刺五加水提取物的抗氧化活性研究

田松陽,于成龍,徐 微,4,*,陳鐵云,孫 擎,王君妍,李 妍

(1.哈爾濱學院工學院食品科學與工程系,黑龍江哈爾濱 150086;2.黑龍江職業學院,黑龍江哈爾濱 150080;3.東北林業大學野生動物資源學院,黑龍江哈爾濱 150040;4.乳品科學教育部重點實驗室,東北農業大學,黑龍江哈爾濱 150030)

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刺五加水提取物的抗氧化活性研究

田松陽1,于成龍2,3,+,徐 微1,4,*,陳鐵云1,孫 擎1,王君妍2,李 妍1

(1.哈爾濱學院工學院食品科學與工程系,黑龍江哈爾濱 150086;2.黑龍江職業學院,黑龍江哈爾濱 150080;3.東北林業大學野生動物資源學院,黑龍江哈爾濱 150040;4.乳品科學教育部重點實驗室,東北農業大學,黑龍江哈爾濱 150030)

采用熱水浸提法對刺五加中水溶性成分進行提取,以浸提液對DPPH自由基的清除率為評價指標,研究了浸提溫度、浸提時間、料液比、浸提次數對其抗氧化活性的影響,從而確定最佳提取條件。正交實驗結果表明,在浸提溫度為70 ℃、提取時間110 min、料液比1∶80(g/mL),提取次數為2次的條件下,浸提液對DPPH自由基的清除率可達69.14%。此外,將最佳條件下獲得的刺五加水提取物的清除DPPH自由基、O2-·自由基和·OH自由基能力與維生素C進行對比分析。結果表明,浸提液對 O2-·自由基的清除能力顯著低于維生素C(p<0.05),其清除率為31.69%;而浸提液對超氧陰離子和羥自由基的清除率均顯著高于維生素C(p<0.05),其中對羥自由基的清除率達到76.03%。

刺五加,提取,抗氧化性質,自由基

刺五加(AcanthopanaxsenticocusHarms)是多年生木本植物,屬傘形目五加科植物。主要分布在我國黑龍江、吉林、遼寧和河北等地,是我國東北地區典型的藥用植物,它也是經國家衛生部批準頒布的藥食同源中藥之一。刺五加中含有豐富的生物活性成分,如刺五加多糖、刺五加總皂苷、β-谷甾醇、胡蘿卜苷和紫丁香樹脂醇苷等,其中部分活性物質具有營養保健作用。中醫和本草綱目認為,刺五加具有益氣健脾和補腎安神的功效[1]。大量研究也證實了,它能有效治療心臟病、高血壓、風濕病和糖尿病等多種疾病[2-4],此外,它還具有較強的免疫活性,能促進T細胞、B細胞、NK細胞等免疫細胞對細胞因子的分泌[5-6]。而近些年研究人員發現,刺五加存在一定的抗氧化活性和抗腫瘤作用[7-9]。因此,對刺五加生物活性成分的抗氧化能力探究成為近些年的主要研究內容。

目前,刺五加有效成分的提取方法有微波法、超聲波法、超臨界二氧化碳萃取法、有機溶劑法等。但在提取過程中,這些方法可能會對有效成分的活性產生一定影響,因此,本研究采用熱水浸提法提取刺五加的有效成分,并以其清除DPPH自由基的能力為指標,通過正交實驗優化提取工藝,并配以維生素C作為對照,研究其超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力,為刺五加的進一步開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺五加 黑龍江省中藥聯營總公司批發四部;DPPH Sigma公司;無水乙醇 天津市永大化學試劑有限公司;番紅 北京中生瑞泰科技有限公司;鄰苯三酚 上海展云化工有限公司;抗壞血酸 深圳安泰生物科技有限公司,等;所有試劑均為分析純。

