腫瘤干細胞在乙型肝炎病毒相關肝細胞癌中的研究進展

邱小鋒(綜述)　朱　榮 (審校)

(復旦大學基礎醫學院病理學系　上海　200032)

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腫瘤干細胞在乙型肝炎病毒相關肝細胞癌中的研究進展

邱小鋒(綜述)朱榮△(審校)

(復旦大學基礎醫學院病理學系上海200032)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種很常見的惡性腫瘤,流行病學和臨床病理學研究發現其多發生在肝臟原有病變的基礎上。在中國,長期慢性的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是HCC發生的主要危險因子。腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)理論認為HCC的起始細胞(tumor initial cell,TIC)是CSC,但其中的機制尚不明確,特別是CSC在HBV相關HCC 發生和發展中的作用。本文就腫瘤干細胞在HBV相關HCC發病中的機制及CSC標志物在臨床診療和預后評估等方面的最新研究進展作一總結。

腫瘤干細胞;肝細胞癌;乙型肝炎病毒

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一。2012年的統計數據顯示[1],全球肝癌發病率和腫瘤相關死亡率分別位列惡性腫瘤的第6位和第2位。在全球每年約782 500例新增肝癌病例及745 500例肝癌相關性死亡病例中,中國占據半數左右。從病理組織類型來看,絕大多數的肝癌為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。許多流行病學和臨床病理學的研究表明,誘導HCC發生的因素很多,包括嗜肝病毒感染、黃曲霉毒素等。由于HCC的病因不同,其臨床特點、治療手段和預后也有很大差異。而在我國,長期慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是HCC發生的主要危險因子之一。有數據表明在我國HBV流行區,80%～90%HCC患者均有感染HBV的慢性肝病史。HBV在HCC形成和發展中的作用,特別是其分子機制,是多年來研究的熱點。

傳統腫瘤理論認為腫瘤細胞來源于正常組織細胞的“去分化”(dedifferentiation),盡管腫瘤細胞具有異質性,但每個腫瘤細胞分裂的子代細胞都具有形成相同腫瘤的能力。然而,傳統理論并不能很好地解釋臨床中HCC高轉移性、術后的高復發性以及抗腫瘤化療藥物耐藥性等現象。新的腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)理論則認為腫瘤中存在少量具有無限增殖、自我復制和分化潛能的CSC,數量上占絕對少數的CSC決定了腫瘤的演進,故又稱腫瘤起始細胞(tumor initial cell,TIC)。越來越多的研究表明CSC在HCC形成、轉移及術后復發中起到重要作用,盡管這其中有關HBV相關HCC的報道有限,但仍然為HBV相關HCC的基礎研究和臨床診療提供了新的方向和路徑。

HBV相關HCC中常見的CSC標志物及其在組織和細胞中的表達目前常見的與HBV感染相關的特異性CSC標志物主要有EpCAM、CD133、CD90等。借助細胞免疫化學、流式細胞分選技術等可以尋找到HCC組織細胞上異常表達的標志物,通過臨床樣本分析和基礎研究確定潛在的CSC,為判斷預后和靶向治療的研究提供新的目標。

上皮細胞黏附分子上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是一種跨膜糖蛋白,可表達于肝干細胞和肝祖細胞的表面。EpCAM與細胞間的黏附作用相關,在上皮細胞癌變過程中發揮重要作用。Kimura等[2]研究發現,較丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)相關HCC或其他病因相關HCC,HBV相關HCC的癌組織中EpCAM表達量顯著增高。在EpCAM高表達水平組(EpCAM表達量>50%)中,患者血清AFP水平明顯增高。在HBV相關HCC發生過程中,EpCAM表達水平的變化可反映HBV慢性感染的疾病進程;高表達水平的EpCAM同時提示預后不良。EpCAM在監測慢性乙型肝炎患者HCC的發生,治療過程中腫瘤的耐藥性、復發與轉移等方面具有潛在的研究價值。

