響應面法優化海地瓜皂苷提取工藝

蘇永昌,劉淑集,阮偉達,劉秋鳳,王 茵,劉智禹

(1.福建省水產研究所,國家海水魚類加工技術研發分中心(廈門),福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室,福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心,福建廈門 361013;2.福建省南安市疾病預防控制中心,福建南安 362300)

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響應面法優化海地瓜皂苷提取工藝

蘇永昌1,劉淑集1,阮偉達2,劉秋鳳1,王 茵1,劉智禹1

(1.福建省水產研究所,國家海水魚類加工技術研發分中心(廈門),福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室,福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心,福建廈門 361013;2.福建省南安市疾病預防控制中心,福建南安 362300)

目的:以海地瓜為原料,開展了海地瓜皂苷的提取工藝研究。方法:在單因素分析的基礎上,采用了響應面法分析了乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間等因素對海參皂苷得率的影響,優化獲得最佳的海地瓜皂苷提取工藝為:乙醇濃度為79%,提取溫度為73.5 ℃,提取時間為2.75 h,料液比為1∶1.7 g/mL。對海地瓜皂苷的影響由大到小依次為乙醇體積、乙醇濃度、提取時間和提取溫度。在該工藝下提取海地瓜皂苷得率為0.378%。與模型預測值一致。結論:響應面分析法確定的提取條件合理,驗證值與預測值接近,可以用于海地瓜皂苷的提取工藝優化。

海地瓜,皂苷,提取工藝,響應面法

海參皂苷,又被稱海參皂甙、海參毒素,是一類由苷元與糖鏈結合而成的化合物,大多結構屬于羊毛甾醇型三萜類寡糖苷[1-2]。海參皂苷,能溶于水、稀醇、熱甲醇和乙醇中,難溶于丙酮、乙醚、苯等親脂性的有機試劑[3]。目前,海參皂苷的提取方法主要有醇-醇提取法[4-5]、水-醇提取法[6]、冷浸提法[7-8]和水提取法[9-10]。研究證明,海參皂苷具有溶血作用[11]、抗腫瘤[10]、提高免疫力[12]、抗菌[9]、抗病毒[13]、鎮痛解痙的作用[14]、抑制排卵和刺激子宮收縮的作用[15]、降血脂[16]等多種生物活性。

海地瓜(AcaudinaMolpadioides)俗稱香參、白參、海茄子,屬芋參目(Molpadida)尻參科(Caudinidae)海地瓜屬(Acaudina)動物[17],在我國海南、廣東、福建和浙江沿海等地廣泛分布[18]。海地瓜作為低值海參,具有價格低廉,產量大,可大規模開發利用的特點。海地瓜營養豐富,含有皂苷、多糖、膠原蛋白等多種生物活性物質物質[19],顯示出了巨大的開發潛力和市場價值。目前,應用乙醇進行海參皂苷的浸提應用最為廣泛,具有溶解性高、操作簡便,試劑毒性低的特點[20]。本研究應用響應面法對乙醇浸提海地瓜皂苷的工藝條件進行優化,獲得了簡便高效的海地瓜提取工藝,提高了海地瓜皂苷的得率,為海地瓜皂苷的規模化開發利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海參原料 海地瓜采集于福建寧德海域,新鮮原料洗凈后絞碎,測定水分含量后,冷凍備用;皂苷標準品:人參皂苷Re(色譜純) 中國藥檢所;香草醛、甲醇等均為國產分析純試劑。

RE52型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;AL204型電子天平 瑞士梅特勒公司;DK-8B 型恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;BSA224S分析天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司;M200 PRO多功能酶標儀 瑞士Tecan公司。

1.2 實驗方法

采用乙醇浸提法對海地瓜皂苷進行提取,稱量海地瓜100 g,加入不同濃度乙醇、在設定的恒溫條件下,進行浸泡提取皂苷,浸提液經低溫濃縮和冷凍干燥,制備獲得海地瓜皂苷粗品。參照香草醛法進行海地瓜皂苷粗品中皂苷含量[21],以海地瓜原料干重計算海地瓜皂苷得率,計算方法如下:

