的表達差異采用Kruskal Wallis H(三組以上)及 Mann-Whitney U(兩組之間)檢驗法進行秩和檢驗，當P<0.05時為有統計學意義。待測蛋白表達之間的相關性采用Spearman秩和相關檢驗，以r表示相關系數(以P<0.05，r>0.3定為有正相關性)。

結 果

1 NSCLC組織中Twist、Smad3、E-cadherin和Vimentin的表達 Twist、Smad3、Vimentin蛋白陽性著色定位于細胞質和細胞核內，呈棕黃色或深黃色顆粒樣(附圖A、B、D)；E-cadherin蛋白陽性著色定位于細胞膜(附圖C)。 癌組織Twist蛋白陽性率顯著高于癌旁組織(P<0.001)；癌組織Smad3蛋白陽性率顯著高于癌旁組織(P<0.001)；癌組織E-cadherin蛋白陽性率顯著低于癌旁組織(P<0.001)；癌組織Vimentin蛋白陽性率顯著高于癌旁組織(P<0.001)，見表1。

表1 Twist、Smad3、E-cadherin和Vimentin在NSCLC組織樣本中的表達 [n (%)]

2 Twist和Smad3在NSCLC中的表達相關性 Spearman相關分析結果顯示，Twist與Smad3表達呈正相關，在高、中、低分化中Twist與Smad3有很好的相關性(P值均<0.001，r值均>0.459)；Twist與Smad3在TNM I-II和III-IV分期中有很好的相關性(P值均<0.01，r值均>0.806),見表2。

附圖 Twist、Smad3、E-cadherin和Vimentin在NSCLC中的表達 (A：Twist 陽性表達；B：Smad3陽性表達；C：E-cadherin陽性表達；D：Vimentin陽性表達)

3 Smad3和E-cadherin、Vimentin在NSCLC中的表達相關性 Spearman相關分析結果顯示，Smad3與E-cadherin表達呈負相關，在高、中、低分化中Smad3與E-cadherin有很好的相關性(P值均<0.01，r值均<-0.335)；Smad3與E-cadherin在TNM I-II和III-IV分期中有很好的相關性(P值均<0.001，r值均<-0.471)，見表3。

Spearman相關分析結果顯示，Smad3與Vimentin表達呈正相關，在高、中、低分化中Smad3與Vimentin有很好的相關性(P值均<0.001，r值均>0.798)；Smad3與Vimentin在TNM I-II和III-IV分期中有很好的相關性(P值均<0.001，r值均>0.893)，見表3。

表2 Twist與Smad3在NSCLC中的表達相關性

表 3 Smad3與E-cadherin、Vimentin在NSCLC中的表達相關性

討 論

肺癌是目前國內外發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其中，NSCLC約占肺癌的85%左右[12]。腫瘤轉移是影響肺癌患者生存期短的最主要問題，但其轉移機制并不明確。只有深入研究肺癌的轉移機制，找到調控其轉移的關鍵靶基因，并對其進行有效的抑制，才能從根本上控制肺癌的轉移。

EMT是多細胞生物胚胎發育的基礎過程，也存在于多種慢性疾病的發病過程以及腫瘤形成中。其主要特征為：E-鈣黏素表達的下調、N-鈣黏素表達的上調；角蛋白為主的細胞骨架轉化為波形蛋白為主的細胞骨架；以及形態上由上皮細胞轉化為具有間充質特征的細胞等。這些特征使腫瘤細胞喪失細胞與細胞之間的連接，從而表現得更具侵襲性[13]。孫菊杰等[14]研究顯示，NSCLC中E-cadherin表達降低、Vimentin表達升高，二者的表達均與NSCLC的分化程度、淋巴結轉移及臨床病理分期密切相關，提示EMT發生于NSCLC發生發展及轉移密切相關。另外，還有其它學者研究表明EMT能夠參與腫瘤細胞的轉移[15]。由此，EMT現象在惡性腫瘤組織中的發生是引起腫瘤轉移的關鍵過程，但調控肺癌EMT發生的機制尚不清楚，急需深入研究。

