雙酶法提取豆豉多糖的工藝研究

吉義平,費 珊,丁彩梅

(武漢設計工程學院食品與生物科技學院,湖北武漢 430205)

?

雙酶法提取豆豉多糖的工藝研究

吉義平,費 珊,丁彩梅

(武漢設計工程學院食品與生物科技學院,湖北武漢 430205)

在單因素實驗基礎上應用正交實驗設計法對雙酶法提取豆豉多糖的工藝進行了優化。優化后的最佳提取工藝為:首先在料液比1∶20 (g∶mL)、pH7.0和溫度50 ℃的條件下,添加2.0%的木瓜蛋白酶進行水解150 min。然后在料液比1∶20 (g∶mL)、pH7.0和55 ℃的條件下繼續添加2.5%的風味蛋白酶水解150 min,兩次分步酶解后測得多糖得率為15.90%。此優化后的豆豉多糖提取工藝合理、可行且得率較高。

豆豉,多糖,雙酶法

豆豉是我國傳統的四大發酵豆制品之一,不僅營養價值高,而且具有許多獨特的生理調節作用[1-3],主要的有效生物活性成分如豆豉多肽[4-6]、異黃酮[7]和豆豉多糖[2]等。研究報道稱,其中的豆豉多糖除了具有清除自由基作用之外[8],還具有修復糖尿病小鼠腎臟和胰腺的作用[9]以及抑制α-葡萄糖苷酶的作用[10-11]。但是,國內外有關豆豉多糖提取方法的研究卻不多。已見報道的方法主要有熱水浸提法[12]、回流提取法[13]和超聲輔助提取法[14],其中熱水浸提法和回流提取法的提取時間長且效率低,超聲輔助法雖然具有操作較為簡單,提取率相對較高、操作時間相對較短等諸多優點,但是有報道稱超聲可使大分子量的多糖降解為較小分子量的多糖從而改變其生物活性[15]。諸些方法的提取率普遍較低,如超聲提取法僅為0.91%[14],且提取產品中往往含有大量的蛋白質和色素[15]。這是因為植物多糖通常被包裹在植物細胞壁內,并與蛋白質結合以蛋白多糖的形式存在。研究表明酶解法能有效地酶解與多糖結合在一起的蛋白質,從而提高多糖的提取率的同時還能保持多糖的構象與生物活性[16]。酶解法[17]尤其是雙酶法[18-20]在多糖的提取中發揮了重要的作用,但是尚未見應用于豆豉多糖的提取。因此,本實驗在單因素的基礎上,采用正交設計實驗法對豆豉多糖的雙酶法提取工藝進行優化,旨在為豆豉多糖的提取及其實際應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆豉 市售;纖維素酶(>2.5萬U/g)、風味蛋白酶(>2.0萬U/g)、胰蛋白酶(25萬U/g)、酸性蛋白酶(5萬U/g)、木瓜蛋白酶(>10萬U/g) 均購自上海金穗生物科技有限公司;石油醚、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、檸檬酸 均購自國藥集團;其他試劑均為國產分析純。

XFB-200高速中藥粉碎機 湖南吉首忠誠制藥機械廠;TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠;UV-2000紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;SHZD抽濾機 鞏義市亭華有限責任公司;HH-2水浴鍋 金壇市醫療儀器廠;DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;FA1004B MA*100 g分析天平 上海越平科學儀器有限公司;DZ-1A臺式真空干燥箱及真空泵 深圳市鑫科化實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆豉多糖的提取工藝流程 取一定量的豆豉于60 ℃下烘干至恒重,用高速組織粉碎機粉碎,過40目篩。粉末置于索氏提取器中,加入30～60 ℃的石油醚溶液,在50 ℃下回流提取6 h,低溫干燥至恒重,即得到脫脂后的粉末備用。按照1∶20(g∶mL)的料液比添加特定pH的緩沖溶液于干燥后的豆豉粉末中,置于一定溫度下的水浴鍋中,添加一定量的酶溶液恒溫水解一定時間后升溫至90 ℃滅酶10 min,冷卻后調整pH和水浴溫度,繼續添加第二種酶溶液進行第二酶解。酶解結束后升溫至90 ℃滅酶10 min,冷卻、減壓抽濾,取濾液采用sevage試劑法除蛋白后,濾液進行60 ℃真空濃縮后,添加一定量的無水乙醇使其乙醇濃度達到95%后靜置24 h后于低速離心機中4500 r/min下離心10 min。所得沉淀用95%乙醇重復洗滌兩次后,置于真空干燥箱中60 ℃下干燥至恒重即得豆豉多糖粉末。