海地瓜皂苷得率(%)=海地瓜皂苷含量(g)/海地瓜原料質量×(1-水分百分含量)(g)×100

1.2.1 單因素實驗 乙醇濃度因素:在提取溫度為70 ℃、提取時間3 h、提取次數3次、料液比1∶1.5 g/mL(W/V)的條件下,分別選擇乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%進行皂苷提取。

料液比因素:在乙醇濃度為70%、溫度為70 ℃、提取時間3 h、提取次數3次的條件下,分別選擇1∶1、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5 g/mL(W/V)乙醇溶液的進行皂苷提取。

提取溫度因素:在乙醇濃度為70%、提取時間3 h、提取次數3次、料液比1∶1.5 g/mL(W/V)的條件下,分別選擇提取溫度為50、60、70、80、90 ℃進行皂苷提取。

提取時間因素:在乙醇濃度為70%、提取溫度為70 ℃、提取次數為3次、料液比1∶1.5 g/mL(W/V)的條件下,分別選擇提取時間為2、3、4、5 h,進行皂苷提取。

提取次數因素:在乙醇濃度為70%、提取溫度為70 ℃、提取時間為3 h、料液比1∶1.5 g/mL(W/V)的條件下提取,分別選擇提取次數為1、2、3、4、5次,進行皂苷提取。

1.2.2 響應面實驗因素設計 根據單因素實驗結果,分別對乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)和料液比(D)為自變量進行優化,以皂苷的得率(Y)為響應對象,根據Box-Behnken原理設計四因素三水平的實驗因素水平表,如表1所示,對結果進行方差分析和響應面分析,獲得最佳皂苷提取工藝。

表1 Box-Benhnken實驗因素水平表Table 1 Box-Benhnken test factor-levels table

1.3 數據處理

采用Design-Expert 軟件,并結合SAS數據處理軟件對結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對海地瓜皂苷的影響 分別采用50%、60%、70%、80%、90%濃度乙醇作為溶劑進行海地瓜皂苷提取,結果如圖1所示。海地瓜皂苷得率隨著乙醇濃度的提高呈現先上升后下降的趨勢,其中,采用70%乙醇進行提取時,皂苷得率達到最大值(p<0.05)。乙醇濃度過高或過低均不利于海地瓜皂苷的溶出,其原因可能是當乙醇濃度為50%時,皂苷成分不能有效溶解于浸提液中;當乙醇濃度大于90%后,水溶性的皂苷不能溶出,降低了皂苷的得率。因此,將乙醇濃度控制為60%～80%效果最佳。

圖1 乙醇濃度對皂苷得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of saponins

2.1.2 料液比對海地瓜皂苷的影響 采用料液比為1∶1、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5 g/mL(w/v)對海地瓜皂苷進行提取,結果如圖2所示。隨著乙醇體積的提高,海地瓜皂苷得率呈現先上升,后略有下降的趨勢,料液比為1∶2.0 g/mL(w/v)時,海地瓜皂苷得率達最高(p<0.05)。當浸提液比較少時,浸提液中溶液不足,原料內容物浸出率較低;當浸提液逐漸增大后,原料內容物浸出率增加,皂苷得率增加;當浸提液進一步增加后,皂苷得率反而下降,其原因可能為浸提液過多,造成后續操作如濃縮等環節時間加長,造成皂苷一定的損失。因此,綜合考慮,料液比為1∶1.5～1∶2.5 g/mL為宜。

圖2 料液比對皂苷得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of saponins

2.1.3 提取溫度對海地瓜皂苷的影響 分別采用提取溫度為50、60、70、80、90 ℃對海地瓜皂苷進行提取,結果如圖3所示。海地瓜皂苷隨著提取溫度的提高呈現先上升,后下降的趨勢。當提取溫度為70 ℃時,皂苷的提取率為最大值(p<0.01)。提取溫度對海地瓜內溶物的溶出效果影響顯著,當提取溫度為50 ℃時,提取液中內溶物溶出效果不明顯,皂苷提取率較低;當溫度逐漸上升后,提取液粘度不斷增大,內溶物溶出效果明顯;但提取溫度過高時,一方面會造成原料溶出物過多,浸提液變粘稠,增加皂苷中的雜質含量,為皂苷的進一步純化增加難度;另一方面可能會造成皂苷成分的破壞,因此,在溫度達到90 ℃時,海地瓜皂苷的得率反而降低。因此,提取溫度選擇在60～80 ℃為宜。