T6型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;FA224型電子分析天平 上海?？惦娮觾x器廠;DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;FK-A型組織搗碎機 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;Alpha 1-4 中型凍干機真空冷凍干燥機 德國Matin Christ;202A-F型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司,等。

1.2 實驗方法

1.2.1 有效成分的提取 將刺五加洗凈,烘干至恒重后粉碎,過20目篩子。根據反應條件,準確稱取刺五加粉末,加入蒸餾水,用勻漿機進行處理得到勻漿液。采用熱水浸提法對刺五加的有效成分進行提取,提取液凍干備用。

1.2.2 單因素實驗設計

1.2.2.1 浸提溫度對DPPH自由基清除率的影響 在料液比為1∶40(g/mL),浸提時間為120 min,提取次數為1次的浸提條件下,研究浸提溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)對DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.2 浸提時間對DPPH自由基清除率的影響 在料液比為1∶40(g/mL),浸提溫度為70 ℃,提取次數為1次的浸提條件下,研究浸提時間(30、60、90、120、150 min)對DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.3 料液比對DPPH自由基清除率的影響 在浸提溫度為70 ℃,浸提時間為90 min,提取次數為1次的浸提條件下,研究料液比(1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100)(g/mL)對DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.4 浸提次數對DPPH自由基清除率的影響 在浸提溫度為70 ℃,浸提時間為90 min,料液比為1∶60(g/mL)的條件下,研究提取次數(1、2和3次)對DPPH自由基清除率的影響。

1.2.3 正交實驗設計 在單因素實驗的基礎上,固定提取次數為2次,選擇提取溫度、提取時間以及料液比三個因素,以提取物對DPPH自由基的清除率為指標,設計四因素三水平正交實驗,正交實驗表L9(34)如表1所示。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.2.4 提取物抗氧化性質的評價 通過測定提取物對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除能力,來評價提取物的抗氧化性質。本研究以濃度為0.1 mg/mL維生素C作為對照。

1.2.4.1 提取物對DPPH自由基的清除能力的測定 通過測定刺五加提取物的DPPH自由基清除率可以評定其抗氧化活性。采用Nsimba R Y等[10]和Shimada K等[11]的方法,并作適當修改。配制終濃度為20 μmol/L的DPPH無水乙醇溶液,提取物的凍干粉配制成濃度為0.5 mg/mL的溶液,將DPPH乙醇溶液與提取物樣品以1∶2的比例混合,室溫下避光反應30 min后于517 nm處測定其吸光值,同時利用無水乙醇進行空白實驗,平行實驗三次。

DPPH自由基清除率的計算公式如式(1):

式(1)

其中:A517空白-空白樣在517 nm處的吸光值;A517樣品-待測樣在517 nm處的吸光值。

1.2.4.2 提取物對超氧陰離子自由基的清除能力的測定 本實驗采用鄰苯三酚自氧化法[12]。在試管中加入4.5 mL pH8.2的磷酸緩沖溶液和1 mL濃度為0.5 mg/mL的刺五加提取物,25 ℃水浴加熱20 min,再加入于25 ℃預熱的0.4 mL濃度為25 mol/L的鄰苯三酚溶液,震蕩反應3 min后立即加入100 μL 3%抗壞血酸,混勻后于320 nm處測定其吸光度。

O2-·自由基清除率的計算公式如式(2):

式(2)

其中:A0-不加樣品時吸光度;A1-加入樣品的吸光度;A2-不加鄰苯三酚樣品的吸光度。

1.2.4.3 提取物對羥基自由基(·OH)清除能力的測定 該測定方法參照劉立新等[13]的方法,并略作改動。在試管中加入1.0 mL磷酸鹽緩沖溶液。0.2 mL番紅,1.0 mL EDTANa2-Fe2+,再加入0.5 mg/mL的刺五加提取物7.0 mL,最后加入H2O2溶液0.8 mL,于40 ℃水浴30 min后在520 nm處測定吸光度值,同時利用蒸餾水進行空白實驗,利用等體積的H2O2和蒸餾水溶液進行對照實驗,平行實驗三次。

