響應面法優化酶解羅非魚皮制備抗氧化肽的工藝研究

胡 曉,吳 靜,2,王子懷,2,李來好,*,楊賢慶,吳燕燕,林婉玲,陳勝軍,黃 卉,姚建玲

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306;3.廣州醫科大學附屬第二醫院,廣東廣州 510260)

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響應面法優化酶解羅非魚皮制備抗氧化肽的工藝研究

胡 曉1,吳 靜1,2,王子懷1,2,李來好1,*,楊賢慶1,吳燕燕1,林婉玲1,陳勝軍1,黃 卉1,姚建玲3

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306;3.廣州醫科大學附屬第二醫院,廣東廣州 510260)

采用響應面分析法對酶法水解羅非魚皮制備抗氧化肽的工藝條件進行優化。以水解度、DPPH自由基與OH自由基半抑制濃度(IC50)、還原力為評價指標,分析比較了商業蛋白酶中的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶及木瓜蛋白酶對羅非魚皮的水解效果及其產物的抗氧化活性,篩選出堿性蛋白酶為最佳水解用酶,并利用響應面分析法對羅非魚皮酶解條件予以了優化,最終確立的最佳酶解工藝為:pH10.00、反應時間4 h、溫度40 ℃、料液比0.38 g/mL,在此條件下產物的還原力為1.054,與模型預測值相吻合,表明了響應面法的有效性。

羅非魚皮,酶解,抗氧化,響應面法

我國是羅非魚養殖大國,羅非魚資源極為豐富,其產量位居世界首位[1-2]。目前,羅非魚的加工主要以凍全魚與凍魚片為主,加工產品的品種較為單一,且其加工過程中會產生大量富含蛋白質的加工副產物,如魚皮、魚鱗、魚骨等。該加工副產物大多用作飼料或肥料,其蛋白質資源未得到充分開發與利用,大大限制了羅非魚蛋白質的精深加工與高值化利用水平的提升[3-4]。抗氧化肽屬小分子物質,其大多由2～20個氨基酸通過特殊序列組成。水產蛋白的肽鏈中一般蘊含著抗氧化肽功能區,當通過合適的蛋白酶剪切釋放后可表現出抗氧化活性。與其他抗氧化劑相比較,天然抗氧化肽具有更高的安全性,且容易被人體消化、吸收,生物利用率更高[5-6]。目前的研究發現,羅非魚皮中含有抗氧化活性成分[7-9],可以用來制備抗氧化產物。

表1 不同蛋白酶酶解實驗條件[10]Table 1 The hydrolytic conditions of enzymes[10]

本研究以羅非魚皮為原料,以DPPH自由基、OH自由基的清除效果及還原力大小為評價指標,從6種商業酶中篩選出水解羅非魚皮制備抗氧化活性肽的最佳用酶,在單因素的技術上,應用響應面法優化酶解制備羅非魚皮抗氧化肽的工藝,旨在為羅非魚皮的精深加工及高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚 購于廣州華潤萬家超市,鮮活即殺,將魚肉與魚皮分離,絞碎,-18 ℃凍藏備用。

酸性蛋白酶(≥15000 NFU/mg)、中性蛋白酶(≥100 U/mg)、堿性蛋白酶(21萬U/g)、胰蛋白酶(≥250 U/mg)、菠蘿蛋白酶(≥120 U/mg)、木瓜蛋白酶(≥800 U/mg) 廣州齊云生物技術有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國sigma公司;其他試劑均為分析純,廣州化學試劑廠。

DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠;DK-S24型恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器廠有限公司;BS224S型電子精密天平 德國Sartorius公司;Delta320精密pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH-4型數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;KjeltecTM2300型蛋白自動分析儀 丹麥FOSS儀器有限公司;3K30型高速冷凍離心機 德國Sigma公司;Synergy H1型酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;Akku-drive電位滴定儀 德國赫施曼公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅非魚皮最佳水解酶的選擇 選用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶這6種酶在其各自的最適溫度、pH條件下對羅非魚皮進行水解(水解條件見表1),酶解時間為4 h,冷卻后于4 ℃、10000 r/min冷凍離心20 min,取上清液抽濾后即為實驗所用的酶解產物。分別測定各酶解產物的水解度、DPPH自由基與OH自由基半抑制濃度(IC50)以及還原力,綜合比較后選取一種效果相對較好的酶,綜合預實驗中單因素實驗所得結果進行響應面優化實驗。