CD133CD133屬于人細胞膜蛋白超家族成員,結構與動物實驗模型中prominin-1蛋白質相似。CD133被證明表達于多種CSC表面,同時具有在分化細胞中表達下調的特征,因此成為常見的CSC標志物。Yin等[3]報道CD133陽性細胞存在于HCC細胞株與HCC患者肝癌組織中,具有TIC的部分特性,如集落形成能力、在免疫缺陷小鼠體內形成腫瘤的能力等,因而可將CD133作為HCC潛在的CSC標志物。Chan等[4]證實HCC病例中CD133能夠獨立反映HCC預后水平,在早期HCC的病例中(TNM分期Ⅰ期),CD133陽性患者整體存活期與無病生存期較陰性群體明顯縮短。而在HBV相關HCC病例中,CD133表達水平的改變與HBV在腫瘤發生、進展中的行為相關。對于HBV相關HCC患者,監測其肝癌組織中的CD133表達水平同樣有助于評估治療方案和預后水平。

CD90CD90/Thy1是一種糖蛋白,錨定于糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)羧基端,參與細胞-細胞或細胞-基質間相互作用。CD90在人T細胞、胸腺細胞、神經元和內皮細胞上廣泛表達,因此其在HBV相關HCC的檢測中特異性不高,單因素檢測不能確認肝癌組織中CD90陽性細胞為潛在的CSC,故CD90往往和其他干細胞標志物聯合使用。Yang等[5]認為篩選CD45陰性CD90陽性表型細胞群有助于從肝癌組織中分離出CSC,并且CD90表達量與HBV感染因素相關。Lu等[6]研究臨床HCC樣本發現,CD90高表達與HBV感染以及HCC組織病理學分級相關,同時反映預后不良。HBV感染使HCC癌組織CD90表達量上升的機制仍不明確,可能為HBV病毒轉錄復制過程中CD90表達量增高,或者HBV感染誘導CD90陽性干細胞形成肝癌。總之,對于CD90與HBV相關HCC中CSC的關系,還需做進一步的臨床分析和分子機制的研究,以明確其免疫分型的意義。

多種CSC標志物的共表達研究發現CSC往往存在標志物共表達的現象,即來源相同的CSC可能同時表達多種標志物,并且這些標志物的表達在特定情況下存在關聯性。Chen等[7]研究發現CD133陽性EpCAM陽性的Huh7亞群細胞具有更強的富集能力、分化潛能、集落形成能力、化療藥物耐藥性、成瘤能力和小鼠致瘤性等特征。因而,CD133與EpCAM共表達可用于篩選HBV相關HCC組織中潛在的CSC、分析其耐藥性及作為臨床藥物作用的分子靶點。這一表型的CSC在HBV相關HCC中不具有普遍性,提示該表型與惡性潛能和惡性程度高度相關。Yamashita等[8]發現CD90與EpCAM在肝癌中相互獨立表達,EpCAM陽性CSC具有上皮細胞特征,而CD90陽性細胞具有血管內皮細胞特征。在體外共表達時,CD90能夠通過激活TGF-β信號通路增強EpCAM陽性細胞遷移能力,使得CD90和EpCAM雙陽性細胞表現出較高的侵襲能力,兩者的共表達提示預后更差。Liu等[9]檢測了2 897例臨床HCC樣本中EpCAM、CD133、CD90、CD44等CSC標志物,發現這些標志物表達水平與腫瘤分期、HBV感染、AFP水平等因素相關。但在處于不同病程階段的HCC活檢樣本中,各種CSC標志物單獨表達,難以尋找到臨床有效的CSC標志物;而綜合檢測分析EpCAM、CD133、CD90、CD44等共同表達水平,將有助于尋找更為合適的CSC表型。對于CSC標志物表達的多因素分析,有助于彌補單因素分析HBV相關HCC的不足。