圖3 提取溫度對皂苷得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of saponins

2.1.4 提取時間對海地瓜皂苷的影響 采用提取時間分別為2、3、4、5 h對海地瓜皂苷進行提取,結果如圖4所示。海地瓜皂苷得率隨提取時間的增加呈現先上升后略有下降的趨勢。當提取時間為3 h后,皂苷的得率最高(p<0.05),表明在3 h左右皂苷溶出已達到平衡點,當提取時間大于3 h,延長提取時間對皂苷得率反而略有下降,可能是提取時間過長造成部分皂苷成分破壞。同時,提取時間過長會導致雜質溶出率增加,影響皂苷純度。因此,提取時間不宜太長,以2～4 h為宜。

圖4 提取時間對皂苷得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of saponins

2.1.5 提取次數對海地瓜皂苷的影響 采用提取次數分別為1、2、3、4、5次對海地瓜皂苷進行提取,結果如圖5所示。提取次數對海地瓜皂苷得率具有較大影響,海地瓜皂苷得率隨提取次數的增加而上升。當提取次數大于3次時,海地瓜皂苷提取率上升趨于平緩,表明將原料進行3次浸提后,基本完成可溶出皂苷的提取,當提取次數增加時,皂苷得率隨著次數的增加無顯著性差異(p>0.05)。因此提取次數以3次為宜。

圖5 提取次數對皂苷得率的影響Fig.5 Effect of extraction times on the yield of saponins

2.2 響應面法優化海地瓜皂苷提取工藝結果

分別以乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)和料液比(D)為自變量進行優化,以皂苷的得率(Y)為響應值進行響應面法優化,結果如表2所示。對實驗結果進行方差分析,結果如表3所示。方差分析顯示,模型p<0.0001,表現極顯著(p<0.01),失擬項p=0.3194>0.05表現為不顯著(p>0.05),說明該模型擬合效果較好,具有較好的統計學意義。如表4模型的可信度分析,表明該模型能解釋88.17%的變異,可應用于海地瓜皂苷提取的模型分析。乙醇濃度(A)、料液比(D)對皂苷得率(Y)表現為極顯著(p<0.01),提取溫度(B)、提取時間(C)對皂苷得率(Y)具有顯著影響(p<0.05)。各因素對皂苷得率(Y)其影響順序為料液比>乙醇濃度>提取時間>提取溫度。

表3 模型方差分析及顯著性檢驗Table 3 Variance analysis and significance test

注:“*”表示在α=0.05水平上顯著;“**”表示在α=0.01水平上極其顯著。

表2 響應面實驗結果Table 2 Results of RSM experiment

表4 模型的可信度分析Table 4 The credibility analysis of the model

從對模型進行二次回歸分析,獲得皂苷得率二次回歸方程:

Y(%)=0.36+0.006108A+0.004433B-0.005317C-0.012D+0.00095AB-0.005775AC-0.015AD+0.003125BC-0.000475BD-0.0012CD-0.0091A2-0.006787B2-0.018C2-0.024D2

乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)和料液比(D)交互作用關系如圖6～圖11所示。結合表3進行分析,可以發現,乙醇濃度(A)和料液比(D)之間存在極顯著的交互作用(p<0.01)。而其他因素間的交互作用則表現不顯著(p>0.05)。

圖6 Y=f(A,B)響應面圖Fig.6 Response surface plot of Y=f(A,B)

圖7 Y=f(A,C)響應面圖Fig.7 Response surface plot of Y=f(A,C)

圖8 Y=f(A,D)響應面圖Fig.8 Response surface plot of Y=f(A,D)

圖9 Y=f(B,C)響應面圖Fig.9 Response surface plot of Y=f(B,C)

圖10 Y=f(B,D)響應面圖Fig.10 Response surface plot of Y=f(B,D)

圖11 Y=f(C,D)響應面圖Fig.11 Response surface plot of Y=f(C,D)