1.2.2 羅非魚皮酶解液的水解度測定 采用甲醛電位滴定法[11]測定酶解液中游離氨基態氮含量,半微量凱氏定氮法測定原料總氮含量。

水解度(DH)(%)=酶解液中游離氨基態氮含量/原料總氮含量×100

1.2.3 DPPH自由基清除能力的測定 參照Baen等[12]的方法稍作修改。取2 mL樣液,加入0.15 mol/L DPPH(95%乙醇溶解),混勻后于室溫下避光反應30 min,在517 nm處測得其吸光值Ai,空白組為2 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液,加入2 mL樣液混勻,在517 nm處測得其吸光值Aj,對照組為2 mL DPPH溶液加入2 mL 95%乙醇,在517 nm處測得其吸光值A0。對樣品溶液做梯度稀釋,測定不同濃度下的自由基清除率,經線性回歸后計算出自由基清除率為50%時的濃度,即IC50值。清除率按以下公式進行計算:

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:A0為對照組吸光值;Ai為樣品組吸光值;Aj為空白組吸光值。

1.2.4 OH自由基清除能力的測定 參照Jin等[13]的方法并略作修改。損傷管:取0.6 mL 5 mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液,先加入0.4 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.40)和0.6 mL 0.75 mmol/L的FeSO4,再加入2 mL樣品液混勻后,最后加入0.4 mL 0.1%(v/v)的H2O2搖勻,37 ℃下水浴60 min后在536 nm處測定得吸光值為A樣品;以去離子水代替樣品和H2O2溶液重復上述操作,在536 nm處測得其吸光值為A未損傷;以去離子水代替樣品液來重復以上操作,在536 nm處測得吸光度A損傷。對樣品溶液做梯度稀釋,測定不同濃度下的自由基清除率,經線性回歸后計算出自由基清除率為50%時的蛋白濃度,即IC50值。清除率按如下公式進行計算:

清除率(%)=(A樣品-A損傷)/(A未損傷-A損傷)×100

式中:A樣品為樣品組的吸光值;A損傷為損傷管的吸光值;A未損傷為未損傷管的吸光值。

1.2.5 還原力測定 參照Ahmadi等[14]的方法并略有修改。取2 mL酶解液,加入2 mL 0.2 mol/L pH6.6的磷酸緩沖液和2 mL質量分數為1%的鐵氰化鉀K3Fe(CN)6溶液混勻,在50 ℃水浴鍋內保溫20 min,加入質量分數為10%的三氯乙酸(TCA)溶液2 mL,震蕩混勻后離心(10000 r/mim,10 min)。取2 mL離心后上清液,加入2 mL去離子水和0.4 mL質量分數為0.1%的FeCl3溶液,震蕩混勻后50 ℃水浴10 min,等至體系溶液由黃色變為藍色后在700 nm處測定其吸光度。用去離子水代替樣品作為空白對照。

1.2.6 響應面分析實驗 在蛋白酶水解底物的過程中,影響酶解反應的因素有反應體系的pH、溫度、反應時間、及料液比等。因此,根據在單因素實驗中所得結果(pH、酶解時間、酶解溫度、料液比對酶解產物的抗氧化活性影響較大,而酶用量影響較小,且pH在10.0,酶解時間在4 h,酶解溫度45 ℃,料液比0.38時酶解產物各抗氧化活性最大)選擇pH、溫度、反應時間和料液比四個因素予以優化。在單因素實驗基礎上,以還原力為響應值,選擇pH(A),時間(B),溫度(C),料液比(D)4個變量,采用四因素三水平的Box-Behnken設計(BBD),進行響應面分析實驗,響應面中心組合設計實驗因素編碼值見表2。

表2 BBD響應面分析各因素編碼值和實際值Table 2 Independent variables and their coded actual values in BBD