HBV相關HCC中CSC的來源CSC理論認為CSC具有自我復制、分化潛能以及較強的耐藥性等特點。Liu等[10]認為,在HBV相關HCC中,CSC并無明確的來源,可源于造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSC)或間質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC),前者表面標志物為CD133,而后者表面標志物為CD90或CD44,兩者均可分化為多能干細胞(pluripotent stem cell,PSC)。PSC可分化為肝前體細胞/卵圓細胞,并在前體細胞表達OV6、EpCAM。PSC及肝前體細胞因“成熟受阻(maturation arrest)”機制可誘變為CSC,導致肝癌發生(hepatocarcinogenesis)。

Yeh等[11]也發現,HBV相關HCC肝癌組織樣本中,CD133表達水平與HBsAg表達水平呈負相關,提示CSC更可能來源于“成熟受阻”的肝干細胞,而非感染病毒后“去分化”的肝細胞。因此,在HBV相關HCC臨床樣本中,能夠檢測到多種CSC標志物。對CSC標志物表達水平進行動態分析,有助于闡明肝癌發生過程中CSC生物學特性的變化,并能夠解釋標志物表達水平改變的臨床意義。

HBV相關HCC中CSC的抗凋亡途徑和耐藥機制在HBV相關HCC中,CSC抗凋亡途徑往往與肝干細胞發育相關的細胞信號轉導通路相關。編碼EpCAM的基因存在于Wnt/β-catenin通路中,調控肝干細胞的增生。Arzumanyan等[12]研究發現,HBV產生的HBx蛋白質能夠激活β-catenin信號通路并上調miR-181的表達,這兩者最終均能增加EpCAM的表達。Shen等[13]研究發現HBx具有穩定β-catenin的作用,從而激活Wnt/β-catenin通路,抑制CSC凋亡。Studach等[14]發現在HBV相關HCC發生過程中,SUZ12/PRC2的負向調節基因明顯活化,SUZ12的表達下調,使得EpCAM表達水平顯著升高。Fan 等[15]則進一步闡明了HBV相關HCC中HBx依賴的RelA半位點位于EpCAM轉錄起始位點(transcriptional start site,TSS)下游的CpG島上。HBV復制導致NF-κB/RelA側翼CpG中二核苷酸去甲基化,EpCAM的基因沉默機制受到抑制,從而介導EpCAM的表達。NF-κB的激活同時能夠增加感染HBV細胞免疫逃逸的機會。HBV感染還能異常激活肝干細胞發育相關的信號通路,伴隨此過程中多種產物的異常表達,CSC的抗凋亡作用增強。

CSC在體內或體外實驗中均被證明存在耐藥性,包括獲得性耐藥機制與固有耐藥機制。獲得性耐藥指CSC在接受抗腫瘤藥物刺激后,通過改變細胞信號轉導通路而抑制凋亡的機制;而固有耐藥機制指CSC對于部分抗腫瘤藥物的天然不敏感現象。固有耐藥機制與獲得性耐藥機制均可增強腫瘤干細胞的耐藥性,并在腫瘤抵抗化療藥物、術后復發等方面發揮重要作用。兩種耐藥機制可以共同存在于CSC中,令臨床治療HBV相關HCC更為棘手。CD133分子亦被證明參與CSC耐藥性機制。Ma等[16]發現CD133陽性腫瘤干細胞可優先激活Akt/PKB通路并表達Bcl-2抗凋亡蛋白。Akt/PKB位于多條細胞信號通路的交界點,能夠調節多種生長因子的表達和Ras癌基因的活化,從而使得CD133陽性表型的CSC表現出惡性腫瘤轉變的潛質。而Bcl-2抗凋亡蛋白的表達有助于CSC抵抗凋亡,逃避抗腫瘤藥物治療,獲得耐藥性,并在肝癌的復發中發揮重要作用。肝癌的耐藥性亦可能來源于肝癌干細胞對化療藥物的主動外排機制。依據能將熒光底物Hoechst 33342泵出細胞外的特性,可從肝癌組織中分離出特定的側群(side population,SP)細胞。臨床上HCC活檢發現SP細胞在癌組織中富集,對于部分抗腫瘤藥物具有主動排出胞外的能力,從而對于化療藥物存在抵抗性。Jia等[17]在CD90陽性CD133陽性HBV相關HCC細胞株中發現Oct4和ABCG2顯著高表達,Oct4被證明與干細胞自我更新與分化潛能相關[18],而ABCG2膜轉運蛋白與腫瘤干細胞主動外排耐藥性機制相關。