1.2.2 酶種類的考察實驗 按照1.2.1的方法提取豆豉多糖,提取條件分別為:固定反應條件為料液比1∶20(g∶mL),酶添加量0.1%,酶解時間120 min,酶解pH和酶解溫度分別選擇對應酶的最適pH和溫度,考察酶的種類(纖維素酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶)對多糖得率的影響。固定取樣量2.0 g,料液比1∶20(g∶mL)進行實驗。

1.2.3 木瓜蛋白酶的單因素實驗 固定pH7,酶解溫度50 ℃,酶解時間120 min,比較1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的木瓜蛋白酶添加量對多糖得率的影響;固定pH7,酶解溫度50 ℃,酶添加量2.5%的條件下,比較30、60、90、120、150、180 min的酶解時間對多糖得率的影響;固定pH7,酶添加量2.5%,酶解時間120 min,比較45、50、55、60、65、70 ℃的酶解溫度對多糖得率的影響;固定酶解溫度50 ℃,酶添加量2.5%,酶解時間120 min,比較3、4、5、6、7、8的pH對多糖得率的影響。

1.2.4 風味蛋白酶的單因素實驗 固定pH7,酶解溫度50 ℃,酶解時間120 min,比較1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的風味蛋白酶的添加量對多糖得率的影響;固定pH7,酶解溫度50 ℃,酶添加量3.0%,比較30、60、90、120、150、180 min的酶解時間對多糖得率的影響;固定pH7,酶添加量3.0%,酶解時間120 min的條件下,比較45、50、55、60、65、70 ℃的酶解溫度對多糖得率的影響;固定酶解溫度55 ℃,酶添加量3.0%,酶解時間120 min的條件下,比較3、4、5、6、7、8的pH對多糖得率的影響。在這兩個單因素實驗的基礎上,以兩種酶的酶添加量和酶解時間兩個因素的3個較優水平進行正交實驗,確定豆豉多糖的最優雙酶提取條件。

1.2.5 正交實驗 根據單因素實驗結果,分別選取較佳兩種酶的酶添加量和酶解時間為因素,每個因素選取三個對多糖得率影響較大的水平進行正交實驗,因素水平表見表1。

表1 正交因素水平Table 1 Level of orthogonal factors

1.2.6 豆豉多糖得率的計算 按照1.2.1提取的豆豉多糖沉淀用蒸餾水溶解定容,最后取一定體積稀釋到適當濃度后進行測定。采用苯酚-硫酸法[21]測定豆豉多糖的含量,葡萄糖的標準曲線方程為y=6.4918x+0.0534,R2=0.9918。多糖得率計算如式(1):

式(1)

式中:x-相當于葡萄糖的濃度,mg/mL;V1-測定時的取樣體積,mL;V2-測定樣品時的定容體積,mL;V3-提取液的定容體積,mL;m-取樣樣品的質量,g。

2 結果與分析

2.1 不同酶對豆豉多糖得率的影響

由表2分析可知,五種類型酶中,木瓜蛋白酶和風味蛋白酶對豆豉多糖的得率較高,分別為7.23%和5.90%,這間接地表明豆豉中含有的纖維素、果膠、蛋白質等非多糖類大分子物質,形成了較為致密的結構,甚至一部分與多糖結合了起來,大大阻礙了多糖的浸提過程中的釋放。所以酶法提取可以降解非多糖類物質,使細胞內外的豆豉多糖更有效地被提取出來。本實驗選擇木瓜蛋白酶和風味蛋白酶作為雙酶提取的優選酶制劑,首先分別優化兩種酶的較佳酶解單因素條件,然后利用正交實驗確定出雙酶法的較優酶解工藝條件。

表2 不同類型酶對多糖提取率的影響Table 2 Effect of enzyme typeson extraction yield of douchi polysaccharides

2.2 木瓜蛋白酶酶解條件的篩選結果

圖1 木瓜蛋白酶不同單因素對豆豉多糖得率的影響Fig.1 Effect of single-factor of papain on extraction yield of douchi polysaccharides