2 結果與討論

2.1 不同蛋白酶的水解效果比較分析

由圖1可知,羅非魚皮在經不同蛋白酶酶解后的水解度差異較大,其中酸性蛋白酶水解羅非魚皮的效果較差,水解度僅為6.64%,菠蘿蛋白酶與堿性蛋白酶水解羅非魚皮的效果較好,水解度分別為11.9%、11.4%。在相似酶解條件下,馬賽蕊等[15]用木瓜蛋白酶水解羅非魚肉蛋白,水解度為20.85%。羅非魚皮水解度相對較低,其原因可能是魚皮中膠原蛋白含量較高,而膠原蛋白具有三螺旋結構,結構較為致密,與魚肉相比較難被蛋白酶水解[16]。

圖1 不同蛋白酶的水解度Fig.1 Degree of hydrolysis ofdifferent proteases

2.2 羅非魚皮不同蛋白酶水解產物的抗氧化活性

2.2.1 羅非魚皮不同蛋白酶水解產物的DPPH自由基清除能力 將6種酶水解羅非魚皮得到的酶解物作梯度稀釋,測定各酶解物清除DPPH自由基半抑制濃度(IC50)以表征其抗氧化能力,結果如圖2所示。由圖2可知,各蛋白酶水解羅非魚皮得到的產物對DPPH自由基均表現出一定的清除活性,其中酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶水解產物其清除DPPH自由基IC50值較高,從而表明這三種酶解產物清除DPPH自由基的活性較其他酶解產物要差,而堿性蛋白酶水解產物的IC50值最低,為6.34 mg/mL,表明其對DPPH自由基清除活性最好。夏光華等[17]用包括堿性蛋白酶在內的三種酶水解羅非魚皮膠原蛋白制得的抗氧化活性肽,其清除DPPH自由基的 IC50為10.78 mg/mL,可見本實驗中的酶解產物活性較高。

圖2 不同蛋白酶水解產物的 DPPH自由基半抑制濃度(IC50)Fig.2 Scavenging DPPH radical IC50 of tilapia skin hydrolysates

2.2.2 羅非魚皮不同蛋白酶水解產物OH自由基清除能力 本文采用Fe2+/H2O2體系通過Fenton反應生成OH自由基,對各酶解物進行梯度稀釋,測定各酶解物清除OH自由基的半抑制濃度(IC50)以表征其抗氧化能力。如圖3所示,堿性蛋白酶水解產物清除OH自由基的IC50值最低,為11.13 mg/mL,其余各酶解物清除OH自由基IC50值均大于15 mg/mL。陳卉卉等[18]報道了木瓜蛋白酶水解東海海參膠原蛋白得到的抗氧化肽活性相對較強,其清除OH自由基的IC50為27.8 mg/mL;白仁奧等[19]采用鐵氧化鄰二氮菲法考察了文蛤在風味蛋白酶和木瓜蛋白酶雙酶復合酶解條件下,酶解產物的OH自由基清除效果,其IC50值為3.47 mg/mL。不同水產蛋白的酶解產物在清除OH自由基能力方面存在較大差異,這與水產蛋白肽鏈中的氨基酸序列以及所用蛋白酶的酶切位點和水解程度密切相關。

圖3 不同羅非魚皮酶解液OH自由基半抑制濃度(IC50)Fig.3 Scavenging ·OH radical IC50 of tilapia skin hydrolysates

2.2.3 羅非魚皮不同蛋白酶水解產物的還原力 各酶解產物的還原力如圖4所示。由圖4可知,各酶解物中,酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶以及胰蛋白酶水解產物的還原力相對較差,堿性蛋白酶水解物的還原力最高,其值為0.892。張風等[20]采用響應面法優化了酶解蝦頭蝦殼蛋白質制備抗氧化肽的工藝,在優化后的最佳工藝條件下酶解產物的還原力為0.77,低于羅非魚皮堿性蛋白酶水解產物。