Twist是近年來倍受關注的癌基因之一，參與EMT過程，使腫瘤細胞通過適應周圍基質環境獲得新的上皮特性，形成轉移病灶，且這種轉移灶中的腫瘤細胞遷移、增殖的活性較原發腫瘤更強，并出現抗腫瘤藥物的活性[16]。本研究發現，與正常肺組織相比，Twist、Smad3和Vimentin在NSCLC組織中的表達明顯增加，而E-cadherin表達明顯降低。陳鯤等[17]研究了NSCLC組織中Twist、E-cadherin和Vimentin的表達及其臨床意義，發現Twist蛋白在非小細胞肺癌組織及胸腔轉移灶中過度表達，可能通過分別上調和下調Vimentin、E-eadherin的表達促進NSCLC的浸潤和轉移。在Twist高表達的肺癌細胞系中，Vimentin和E-eadherin的比值明顯增高，且高表達Twist的肺癌細胞系的遷移能力也顯著增強[18]。另外，Twist在別的腫瘤組織及癌細胞中的表達可能也與EMT相關，如胃癌組織及細胞系[19]等。但是Twist通過何種分子調控肺癌EMT發生目前并不明確。

本研究相關分析結果顯示，Twist蛋白表達與Smad3在NSCLC組織中表達呈顯著正相關性，Smad3蛋白表達與Vimentin在NSCLC組織中表達呈顯著正相關性，而Smad3蛋白表達與E-cadherin在NSCLC中表達呈顯著負相關性。強烈提示Twist可能通過TGF-β/Smad3信號通路促進NSCLC中EMT的發生。此結論與之前報道的TGF-β/SMAD3信號通路可能是誘導EMT發生主要的分子信號通路結論相符合[7-8]。

綜上所述，本文采用免疫組化法初步探討了NSCLC中Twist調控EMT發生的分子機制，提出了Twist可能通過TGF-β/Smad3信號通路促進NSCLC中EMT的發生這一結論，為闡明NSCLC侵襲轉移的分子機制提供依據。

[1] Kang Y, Massagué J. Epithelial-mesenchymal transitions:twist in development and metastasis [J]. Cell, 2004, 118(3):277-279.

[2] Zhang H, Gong J, Kong D,etal. Anti-proliferition effects of Twist gene silencing in gastric cancer SGC7901 cells [J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(10):2926-36.

[3] Kwok WK, Ling MT, Lee TW,etal. Up-regulation of TWIST in prostate cancer and its implication as a therapeutic target [J]. Cancer Res, 2005, 65(12):5153-5162.

[4] Watanabe O, Imamura H, Shimizu T,etal. Expression of twist and wnt in human breast cancer [J]. Anticancer Res, 2004, 24(6):3851-3856.

[5] Yang J, Mani SA, Donaher JL,etal. Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis [J] .Cell, 2004, 117(7):927-939.

[6] Elias MC, Tozer KR, Silber JR,etal. TWIST is expressed in human gliomas and promotes invasion [J]. Neoplasia, 2005, 7(9):824-837.

[7] Yang H, Zhan L, Yang T,etal. Ski prevents TGF-beta-induced EMT and cell invasion by repressing SMAD-dependent signaling in non-small cell lung cancer [J]. Oncol Rep, 2015，34(1):87-94.

[8] Yi EY, Park SY, Jung SY,etal. Mitochondrial dysfunction induces EMT through the TGF-beta/Smad/Snail signaling pathway in Hep3B hepatocellular carcinoma cells [J]. Int J Oncol, 2015，47(5):1845-53.