由圖1a可知,在1.0%～2.5%范圍內,隨著木瓜蛋白酶酶添加量的增加,多糖的得率不斷增加,但是當酶用量繼續增加時,多糖的得率反而下降。這是因為在一定的酶量范圍內,隨著酶量的增加,酶與底物接觸的機會增加,水解速率加快,同一時間內獲得更多的多糖。但是當酶用量達到一定程度后,過高的酶用量已經處于飽和狀態,反而會抑制了酶促反應的進行,降低水解的速率,所以木瓜蛋白酶的較佳添加量為2.5%。

木瓜蛋白酶酶解時間對多糖得率的影響結果如圖1b所示。隨著酶解時間的延長,多糖的得率也隨之增加,在120 min時達到最大值。隨著時間的繼續延長,得率出現了下降趨勢。這是因為隨著酶解速率一定的條件下,酶解時間的增加會促進更多多糖的解離而溶出,提高多糖的得率。隨著酶解時間的進一步增加,多糖的得率隨之減小,原因可能是因為酶反應時間過長,導致酶的失活甚至導致部分多糖分解或者結構發生而變化,從而導致多糖得率下降。所以木瓜蛋白酶較佳酶解時間為120 min。

從圖1c可以看出,隨著溫度的升高,多糖得率也隨之增加。在木瓜蛋白酶中50 ℃后,隨著溫度的升高,多糖得率逐漸降低。主要原因是隨著溫度的上升,酶的活性逐漸降低,且較高的溫度會影響多糖的穩定性,從而導致多糖得率降低。故木瓜蛋白酶的較佳酶解溫度為50 ℃。

從圖1d可以看出過低的pH不利于木瓜蛋白酶活性的充分發揮,從而影響多糖的提取,當pH7.0時,木瓜蛋白酶的多糖得率最大,由此表明該實驗中木瓜蛋白酶的較佳pH為7.0,過酸或者過堿都會導致酶的結構發生改變,影響酶與底物的親和力,從而導致多糖得率減小。所以木瓜蛋白酶的較佳酶解pH7.0。綜合可知,木瓜蛋白酶的較佳酶解條件為:酶添加量2.5%、pH7.0、溫度50 ℃、酶解時間120 min。

2.3 風味蛋白酶酶解條件的篩選結果

從圖2a可以看出,隨著風味酶添加量的增加,多糖的得率也隨之增加。表明該豆豉多糖的提取過程中,風味蛋白酶對蛋白質或蛋白質-多糖結合物的酶解,有利于多糖的分離與溶出。而過高的酶用量不但增加經濟成本,反而抑制了酶解反應的進行,從而導致得率的下降。所以風味蛋白酶的較佳添加量為3.0%。

從圖2b可以看出,隨著風味蛋白酶酶解時間的增加,多糖的得率先增加后下降。分析原因是酶解時間較短,酶解不完全充分,而多長的時間不斷不能顯著地增加豆豉多糖的得率,反而使多糖的穩定性下降。綜合考慮,風味蛋白酶較佳酶解時間為120 min。

由圖2c可以看出,從45 ℃開始,在所優化的溫度范圍內,隨著溫度的升高,多糖得率也隨之增加。在風味蛋白酶中55 ℃時,達到最大值。隨著溫度的進一步繼續升高,多糖得率開始不斷下降。主要原因55 ℃以內的溫度升高有利于酶催化反應能量的增加,加快反應速率,但當超過風味蛋白酶的最適溫度55 ℃后,酶的活性逐漸降低,從而導致多糖得率降低。在酶解溫度單因素實驗中,所以本實驗中,風味蛋白酶的較佳酶解溫度為55 ℃。

由圖2d可知,當pH為3.0時,豆豉多糖的得率最低,表明較強的酸性環境大大抑制了風味蛋白酶的活性;當pH升高至7時,多糖得率達到最大值11.65 g/100 g,之后升高的pH8反而使多糖得率減小。表明該實驗中的風味蛋白酶的較合適酶解pH為7。綜合可知,風味蛋白酶的較佳酶解條件為:酶添加量3.0%、pH7.0、溫度55 ℃、酶解時間120 min。

圖2 風味蛋白酶不同單因素對豆豉多糖得率的影響Fig.2 Effect of single-factor of papain on extraction yield of douchi polysaccharides

表3 不同酶解方式對豆豉多糖得率的影響Table 3 Effect of enzymatic method on extraction yield of douchi polysaccharides

注:木瓜蛋白酶-風味蛋白酶指分步酶解,即先木瓜蛋白酶酶解后再進行風味蛋白酶水解;木瓜蛋白酶+風味蛋白酶指添加混合酶后一起酶解。2.4 雙酶法提取豆豉多糖的工藝研究