圖4 不同羅非魚皮酶解液的還原能力Fig.4 Reductive activity of tilapia skin hydrolysates

綜上所述,在羅非魚皮6種蛋白酶水解產物中,堿性蛋白酶水解物對DPPH自由基、OH自由基的清除能力以及還原力均為最強,水解度也較高。由此可見在各酶的最適條件下,堿性蛋白酶水解羅非魚皮制備抗氧化活性肽的效果最佳。這很可能是因為堿性蛋白酶在水解天然蛋白質時較其他酶有更廣泛的酶切位點,其水解出來的短肽序列以及終端氨基酸與許多生物活性相關,其中包括抗氧化活性[21]。此外結合水解度測定結果可以看到,不同蛋白酶水解產物的抗氧化活性與其水解度之間不呈正相關。目前已經見諸報道的大多數抗氧化活性肽的分子量都低于10 u[22],但這并不意味著酶解產物的水解度越高、分子量越小,其抗氧化活性就越強,如Klompong等[23]研究金帶細鲹酶解物時,均發現隨著水解度增加產物的還原力反而下降。這是因為肽類的氨基酸組成種類、數量及其排列順序都對其抗氧化活性有重要影響[24]。因此,根據以上實驗結果,根據在預實驗中單因素實驗所得結果選定堿性蛋白酶作為實驗用酶并采用響應面法對酶解工藝進行優化。

2.3 響應面分析

2.3.1 響應面實驗設計及結果 由表3可知,該實驗共有27個實驗點,包括12個析因點和3個零點,每個實驗點重復3次,根據實驗結果來優化4個變量。

表3 BBD響應面實驗設計與結果Table 3 Experimental design and results of BBD response surface

注:表中還原力用3次測定平均值±標準差表示(n=3)。2.3.2 回歸方程的建立和方差分析 根據表3實驗結果計算得到二次回歸方程(1)

y=-19.77296-0.094375A+1.68967B+0.60733C+22.022D+0.048AB+0.01135AC-0.099AD-0.0126BC-1.086BD-0.0576CD-0.027802A2-0.16271B2-0.00711333C2-19.20533D2

式(1)

其中A、B、C、D分別代表pH、時間、溫度、料液比的各編碼值。通過回歸方程(1)反映出各因子與響應值之間的關系,具體方差分析結果見表4。

表4 BBD響應面實驗結果方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model of BBD

2.3.3 響應面圖結果 根據回歸方程(1),繪制出三維響應面分析圖,分別見圖5～圖10。

圖5 pH和酶解時間對響應值的影響Fig.5 Effect of pH and Hydrolysis Time on Response Value

由圖5可知,當pH一定時,響應值隨酶解時間的延長而下降。這可能是因為隨著時間的延長許多有活性的多肽又逐漸被水解成活性較弱的短肽或氨基酸,造成體系的抗氧化活性下降。反應時間一定時,反應體系pH的改變對響應值影響不大,但整體上是有顯著影響的。

圖6 pH和溫度對響應值的影響Fig.6 Effect of pH and Temperature on Response Value

由圖6可知,pH和溫度的交互作用對結果影響顯著,pH和溫度的變化對響應值影響較大,過高或過低的pH及溫度都可能降低酶解產物的還原力。

圖7 pH和料液比對響應值的影響Fig.7 Effect of pH and Substrate Concentration on Response Value

由圖7可知,當pH一定時,響應值隨料液比的增大先增大再減小,這是由于當料液比低即加水量大,這意味著溶液中酶的濃度下降,作用于底物的有效酶活降低,從而影響到產物的生成;而濃度高時即加水量小,此時溶液較為粘稠,對反應體系中pH的調節和酶的溶解及均勻混合產生不利影響,因而也造成目標產物中活性成分下降,從而使響應值降低。

圖8 酶解時間和溫度對響應值的影響Fig.8 Effect of Hydrolysis Time and Temperature on Response Value

圖8顯示了酶解時間和溫度的交互作用,由圖可見,時間一定時,響應值隨溫度升高先增大后減小,表明了過高或過低的溫度均影響到酶的活性而不利于其水解底物產生目標物。一定的溫度下,響應值隨酶解時間延長先升高后降低。

圖9 酶解時間和料液比對響應值的影響Fig.9 Effect of Hydrolysis Time and Substrate Concentration on Response Value