2.3 驗證實驗

通過求解二次回歸方程偏導數得出海地瓜皂苷的最大值,即獲得了海地瓜皂苷的提取最佳工藝,即將乙醇濃度為78.93%,提取溫度為73.5 ℃,提取時間2.75 h,料液比為1∶1.729 g/mL,在該條件下,預測在海地瓜皂苷得率為0.37%。根據響應面所確定的醇提法最優工藝參數,對部分參數進行適當調整,在乙醇濃度為79%,提取溫度為73.5 ℃,提取時間為2.75 h,料液比為1∶1.7 g/mL的條件下,3次平行實驗海地瓜皂苷得率皂苷得率均值為0.378%,RSD=0.15%,與預測值0.37%接近,說明該響應面模型較為可靠,可應用于海地瓜皂苷提取工藝的參數優化。

3 結論與討論

以海地瓜為原料,應用醇提法對海地瓜皂苷進行提取,對乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間和提取次數開展了單因素分析,并選取乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間為自變量,以皂苷的得率(Y)為響應值,進行響應面法優化,獲得最佳的提取工藝為:乙醇濃度為79%,提取溫度為73.5 ℃,提取時間為2.75 h,料液比為1∶1.7 g/mL,提取次數3次。4個因變量對響應值影響程度的主次順序為料液比>乙醇濃度>提取時間>提取溫度。結果測定值與模型預測值接近,表明該提取模型與實際提取工藝擬合良好,優化的工藝參數可作為實際的參考依據。

海參皂苷具有廣泛的藥理活性,是一類具有良好開發前景的海洋生物活性物質[3]。但海參皂苷含量低,成分復雜,相關藥理研究較少,極大的限制了海參皂苷的進一步開發利用。目前,海參皂苷的制備主要還是依靠天然提取,因此,開發高效海參皂苷的提取工藝顯得尤為重要。此外,對新原料的開發,例如以海地瓜等低值海參為原料,能夠有效地降低海參皂苷的制備成本,為規模化海參皂苷的生產制備創造了可能性。本研究采用乙醇進行海參皂苷提取,具有皂苷得率高、操作簡便、成本較低等特點,能夠為海參皂苷的進一步開發利用打下基礎。

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Optimization of extraction process of Saponins fromAcaudinaMolpadioidesby response surface method

SU Yong-chang1,LIU Shu-ji1,RUAN Wei-da2,LIU Qiu-feng1,WANG Yin1,LIU Zhi-yu1

(1.Fisheries Reasearch Instiute of Fujian,National Research and Development Center for Marine Fish Processing(Xiamen),Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province;Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources,Xiamen 361013,China;2.Center for Disease Control and Prevention of Nan’an,Nan’an 362300,China)

Objective:TheoptimumprocessofextractingsaponinsfromAcaudina Molpadioideswithethanolwasstudied.Method:Basedonsinglefactorexperiments,responsesurfacemethodologywereadoptedtoanalyzetheeffectofeachfactorinethanolconcentration,extractiontemperature,extractiontimeandsolid-liquidratioontheextractionofsaponinsfromseacucumber.Theresultsshowedthattheoptimalextractionconditionswereasfollows:concentrationoftheethanol79%,extractiontime2.75h,extractiontemperature73.5 ℃,solid-liquidratio1∶1.7g/mL.Theimpactsoffactorsonyieldofsaponinsfromstrongtoweakweresolid-liquidratio,ethanolconcentration,extractiontimeandextractiontemperature.Anexperimentalsaponinsyieldof0.378%wasobtainedundertheseconditions,whichbasicallyaccordedwiththemodelpredictedvalue.Conclusion:Theobtainedmodelwascredibleandcouldbeusedforactualprediction.

Acaudina Molpadioides;saponins;extraction;Responsesurfacemethodology

2016-06-01

蘇永昌(1982- )，男，碩士，助理研究員，從事海洋天然活性物質開發利用研究，E-mail:suyongchang5@126.com。

國家海洋經濟創新發展區域示范項目(2014FJPT01)；福建省海洋高新產業發展專項項目[2013]026號；福建省省屬公益類科研院所基本科研專項(2016R1003-12)；廈門南方海洋研究中心項目(14PZY017NF17)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)21-0205-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.031