胞外信號調節激酶促進DNA損傷反應的作用機制

魏鳳香　張蕾　王紹娟

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胞外信號調節激酶促進DNA損傷反應的作用機制

魏鳳香1，3張蕾1王紹娟2★

［摘要］機體在長期進化中擁有一整套DNA損傷反應（DNA damage response，DDR）系統來保證基因組的完整性，其中最重要的就是通過激活檢驗點以阻止細胞周期進程，并修復損傷的DNA。細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路是經典的細胞信號轉導通路，具有調節細胞增殖、分化、凋亡等多種功能，二者的功能性聯系都能調節細胞增殖。本綜述旨在闡述ERK激酶在DNA損傷反應中的作用。

［關鍵詞］DNA損傷反應（DDR）；胞外信號調節激酶（ERK1/2）；細胞周期阻滯；ATM；ATR

★通訊作者：王紹娟，E-mail：lgwsj@hotmail.com

DNA是大而復雜的整體，它在細胞內外各種因素的作用下不斷產生損傷。DNA損傷反應（DNA damage response，DDR）可通過識別DNA損傷、激活檢驗點以阻斷細胞周期進程，從而修復損傷的DNA，確保遺傳物質準確地傳遞給子細胞提供時間，這是機體維持基因組穩定性的基礎［1］。所有真核生物中，DNA損傷反應集中于一對相關的蛋白激酶：ATM（ataxia-telangiectasia mutated）和ATR（ATM-and Rad3-related）。DNA損傷可激活ATM激酶，后者磷酸化其下游的反應元件使細胞周期阻滯。包括激活檢驗點激酶2（checkpoint kinases 2，CHK2）和上調蛋白 p21CIP1。p21CIP1是CDK（cyclin-dependent kinases，CDK）的一種抑制劑［2］。CHK2隨后使CDC25C失活，CDC25C的活性是激活CDK1和CDK2所必需的［3］。活化ATM 和ATR，激活檢驗點，阻滯細胞周期進行。

細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen -activated protein kinase，MAPK）通路是經典的細胞信號轉導通路，具有調節細胞增殖、分化、凋亡等多種功能。最新的研究發現通常在癌細胞中過表達并促進細胞增殖的ERK激酶，在DNA損傷反應中有重要作用［4］。本文簡要闡述ATM/ATR介導的DNA損傷反應，ERK信號通路，以及ERK在DNA損傷反應中的作用。

1　ATM、ATR處于DNA損傷反應的核心

DNA損傷反應是維持真核細胞基因組完整性與保證遺傳信息準確傳遞的重要監督機制。ATM、ATR同屬于PIKK家族［1］，是DNA損傷檢查點的主要成員，它們被不同類型的DNA損傷所激活。

普遍的觀點認為，ATM主要被DNA雙鏈斷裂所激活，對雙鏈斷裂的ATM反應依賴于3個蛋白的三聚體復合物：Mre11、Rad50和Nbs1（MRN復合物），雙鏈斷裂立即在該處快速組裝，并幫助將2個末端連接在一起。ATM與MRN復合物中的Nbs1亞單位相互作用，這不僅能將ATM招募到損傷位點處，也能使ATM從無活性的二聚體轉變為有激酶活性的單體形式［5-6］。但最近也有研究顯示，ATM的激活在沒有DNA的情況下，ATP能夠使ATM二聚體發生分子間自磷酸化（S1981位點）［7］，導致二聚體的分開，從而引起ATM的激活。最近發現了ATM發生自磷酸化的新位點：Ser367和Ser1893［8］。ATM的這種自磷酸化對其自身的激活可能是必需的。活化的ATM通過磷酸化它的靶蛋白來啟動損傷反應。