由圖9可知,其等高線呈橢圓型,表明料液比和酶解時間之間的交互影響較好,該結論與表4回歸方程的方差分析結果相一致。

圖10 溫度和料液比對響應值的影響Fig.10 Effect of Hydrolysis Temperature and Substrate Concentration on Response Value

從圖10中可以看出,當溫度一定時,料液比的改變對響應值的影響較大。對溫度和料液比交互的方差分析結果為不顯著,但由圖可知,其等高線呈近橢圓型,表明料液比和溫度間仍存在一定的交互作用。

2.3.4 驗證性實驗 根據Design Expert Software(version 8.0.5)軟件分析得到堿性蛋白酶水解羅非魚皮制備抗氧化活性肽的最佳酶解反應條件為:pH10.0、反應時間4 h、溫度40 ℃、料液比0.38 g/mL,所得酶解液的還原力最高,為1.000。在最優水解條件下,進行了3組重復性實驗,測得優化后的羅非魚皮蛋白抗氧化活性肽的還原力為1.054±0.057,與模型預測值并無顯著性差異(p>0.05),表明實驗確定的模型條件可以用于預測實際值。

3 結論

本文以羅非魚皮為原料,DPPH自由基、OH自由基和還原力為指標,從6種商業酶中篩選出水解羅非魚皮制備抗氧化活性肽的最適用酶為堿性蛋白酶,其水解度為11.45%,對DPPH自由基和OH自由基的半抑制濃度分別為6.34 mg/mL和11.13 mg/mL,還原力為0.892。

利用響應面分析中心組合設計實驗優化堿性蛋白酶水解羅非魚皮制備抗氧化活性肽的工藝,得到最優酶解條件為:pH10.00、反應時間4 h、溫度40 ℃、料液比0.38 g/mL,在此條件下所得酶解物的還原力最高,其值為1.054。優化后羅非魚皮蛋白抗氧化活性肽的還原力較優化前確有提高。

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Optimization of preparation of Tilapia skin antioxidative peptides with enzymatic hydrolysis by response surface methodology

HU Xiao1,WU Jing1,2,WANG Zi-huai1,2,LI Lai-hao1，*,YANG Xian-qing1,WU Yan-yan1,LIN Wan-ling1,CHEN Sheng-jun1,HUANG Hui1,YAO Jian-ling3

(1.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture;National R&D Center for Aquatic Product Processing,Guangzhou 510300,China;2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;3.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510260,China)

ResponsesurfacemethodswereusedtooptimizethehydrolysisconditionsofTilapiaskinforproductionofantioxidantpeptides.HalfinhibitoryconcentrationsofDPPHradical,hydroxylfreeradicalandreducingpowercapacitywereselectedastheindexestocomparetheeffectofhydrolysisandproductantioxidantactivityof6kindsofcommercialenzymes(acidprotease,neutralprotease,alkalineprotease,trypsin,bromelainandpapain).Theresultshowedalkalineproteasewasoptimumenzyme.Thenthehydrolysisconditionswasoptimizedbyresponsesurfacemethodology.ThehydrolysisconditionswerepH10.00,hydrolysistimeof4h,hydrolysistemperatureof40 ℃,ratioofmaterialtowaterof0.38g/mL.Undersuchconditions,thereducingpowerwas1.054,whichwasconsistentwiththemodelprediction.

tilapiaskin;enzymolysis;antioxidant;responsesurfacemethodology

2016-04-27

胡曉(1981-),男,博士,副研究員,研究方向：食品生物技術、水產品加工與質量安全,E-mail:wjjingwu@126.com。

*通訊作者:李來好(1963-),男,博士,研究員,研究方向：水產品加工與質量安全,E-mail:laihaoli@163.com。

國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-49);國家自然科學基金青年科學基金項目(31301454);中國水產科學研究院基本科研業務費專項項目(2016ZD10);“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD28B06);廣東省海洋漁業科技與產業發展專項科技攻關與研發項目(A201401C02,Z2015008);農業部水產品加工重點實驗室開放基金課題(NYJG201405)。

TS254.9

B

1002-0306(2016)21-0195-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.029