CSC與HBV相關HCC的分子靶向治療分子靶向治療旨在針對HCC內在異常存在的信號轉導分子或產物蛋白,靶向攻擊“非己”細胞,實施針對腫瘤細胞的打擊,用以彌補目前臨床治療的缺陷。由于CSC存在耐藥機制,致使HBV相關HCC對于多種化療藥物存在耐藥性,而臨床手術切除亦存在轉移復發風險。常見的HCC分子靶向藥物包括酪氨酸激酶抑制劑和單克隆抗體等。索拉菲尼是目前為數不多的運用較廣泛的肝細胞癌靶向治療藥物,通過抑制多種重要激酶,直接抑制CSC的增殖;同時通過抑制血管新生間接抑制腫瘤干細胞的生長[19],從而具有多種抗肝癌效應,可應用于晚期HCC患者的治療中。索拉菲尼對于HBV相關HCC尚無特異性改變的報道。治療HBV相關HCC的單克隆抗體報道較少,源于內在的分子機制尚未完全闡明。卡妥索單抗(catumaxomab)是EpCAM及CD3抗體,可用于治療進展期卵巢癌、惡性腹水等[20],鑒于其靶向針對EpCAM的能力,為治療HBV相關HCC提供了新的研究思路。

結語CSC理論能夠較好地解釋HBV相關HCC的發生、轉移和術后復發等諸多問題,并為臨床診斷、預后評估和各種治療提供新的靶位,CSC在HBV相關HCC的診療具有廣闊的應用前景。然而,目前的研究仍存在諸多不足之處,比如對于CSC與HBV相關HCC的研究多停留在相關性分析層面,分子機制的研究相對缺乏;標志物的確定仍缺乏共識;有效抑制耐藥性的途徑尚未發現;潛在的分子靶向治療位點的臨床數據不足。越來越多的基礎研究和臨床實驗正在進行中,新的研究進展將會逐步完善CSC理論,并為HBV相關HCC患者帶來實質性益處。

[1]TORRE LA,BRAY F,SIEGEL RL,et al.Global cancer statistics,2012 [J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2]KIMURA O,KONDO Y,KOGURE T,et al.Expression of EpCAM increases in the hepatitis B related and the treatment-resistant hepatocellular carcinoma [J].Biomed Res Int,2014,2014:172913.

[3]YIN S,LI J,HU C,et al.CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity [J].Int J Cancer,2007,120(7):1444-1450.

[4]CHAN AW,TONG JH,CHAN SL,et al.Expression of stemness markers (CD133 and EpCAM) in prognostication of hepatocellular carcinoma [J].Histopathology,2014,64(7):935-950.

[5]YANG ZF,HO DW,NG MN,et al.Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer [J].Cancer Cell,2008,13(2):153-166.

[6]LU J W,CHANG JG,YEH KT,et al.Overexpression of Thy1/CD90 in human hepatocellular carcinoma is associated with HBV infection and poor prognosis [J].Acta Histochem,2011,113(8):833-838.

[7]CHEN Y,YU D,ZHANG H,et al.CD133+ EpCAM+ phenotype possesses more characteristics of tumor initiating cells in hepatocellular carcinoma Huh7 cells[J].Int J Biol Sci,2012,8(7):992-1004.