2.4.1 雙酶法酶解方式的確定 在上述篩選出的結果基礎上,分別稱取一定量的豆豉粉末,固液比1∶20(g∶mL),分別按照表3中的五種方式進行酶解,分析表3各方式下多糖的得率可知,5種不同的酶解方式獲得的多糖得率存在一定的差異。其中,相比較于直接雙酶混合酶解而言,分步酶解的多糖得率更高。且分步酶解中,先木瓜蛋白酶水解后再進行風味蛋白酶的水解方式得率較高。這是因為兩種不同的蛋白酶,水解的物質和部位各不相同,兩者結合一起的模式更有利于水解的充分性,從而提高了豆豉多糖的釋放與溶出,且分步的水解模式,使每一種酶均能在各自的最適環境條件下進行最高程度的酶解,且具有一定的相繼互補性,能逐步地將豆豉中的蛋白質及蛋白-多糖結合物水解,從而提高了多糖的得率。所以,本實驗選擇木瓜蛋白酶和風味蛋白酶的雙酶分步酶解方式來提取豆豉中的多糖,并對其工藝條件進行進一步的優化。

2.4.2 雙酶法的工藝優化 根據單因素實驗結果,設計出的正交實驗方案和實驗結果如表4所示。由表4可知,故極差分析可得各因素的最佳搭配為A1B2C3D3,此組合并未在正交中出現,所以經過驗證實驗后得出多糖得率為15.90 g/100 g,大于9組正交實驗中的最大組15.59 g/100 g。所以最佳的提取工藝條件為A1B2C3D3:即在pH7.0,溫度50 ℃條件下,木瓜蛋白酶添加量為2.0%,水解150 min后,滅酶冷卻;升溫至55 ℃,風味蛋白酶添加量為2.5%,水浴150 min后90 ℃滅酶冷卻后測定,多糖得率最大為15.90 g/100 g。

3 結論

本實驗采用酶解法對豆豉多糖的提取條件進行了優化。實驗結果表明不同的酶對豆豉多糖的得率影響表現出一定的差異性,其中木瓜蛋白酶和風味蛋白酶效果較好。進一步研究對比發現,該兩種酶的分步酶解較混合酶的一步酶解對多糖的提取效果更好。最后采用正交實驗對分步酶解的提取工藝進行了優化,最佳條件為:在pH7.0,溫度50 ℃條件下,木瓜蛋白酶添加量為2.0%,進行第一步酶解150 min后,90 ℃滅酶冷卻,待升溫至55 ℃后,添加2.5%風味蛋白酶,恒溫酶解150 min后,所得的多糖得率高達15.90 g/100 g(干基),且通過實驗測得該多糖中的蛋白質含量很低,可以忽略不計。該結果遠高于目前文獻報道[12]中的豆豉多糖得率(2.81%,干基),也高于大豆[19]中的多糖含量(9.28%,干基)。前者結果差異較大的原因有待后續進一步實驗研究,初步分析可能為豆豉中的多糖多為與蛋白結合的多糖,故本論文中兩種蛋白酶的使用破壞了蛋白多糖的結合作用,從而大大提高了多糖的溶出。后者的差異表明大豆發酵生產豆豉的過程中,多糖的含量有一定程度的升高,這與文獻中報道的結果[22]相吻合。綜合分析可知,該提取工藝可為豆豉多糖的提取及其下一步深入應用提供一定的參考作用。

表4 正交數據表Table 4 Data of orthogonal experiment

[1]蔡尤林,杜冰,余飛,等. 豆豉營養成分及研究進展[J]. 中國調味品,2015,40(6):119-123.

[2]牛廣財,賈亭亭,魏文毅,等. 淡豆豉的研究進展[J]. 中國釀造,2013,32(9):1-4.

[3]Fan J,Zhang Y,Chang X,Saito M,et al. Changes in the radical scav-enging activity of bacterial-type douchi,a traditional fermented soybean product,during the primary fermentation process[J]. Bioscience Biotechnology Biochemistry,2009,73:2749-2753.

[4]Sanjukta S,Rai A K. Production of bioactive peptides during soybean fermentation and their potential health benefits[J].Trends in Food Science & Technology,2016,50:1-10.

[5]Sanjukta S,Rai A K,Muhammed A,et al. Enhancement of antioxidant properties of two soybean varieties of Sikkim Himalayan region by proteolytic Bacillus subtilis fermentation[J].Journal of Func-tional Foods,2015,14:650-658.