而ATR能被很多不同形式的DNA損傷所激活，包括核苷酸損傷、復制叉停滯、雙鏈斷裂等，這是因為ATR能特定識別單鏈DNA區域，且在對損傷位點處理過程中單鏈DNA的產生對于反應是必需的［9］。ATR招募到單鏈DNA上可能需要通過與包被在單鏈DNA上的單鏈結合蛋白RPA相互作用。ATR與單鏈DNA和RPA復合物的相互作用部分依賴于RPA直接結合到與ATR相結合的接頭蛋白亞單位ATRIP。帶有ATRIP突變的細胞與ATR突變的細胞有相同的損傷反應缺陷，這表明ATRIP在ATR功能上的核心作用［10］。除了ATR-ATRIP復合物與包被在單鏈DNA上的RPA的結合是激活ATR所必需的以外，9-1-1復合物也是ATR介導的DNA損傷反應所必需的［11］。9-1-1復合物與DNA的結合依賴于另一個大復合物RAD17-RFC，它為9-1-1復合物裝載到損傷DNA上所必需。9-1-1復合物與ATR-ATRIP被獨立地招募到DNA損傷位點，隨后9-1-1復合物招募TOPBP1，TOPBP1能通過與ATR和ATRIP亞基結合而激活ATR［12］。活性ATR能通過磷酸化一系列下游靶蛋白使細胞周期進程阻滯于S期并起始DNA損傷修復，包括磷酸化位于組蛋白H2AX尾部的SQE序列的S139、p53 S15和CHK1的S345［13］。

2　ERK激酶在DNA損傷反應中的作用

2.1ERK MAP激酶

ERK1/2屬于MAPK家族，是Ras/Raf/MEK/ ERK信號通路的重要成分。活化的ERK激酶在多種信號轉導通路包括細胞增殖、分化和凋亡的通路中發揮作用。MEK1/2酶通過磷酸化Thr-Glu-Tyr位點的Thr183和Tyr185來激活ERK酶［14］。許多對于細胞的刺激，例如能激活一些轉錄因子及其它一些與細胞增殖、分化、細胞周期調節和細胞存活有關的絲/蘇氨酸激酶的刺激，都能激活ERK1/ERK2。ERK1和ERK2是脯氨酸定向激酶，活化的ERK1/ ERK2將磷酸化底物蛋白中一個脯氨酸引導的基團內的絲氨酸或蘇氨酸殘基，S/T-P是ERK1/ERK2進行底物識別的最嚴格的一致序列。許多ERK底物蛋白包含1～2個與ERK結合的位點，通過這些位點與ERK結合后能促進底物蛋白的磷酸化，這些位點包括DEJL（結合ERK、JNK和LXL的部位）和DEF（結合ERK、FXFP的部位）。它們的一致序列是（R/K）2X2-6（I/L）X（I/L）（X指任何殘基）［15］。

2.2ERK激酶在DNA損傷反應中發揮作用

DNA損傷反應與細胞分裂緊密聯系。ATM或ATR的激活導致蛋白激酶Chk1和Chk2的活化，Chk1和Chk2對Cdc25磷酸酶家族的3個成員有復雜的抑制效應，因而Cdk1-cyclingB1的活性被阻斷，阻止了有絲分裂的進入。抑制Cdk的活性或阻滯細胞分裂是ATM或ATR激酶誘導的最終結果。但最新研究表明，細胞分裂也能參與DNA損傷反應。Cdk的活性能促進DNA損傷誘導的ATM或ATR的激活［16］。這能夠給相對于正常組織細胞惡性腫瘤細胞對基因毒性試劑更加敏感提供部分解釋。

大量研究表明PIKKs的激活受特定的DNA序列和蛋白所調控，如NBS1對ATM的激活是必需的，TOPBP1對ATR的激活是必需的［17］。但是，DNA損傷反應中ATM與ATR的激活機制仍是未知的。因此可根據現有的研究設想DNA損傷誘導ERK激酶激活，ERK激酶再促進ATM和ATR的活化。

有報道稱順鉑能強烈誘導卵巢癌細胞A2780 中ERK的活化，使用ERK活性抑制劑PD98059減少了順鉑誘導的p53 S15的磷酸化［18］。使用U0126抑制ERK活性減少了H9c2細胞中阿霉素誘導的p53 S15的磷酸化［19］。因S15不直接連接在脯氨酸之后，故ERK1/2不能直接磷酸化p53 S15。S15連接在QE之后，而S/TQE序列是ATM 和ATR的磷酸化位點，所以DNA損傷反應中的p53 S15是被ATM和ATR磷酸化激活的。由此推斷，ERK激酶是通過促進ATM和ATR的激活進而增強p53 S15的磷酸化的。有類似的報道支持上述假設，在U87細胞中使用MEK抑制劑PD184352抑制ERK活性后，IR誘導ATM的S1981磷酸化形成的核焦點顯著減少［20］。類似的觀察結果也在MCF7細胞中發現，U0126減弱了IR誘導的ATR及ATR的下游靶酶包括CHK1的活化、CDC25和CDC2的失活［21］。考慮到ERK1/2作為MEK的主要靶酶，本課題組研究證實了敲除ERK1或ERK2能顯著減弱ETOP誘導的ATM的激活（ATM S1981的磷酸化及磷酸化的ATM的核焦點），同時也減弱了ATM的底物的磷酸化，包括rH2AX的S139，p53 S15和CHK2的T68。CHK2通過磷酸化CDC25C的S216使CDC25C失活從而導致G2/M阻滯，敲除ERK1或ERK2能顯著減弱MCF7細胞中ETOP誘導的CD25C S216的磷酸化并減弱ETOP誘導的G2/M檢驗點的阻滯［22］。