羥自由基清除率的計算公式如式(3):

式(3)

其中:A517空白-空白樣在517 nm處的吸光值;A517樣品-待測樣在517 nm處的吸光值;A517對照-對照樣在517 nm處的吸光值。

1.2.5 數據處理 本研究中數據均以平均值±標準偏差表示;采用spss 16軟件對數據進行顯著性分析;采用Excel(2003)軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 浸提溫度對自由基清除率的影響 按照1.2.2.1的提取條件,結果如圖1所示。隨著反應溫度的升高,提取物對DPPH自由基清除清除率呈現先增大再減小的趨勢,且在70 ℃時清除率最高達到54.12%。當溫度高于80 ℃時,提取物對自由基的清除率開始下降。這可能是因為溫度升高,分子熱運動加劇,有利于有效成分的解吸和溶解,浸提效率增大,刺五加提取物中抗氧化活性物質的濃度在不斷的增大。但當溫度過高時,部分有效成分開始降解,或者發生其他化學反應,從而提取物的抗氧化活性反而下降?？紤]到能耗,選擇70 ℃為最佳反應溫度。

圖1 浸提溫度對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the free radical scavenging rate of DPPH

2.1.2 浸提時間對自由基清除率的影響 按照1.2.2.2的提取條件,結果如圖2。提取物對DPPH自由基清除清除率隨著浸提時間的延長而增大,在90～150 min,清除率增加較緩慢。這是由于在提取的前期階段,提取物中抗氧化有效成分含量低,原料組織中有效成分含量高,濃度梯度大,抗氧化成分由原料內部向浸提液中擴散的傳質動力較大,因此隨著浸提時間的增加,浸提液中抗氧化成分的含量迅速增加。而隨著浸提時間的繼續增加,抗氧化成分的濃度梯度逐漸減小,故浸提效率降低。綜合考慮,浸提時間選擇90 min 較為適宜。

2.1.3 料液比對自由基清除率的影響 按照1.2.2.3的提取條件,結果如圖3。從圖中可以看出,隨著物料與浸提液比例的增大(即浸提體系刺五加勻漿液濃度的降低),提取物對DPPH自由基清除清除率呈不斷增加的趨勢,因為濃度差是滲透和擴散的主要推動力,故低濃度的浸提體系,抗氧化活性物質的提取效率會增加。但當料液比大于1∶60(g/mL)以后,再繼續增大料液比,提取物的抗氧化效果增加不顯著,故選取料液比為1∶60(g/mL)。

圖3 料液比對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the free radical scavenging rate of DPPH

2.1.4 浸提次數對自由基清除率的影響 按照1.2.2.4的提取條件,結果如圖4。增加提取次數,可增大提取物對DPPH自由基清除率。2次提取比1次提取的提取物對DPPH自由基清除率提高了24.96%。當提取次數增加為3次時,提取物的抗氧化活性較2次時略有增加,統計分析結果為不顯著。綜合考慮能耗和經濟性,提取次數為2次為宜。

圖4 浸提次數對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the free radical scavenging rate of DPPH

2.2 正交實驗結果

正交實驗結果如表2所示。由直觀分析可知,當浸提溫度為70 ℃、提取時間90 min、料液比1∶80(g/mL)及提取次數2次,提取物對DPPH自由基的清除率最高為66.25%。通過極差分析可以看出,各因素對抗氧化活性的影響程度為C>A>B,即料液比>浸提溫度>浸提時間。因本研究的最優實驗條件A2B3C3不在正交實驗中,故對此實驗條件進行驗證實驗。