[9] Rodriguez JA, Huerta-Yepez S, Law IK,etal. Diminished expression of CRHR2 in human colon cancer promotes tumor growth and EMT via persistent IL-6/Stat3 signaling [J]. Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2015, 1(6): 610-630.

[10] Rokavec M, Ner MG, Li H,etal. Corrigendum. IL-6R/STAT3/miR-34a feedback loop promotes EMT-mediated colorectal cancer invasion and metastasis [J]. J Clin Invest, 2015，125(3): 1362.

[11] Thiery JP, Sleeman JP. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal taansitions [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2006, 7(2):131-142.

[12] Jemal A, Bray F, Center MM,etal. Global cancer statistics [J]. Ca Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

[13] Savagner P. Leaving the neighborhood:molecular mechanisms involved during epithelial-mesenchymal transition [J] .Bioessays, 2001, 23(10):912 -923.

[14] 孫菊杰, 魏 玲, 張德賢, 等. 非小細胞肺癌Twist表達與EMT相關性分析[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2014, 21(16):1258-1261.

[15] Zhang H, Liu J, Yue D,etal. Clinical significance of E-cadherin, β-catentin, vimentin and S100A4 expression in completely resected squamous cell lung carcinoma [J]. J Clin Pathol, 2013, 66(11):937-945.

[16] Wang B,Lindley LE,Fernandez-Vega V,etal. The T box transcription factor TBX2 promotes epithelial-mesenchymal transition and invasion of normal and malignant breast epithelial cells [J]. PLoS One,2012,7(7):e41355-e41370.

[17] 陳 鯤, 李明珠, 李 淼, 等. Twist、E-cadherin和Vimentin在非小細胞肺癌中的表達及意義[J]. 遼寧大學學報, 2011, 38(3):235-240.

[18] Nakashima H, Hashimoto N, Aoyama D,etal. Involvement of the transcription factor twist in phenotype alteration through epithelial-mesenchymal transition in lung cancer cells [J]. Mol Carcinog, 2012, 51(5):400-410.

[19] 羅庚求, 文繼舫, 李景和, 等. Twist對胃癌細胞系MKN28遷移和侵襲能力的影響[J]. 中南大學學報, 2008, 33(2):174-178.

(收稿：2016-04-20)

Twist induces epithelial-mesenchymal transition in NSCLC by regulating the TGF-β/Smad3 signaling pathway Department of Thoracic Surgery,Tang Du Hospital of Foruth Military University(Xi’an710038)

Cui Kai Wang Wuping Sun Ying et al

Objective: To investigate the role of Twist which may induce EMT through TGF-β/Smad3 pathway in NSCLC, the expression of Twist, Smad3, E-cadherin and Vimentin molecules were detected and the correlations were discussed. Methods: Twist, Smad3, E-cadherin and Vimentin expressions in tumor tissues were assessed using immunohistochemical (IHC) methods in patients with resected NSCLC, and the correlation of Twist with Smad3, Smad3 with E-cadherin and Vimentin expression were analyzed. Results: The expression of Twist、Smad3、Vimentin were mainly located in cytoplasm and cell nucleus, and the expression of E-cadherin was mainly located on cell membrane. The positive expression rates of Twist, Smad3, E-cadherin and Vimentin protein in NSCLC were 72.3% (120/166), 71.1% (118/166), 54.2% (90/166), 69.9% (116/166), which were higher than corresponding adjacent non-cancerous tissue with statistical difference (P<0.001). The correlation of Twist with Smad3, Smad3 with E-cadherin and Vimentin were obvious in pathological grads and TNM stages groups in NSCLC. Conclusion: Twist may induce EMT in NSCLC by regulating the TGF-β/Smad3 signaling pathway.

Lung neoplasms/immunology @Twist genes Transforming growth factor beta Smad3 protein Stromal cells Cell line,transformed

肺腫瘤/免疫學 @Twist基因 轉化生長因子βSmad3蛋白 間質細胞 細胞系，轉化

R

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.007

△通訊作者