總之，DNA損傷反應、ERK1和ERK2都能參與調控細胞增殖。ERK不僅能促進細胞周期進程，也能通過依賴或不依賴于p53的機制、或處于ATM和ATR的下游、或促進ATM和ATR的活性來參與調控DNA損傷反應。

2.3ERK激酶調控DNA損傷反應具有細胞類型依賴性

ERK通路一般情況下主要由生長因子激活，但觀察到當細胞受到各種基因毒性刺激（包括電離輻射、紫外線損傷、阿霉素、羥基脲、絲裂霉素C等）時，ERK也能被激活［23］。ERK激酶調控的檢驗點激活具有細胞類型依賴性。用MEK抑制劑（PD98059和U0126）和MEK1K97M能抑制ERK的活性，這能減弱許多細胞系中包括NIH3T3、MCF7、MEF和HCT116中依托泊苷和羥基脲誘導的G2/M和S期阻滯［23］。與此一致，敲除ERK1或ERK2基因也能減弱MCF7細胞中依托泊苷和羥基脲誘導的G2/M或S期阻滯［24］。相反，使用活性誘變劑MEK1Q56P能增強ERK1/2的活性，這能使HU誘導的S期檢驗點的激活更加敏感［25］。在果蠅細胞中發生的電離輻射誘導的檢驗點激活的內在原因是由于MEK-ERK通路的作用［26］。在足突狀細胞中，cyb-9能誘導DNA損傷、細胞周期阻滯以及ERK的激活，抑制ERK活性能減弱細胞周期的阻滯［27］。在神經細胞中，MCC能激活ERK，這促進了MCC誘導的細胞凋亡［28］。同樣，活性ERK也能促進NIH3T3細胞中ETOP誘導的細胞凋亡［23］，也能促進Hela細胞中順鉑誘導的細胞凋亡［29］，以及人的惡性膠質瘤T98G細胞中順鉑和UN誘導的細胞凋亡［30］。但是，也有報道稱活性ERK抑制骨髓瘤細胞和白血病細胞中DNA損傷誘導的凋亡。在人的多種骨髓瘤細胞中，CHK1的抑制劑能誘導DNA損傷，同時激活ERK。抑制ERK的活性使MM細胞中Chk1的抑制劑UCN-01誘導的DNA損傷及凋亡更敏感［31］。同樣，在急性粒細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）、NB4和HL60細胞中由阿糖胞苷誘導的DNA損傷中均有類似的報道［32］。此外，對于DNA損傷誘導的細胞周期阻滯后的細胞周期重啟，活性ERK也有作用。KSR1是促進MEK調控ERK激活的一種支架蛋白，它在MMC誘導的ERK的激活中是必需的，去掉KSR1蛋白后使細胞在經歷DNA損傷后不能重新進入細胞周期［33］。活性ERK調節HeLa細胞中阿霉素和ETOP誘導的葡萄糖轉移酶3的上調［34］，也在電離輻射誘導的NF-κB的激活中發揮作用［35］。總之，大量研究結果證明ERK激酶在DNA損傷反應中發揮重要作用。