表2 正交實驗設計方案及結果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental results

2.3 驗證實驗及對其他自由基清除能力的分析

在反應溫度為70 ℃、提取時間110 min、料液比1∶80(g/mL),提取次數為2次的條件下,分別測定刺五加提取物對DPPH自由基、O2-·自由基及·OH自由基的清除率。同時,測定維生素C的抗氧化活性。結果如表3。從結果可以看出,在最優實驗條件下,提取物對DPPH自由基、O2-·自由基、·OH自由基清除率分別為69.14%、31.69%、76.03%。且對DPPH自由基及·OH自由基的清除效果均好于維生素C,體現了良好的抗氧化性。

表3 驗證實驗結果及對O2-·自由基 和·OH自由基清除能力的分析(%)Table 3 Verification experiment and analysis of the scavenging rate of superoxide anion radical and hydroxyl radical(%)

事實上,刺五加提取物中含有多種具有功能活性的化學成分,如苷類、萜類、黃酮、多糖、維生素和礦質元素等。近年來,國內外學者對刺五加的化學成分進行了深入廣泛的研究,刺五加苷、紫丁香苷和異嗪皮啶等為主要活性成分[14-16]。李志峰等從刺五加提取物中分離鑒定了12個化合物,其中包括苷類、多糖、刺五加酮等化合物[17]。張濤等從長白山區刺五加中分離到了11個化合物,其中四種具有較好的自由基清除活性,其對DPPH自由基清除作用的IC50值分別為0.01、0.01、0.01、0.66 μg/mL[18]。本文未對提取物的化學成分進行分析,在未來的研究中將做進一步探討。

3 結論

本研究結果表明,刺五加熱水浸提物具有很好的抗氧化活性,通過正交實驗得到最佳的提取條件為:反應溫度為70 ℃、提取時間110 min、料液比1∶80(g/mL)、提取次數為2次。提取物對DPPH自由基、·OH自由基的清除率均好于維生素C,對O2-·自由基也有一定的清除效果。刺五加資源豐富且無毒副作用,提取物可以作為一種營養保健成分或天然的抗氧化劑添加到食品中,這對植物資源的綜合開發利用具有重要的意義。

[1]潘海峰,孟艷彬,繆紅.刺五加的研究概況[J].承德醫學院學報,2002,19(2):157-159.

[2]Li X L,Zhou A G.Preparation of polysaccharides fromAcanthopanaxsenticosusand its inhibition against irradiation-induced injury of rat[J].Carbohydrate Polymers,2007,67(2):219-226.

[3]Jin Mu Y,Seung Heon H,Jong Ha K,et al.Effect ofAcanthopanaxsenticosusstem on mast cell-dependent anaphylaxis[J].Journal of Ethnopharmacology,2002,79(3):347-52.

[4]Yi J M,Kim M S,Seo S W,et al.Acanthopanaxsenticosusroot inhibits mast cell-dependent anaphylaxis[J].Clinica chimica acta;international journal of clinical chemistry,2001,312(1-2):163-168.

[5]趙娟,徐彥楠,郝永霞,等. 刺五加多糖的免疫調節作用研究[J]. 河北醫科大學學報,2010,31(9):1089-1092.

[6]Kong X F,Yin Y L,Wu G Y,et al. Dietary Supplementation withAcanthopanaxsenticosusextract modulates cellular and humoral immunity in weaned piglets.[J]. Asian Australasian Journal of Animal Sciences,2007,20(9):1453-1461.

[7]佟麗,黃添友,吳波,等.植物多糖抗腫瘤作用與機理研究——Ⅲ、茯苓多糖(PPS)和刺五加多糖(ASPS)對S180細胞膜脂肪酸組成的影響[J].天然產物研究與開發,1995(1):5-9.

[8]孟慶繁,于笑坤,徐睦蕓,等.刺五加多糖的提取及其抗氧化性[J].吉林大學學報:理學版,2005,43(5):683-686.

[9]Young-Hyun K,Myoung Lae C,Dan-Bi K,et al.The antioxidant activity and their major antioxidant compounds fromAcanthopanaxsenticosusand A. koreanum[J].Molecules,2015,20(7):13281-13295.