[6]Zhang J H,Tatsumi E,Ding C H,et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides in douchi,a Chinese traditional fermented soybean product[J].Food Chemistry,2006,98:551-557.

[7]索化夷,騫宇,盧露,等. 永川豆豉傳統發酵過程中的大豆異黃酮變化[J]. 食品科學,2012,33(8):270-273.

[8]Wang D,Wang L J,Zhu F X,et al.Invitroandinvivostudies on the antioxidant activities of the aqueous extracts of Douchi(a traditional Chinese salt-fermented soybean food)[J].Food Chemistry,2008,107:1421-1428.

[9]劉正猛,翟麗,郭瑞華,等. 豆豉多糖修復糖尿病小鼠腎臟

和胰腺作用的研究[J]. 中國煤炭工業醫學雜志,2005,8(12):1345-1346.

[10]Chen J,Cheng Y Q,Yamali K,et al. Anti-a-glucosidase activity of Chinese traditionally fermented soybean(douchi)[J]. Food Chemistry,2007,103:1091-1096.

[11]郭瑞華,翟麗,劉正猛,等. 豆豉及其多糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究及豆豉中姜湯有效成分的初步分析[J]. 中藥材,2005,28(1):38-40.

[12]勞鳳云,李小娜,王洪波. 淡豆豉多糖的提取工藝研究[J]. 現代預防醫學,2008,35(9):1691-1692.

[13]郭瑞華,翟麗,劉正猛,等. 豆豉多糖的提純及成分分析[J]. 時珍國醫國藥,2006,17(4):512-514.

[14]張靜,葛喜珍,田平芳,等. 淡豆豉中豆豉多糖、大豆異黃酮的超聲提取及含量檢測[J]. 中藥材,2007,30(12):1532-1534.

[15]王小梅. 超聲對麥冬多糖結構/溶液行為及生物活性影響的研究[D]. 西安:陜西師范大學,2013.

[16]鄒偉,張寶善,李冰,等. 水浴振蕩輔助酶法提取雙孢蘑菇多糖的工藝研究[J]. 食品工業科技,2011,(5):223-224,334.

[17]張軍瑞,陳健. 木瓜蛋白酶酶解白底輻肛參提取多糖的研究[J]. 現代食品科技,2009,25(5):542-545.

[18]陳瑞平,陳瑞戰,張敏,等. 復合酶法提取大蒜多糖及其抗氧化活性研究[J]. 分子科學學報,2012,28(1):48-52.

[19]宋慧,苗敬芝,董玉瑋. 雙酶法提取大豆多糖及其抗氧化性研究[J]. 中國食品添加劑,2011(5):89-93.

[20]賈麗艷,任盛財. 復合酶法提取零余子多糖工藝的優化[J]. 山西農業大學學報(自然科學版),2013,33(2):130-135.

[21]高明俠,苗敬芝,曹澤虹,等. 雙酶法提取牛蒡多糖的研究[J]. 食品科學,2008,29(9):260-262.

[22]葉德軍,黃占旺. 豆豉多糖生產工藝優化研究[J]. 中國調味品,2014,39(1):47-49.

Research on dual-enzymatic extraction of polysaccharides from Douchi

JI Yi-ping,FEI Shan,DING Cai-mei

(College of Food and Biology Science and Technology,Wuhan Institute of Design and Sciences,Wuhan 430205,China)

Basedonthesinglefactorexperiments,theorthogonalexperimentaldesignwasemployedtooptimizetheextractionconditionsofpolysaccharidefromdouchiviadual-enzymatic.Theresultsshowedthattheoptimumdual-enzymaticextractingconditionswereasfollows:firstly,theratioofwatertorawmaterial1∶20(g∶mL),pH7.0andextractiontemperature50 ℃,enzymedosageofpapain2%andhydrolysistime150min.Secondly,pH7.0andextractiontemperature55 ℃,withflavourzyme2.5%,hydrolysistime150min.Underthesestepbystepenzymatichydrolysisconditions,theextractionyieldwas15.90%.Theoptimizationofextractionprocesstechnologyofpolysaccharidesfromdouchiwasreasonableandfeasibleandyieldwashigher.

douchi;polysaccharides;dual-enzymatic

2016-04-01

吉義平(1984-),女,碩士,講師,研究方向:食品功能性成分的提取純化、檢測及其應用,E-mail:343677874@qq.com。

武漢設計工程學院校科研項目(201302)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)21-0260-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.041