[8]YAMASHITA T,HONDA M,NAKAMOTO Y,et al.Discrete nature of EpCAM+ and CD90+ cancer stem cells in human hepatocellular carcinoma [J].Hepatology,2013,57(4):1484-1497.

[9]LIU R,SHEN Y,NAN K,et al.Association between expression of cancer stem cell markers and poor differentiation of hepatocellular carcinoma:A meta-analysis (PRISMA) [J].Medicine,2015,94(31):e1306.

[10]LIU LL,FU D,MA Y,et al.The power and the promise of liver cancer stem cell markers [J].Stem Cells Dev,2011,20(12):2023-2030.

[11]YEH CT,KUO CJ,LAI MW,et al.CD133-positive hepatocellular carcinoma in an area endemic for hepatitis B virus infection [J].BMC Cancer,2009,9:324.

[12]ARZUMANYAN A,FRIEDMAN T,NG IO,et al.Does the hepatitis B antigen HBx promote the appearance of liver cancer stem cells? [J].Cancer Res,2011,71(10):3701-3708.

[13]SHEN L,ZHANG X,HU D,et al.Hepatitis B virus X (HBx) plays an anti-apoptosis role in hepatic progenitor cells by activating Wnt/β-catenin pathway [J].Mol Cell Biochem,2013,383(1-2):213-222.

[14]STUDACH LL,MENNE S,CAIRO S,et al.Subset of Suz12/PRC2 target genes is activated during hepatitis B virus replication and liver carcinogenesis associated with HBV X protein [J].Hepatology,2012,56(4):1240-1251.

[15]FAN H,ZHANG H,PASCUZZI PE,et al.Hepatitis B virus X protein induces EpCAM expression via active DNA demethylation directed by RelA in complex with EZH2 and TET2 [J].Oncogene,2016,35(6):715-726.

[16]MA S,LEE TK,ZHENG BJ,et al.CD133+ HCC cancer stem cells confer chemoresistance by preferential expression of the Akt/PKB survival pathway [J].Oncogene,2008,27(12):1749-1758.

[17]JIA Q,ZHANG X,DENG T,et al.Positive correlation of Oct4 and ABCG2 to chemotherapeutic resistance in CD90+ CD133+ liver cancer stem cells [J].Cell Reprogram,2013,15(2):143-150.

[18]YIN X,LI YW,ZHANG BH,et al.Coexpression of stemness factors Oct4 and Nanog predict liver resection [J].Ann Surg Oncol,2012,19(9):2877-2887.

[19]魯光平,潘驥群,邵柏,等. 肝細胞癌分子靶向治療現況與展望[J].現代腫瘤醫學,2013,21(1):208-212.

[20]SIMON M,STEFAN N,PLüCKTHUN A,et al.Epithelial cell adhesion molecule-targeted drug delivery for cancer therapy [J].Expert Opin Drug Deliv,2013,10(4):451-468.

E-mail:zhurongss@fudan.edu.cn

Research progress on the association of cancer stem cells with HBV-related hepatocellular carcinoma

QIU Xiao-feng, ZHU Rong△

(Department of Pathology,School of Basic Medical Sciences,Fudan University,Shanghai 200032,China)

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignant tumors worldwide.Epidemiological and clinicopathological analyses indicated that HCC mostly occurred on previous liver diseases,of which chronic infection of hepatitis B virus (HBV) was the main risk factor in China.The cancer stem cell (CSC) theory believed that CSCs were tumor initial cells (TICs) of HCC.So far,the association of CSCs with HBV-related HCC,especially their roles in the development and progression of HCC,has not been illustrated clearly.This review focused on the recent progress in the mechanisms of CSCs in HBV-related hepatocarcinogenesis,as well as the biomarkers of CSCs in clinical diagnosis,treatment and prognosis analyses.

cancer stem cell;hepatocellular carcinoma;hepatitis B virus

R735.7

Bdoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.05.017

2015-10-21;編輯:段佳)

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China for Talent Training (J1210041).

國家自然科學基金人才培養項目(J1210041)