[10]Nsimba R Y,Kikuzaki H,Konishi Y.Antioxidant activity of various extracts and fractions of Chenopodium quinoa and Amaranthus spp. seeds[J].Food Chemistry,2008,106(2):760-766.

[11]Shimada K,Fujikawa K,Yahara K,et al.Antioxidative properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cycloextrin emulsion[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,1992,40(6):945-948.

[12]白曉艷,趙忠喜.柳蒿芽中黃酮類化合物提取條件及抗氧化作用研究[J].呼倫貝爾學院學報,2013,21(2):105-107.

[13]劉立新,張羽男,沙靖全,等.柑桔皮中黃酮類化合物的提取及抗氧化作用研究[J].東北農業大學學報,2010,41(4):103-107.

[14]龔婧如,王書芳. 刺五加的化學成分研究[J]. 中草藥,2012,43(12):2337-2341.

[15]Kimura Y,Sumiyoshi M. Effects of various Eleutherococcus senticosus cortex on swimming time,natural killer activity and corticosterone level in forced swimming stressed mice[J]. J Ethnopharmacol,2004,95(2/3):447-453.

[16]Yamazaki T,Tokiwa T,Shimosaka S,et al. Anti-inflammatory effects of a major component of Acanthopanax senticosus Harms,isofraxidin[J]. Jpn J Electro,2004,48(2):55-58.

[17]李志峰,楊金火,張武崗,等. 刺五加的化學成分研究[J]. 中草藥,2011,42(5):852-855.

[18]張濤,樸俊虹,袁蕾,等. 刺五加化學成分及自由基清除活性研究[J]. 中草藥,2012,43(6):1057-1060.

Antioxidant activity of water extraction fromAcanthopanacissenticosus

TIAN Song-yang1,YU Cheng-long2,3,+,XU Wei1,4，*,CHEN Tie-yun1,SUN Qing2,WANG Jun-yan1,LI Yan1

(1.Department of Food Science and Engineering,Harbin University,Harbin 150086,China;2.Heilongjiang Polytechnic,Harbin 150080,China;3.College of Wildlife Resources,Northeast Forest University,Harbin 150040,China;4.Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

WatersolublecomponentsofAcanthopanax senticosuswereextractedbyhotwater,extractionliquidonDPPHfreeradicalscavengingrateasevaluationindex,theeffectoftheextractiontemperature,extractiontime,solid-liquidratioandextractiontimesontheantioxidantactivitywerestudiedtoobtaintheoptimalextractioncondition.Orthogonaltestshowedthattheoptimialconditionswerereactiontemperatureof70 ℃,extractiontimeof110min,materialliquidratioof1∶80(g/mL),twiceextraction,andtheremovalratewastheDPPHfreeradicalscavengingratewas69.14%.Inaddition,DPPH,superoxideanionandhydroxylradicalscavengingactivitiesoftheextractionobtainedunderoptimalextractionconditionandvitaminCwereanalyzed.ResultsshowedthatsuperoxideanionradicalscavengingactivitiesoftheextractionwaslowerthanvitaminC(p<0.05),andscavengingratewas31.69%.However,DPPHandhydroxylradicalscavengingactivitiesoftheextractionwerehigherthanvitaminC(p<0.05),andhydroxylradicalscavengingratewas76.03%.

Acanthopanacis senticosus;extraction;antioxidantactivity;freeradical

2016-04-08

田松陽(1993-)，女，在讀本科生，研究方向：食品加工，E-mail:1714389909@qq.com。 于成龍(1983-)，男，講師，在讀博士研究生，研究方向：旅游管理及野生植物資源開發，E-mail:yuchenglong1983@126.com。

*通訊作者:徐微(1982-)，女，在讀博士研究生，講師，主要從事食品化學和營養學研究，E-mail:xweihappy@163.com。

黑龍江省大學生創新創業訓練計劃項目(201510234001);哈爾濱學院學生科研項目(HXS20161344)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)21-0110-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.013