雖然損傷DNA誘導ERK激活的機制仍不清楚，但大量證據顯示MEK激酶在DNA損傷反應中調控ERK激酶的活性，因為用MEK抑制劑（PD98059，U0126）、MEK siRNA抑制MEK活性后，能抑制各種基因毒試劑誘導的ERK的激活。然而，DNA損傷是否是通過Raf來激活MEK還有待研究。MMC在野生型而不是p53缺陷型MEFs中激活ERK，而ETOP在野生型和p53缺陷型MEFs中均誘導ERK激活。另外，順鉑和紫外線都能在缺乏功能性p53的人惡性膠質瘤T98G細胞中強烈激活ERK。因此，雖然在一定情況下p53可能對DNA損傷誘導ERK的激活有作用，但p53的功能在DNA損傷誘導的ERK的激活中可能不是必需的。這能解釋至少一半的癌癥患者表達突變型p53。ATM是電離輻射誘導DNA損傷反應的上游激酶，與此一致，有研究稱U87細胞中電離輻射誘導的ERK的激活部分由ATM調控。類似的觀察結果也可從光解誘導的雙鏈損傷中獲得。

3　展望

近年來開展的大量研究都證實了MEK/ERK激酶促進DNA損傷反應，然而對于DNA損傷信號是如何激活ATM和ATR的機制仍然是未知的，故對于DNA損傷信號如何激活ERK激酶的機制也是未知的。但是，基于大量研究表明ERK激酶在DNA損傷反應中起重要作用，闡明ERK激酶對DNA損傷反應的生理作用將把ERK-DDR的相關研究推進到一個新的水平。因為MEK/ERK激酶能促進ATM和ATR的激活，這增加了ERK激酶在DNA損傷反應調控中的重要性，因此需要闡明該潛在機制。使用特異性抑制劑阻斷MEK的活性，使DNA損傷誘導的ATM和ATR的激活減弱，這說明ERK激酶促進ATM和ATR的激活。那么ERK是直接磷酸化ATM/ATR嗎？還是磷酸化ATM/ATR活化所需的其它成分？這些磷酸化在ATM/ATR的活化中有作用嗎？這些問題都有待解決。

本課題組研究發現HU強烈誘導ATR的S428磷酸化，且在敲除ERK1和ERK2基因后此事件顯著減弱。磷酸化S428的酶和此事件對ATR功能的影響均是未知的。S428直接位于脯氨酸之后，此位點能與ERK激酶的特異性底物匹配。此外，ERK激酶在DNA損傷調控中的生理相關性將進一步在基因敲除的小鼠中進行檢測。

雖然化療藥物通常能誘導DNA損傷，ERK途徑的小分子抑制劑也被積極探索用于癌癥治療。聯合使用基因毒性藥物和ERK激酶抑制劑用于治療癌癥的想法還需要謹慎考慮。因為ERK促進DNA損傷反應，可以設想上述聯合療法可能引起DNA損傷的積累。這將增強化療藥物的遺傳毒性效應的敏感性。然而，另一方面，抑制ERK激酶的活性可能會使檢驗點的激活減弱因此使有DNA損傷的細胞增殖。這可能會導致突變并形成二級癌癥。因此，更好的了解ERK激酶在DNA損傷反應中的作用，將為優化這種聯合療法做好準備。

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The mechanism of ERK1/2 kinases facilitate DNA damage response

WEI Fengxiang1，3，ZHANG Lei1，WANG Shaojuan2★
（1.The Genetics Laboratory，Longgang District Maternity and Child Healthcare Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518172；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Longgang District Renmin Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518172；3.Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou，China，563003）

［ABSTRACT］The DNA damage response（DDR）helps to maintain genome integrity，and a critical event in this process is the prevention of cell division by activating the checkpoint until the DNA lesions can be repaired.The extracellular signal-regulated kinase（ERK）/mitogen-activated protein kinase（MAPK）pathway is a classic pathway for signal transduction and possesses multiple functions in regulating cellular proliferation，differentiation，and apoptosis.The functional connection between the DDR and ERK is the regulation of cell proliferation.This review aims to describe our current understanding of the function of ERK kinases in DDR.

［KEY WORDS］DNA damage response（DDR）；Extracellular signal-regulated kinases（ERK1/2）；Cell cycle arrest；ATM；ATR

基金項目：國家自然科學基金（81201568）；深圳市海外高層次人才創新創業項目（KQCX20120814150420241）；深圳市科技計劃重點項目（201201009）

作者單位：1.深圳市龍崗區婦幼保健院中心實驗室，廣東，深圳518172 2.深圳市龍崗區人民醫院婦產科，廣東，廣州518172 3.遵義醫學院，貴州，遵義563003