EST-SSR標記在谷類作物中的通用性研究進展

趙雅楠,王 穎,2,張東杰,*,沈 琰,楊義杰

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江大慶 163319;2.國家雜糧工程技術研究中心,黑龍江大慶 163319)

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EST-SSR標記在谷類作物中的通用性研究進展

趙雅楠1,王 穎1,2,張東杰1,*,沈 琰1,楊義杰1

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江大慶 163319;2.國家雜糧工程技術研究中心,黑龍江大慶 163319)

EST-SSR標記是基于表達序列標簽(Express Sequence Tags,EST)開發簡單重復序列(Simple Sequence Repeats,SSR)的一種與功能基因直接相關的新型分子標記技術,因其在不同作物間具有較好的通用性而被廣泛應用于作物基因組學研究。不同谷類作物間EST-SSR的通用性可降低引物開發成本、提高效率,為遺傳研究較薄弱的作物奠定基礎。文章概括介紹了EST-SSR標記,對其在不同谷類作物間及相比較于G-SSR標記的通用性情況進行簡單歸類分析,評述了EST-SSR標記的不足及其優化措施,以期利用EST-SSR高通用性的特點推動谷類作物基因組學的發展。

EST-SSR,谷類作物,通用性

谷類作物是農業生產中最重要的糧食作物,不僅為人體提供大部分熱能和蛋白質,還提供多種人體所需的營養物質,是人類生存的重要儲備糧食。隨著人們生活水平、健康意識及膳食結構水平的不斷提高,國內外市場對谷物及谷物加工食品的需求量逐漸上升,使我國在谷物育種、谷類食品加工等方面快速發展,取得了卓越成就[1]。目前,大豆[2]、小麥[3]、大麥[4]等大宗谷類作物已完成了遺傳連鎖圖譜的構建,并對一些重要的農藝性狀如抗性[5]、株高[6]等進行了QTL定位,育成了多批高產優質多抗的新品種,在谷物食品生產加工中發揮重要作用。He[7]等在面包焙烤加工研究中發現面筋強度、淀粉含量是影響面包品質的重要因素,提出在選擇小麥原料時要考慮篩選含有高低分子量谷蛋白亞基和硬度基因Pinb-D1b的培育品種,而用于制作面條的品種則要求含有Wx-B1缺失基因及可標記低含量多酚氧化酶活性的STS標記以保證面條硬度適宜、顏色白亮。可見,谷物食品加工業與谷物育種工作息息相關,對未來谷物育種方向具有一定的指導作用。

表達序列標簽(express sequence tags,EST)是一段在cDNA文庫中隨機克隆的長度在150～500 bp的表達序列,可以代表某一生物體的某個組織在特定時空條件下的一個表達基因。簡單重復序列(Simple Sequence Repeat,SSR)是一類由1～6個堿基組成的基元串聯重復的DNA序列,在基因組中廣泛存在[8]。而表達序列標簽微衛星(EST-SSR)是一種在EST范圍內開發SSR的新型分子標記技術,與傳統SSR分子標記相比具有費用低、耗時短的優點,可避免測序、建庫等繁瑣步驟[9]。同時,EST是具有表達功能的DNA序列,僅占整個基因組的2%左右,可以忽略其余98%的“junk DNA”,直接獲得基因表達的信息,在很大程度上縮小了基因的篩選范圍,真正實現高效、經濟、簡便[10-11]。此外,由于EST來自編碼區,其保守性遠遠高于來自非編碼區的DNA序列,因此EST-SSR標記在種屬、甚至是遠緣作物之間具有較好的通用性[12]。EST-SSR標記的通用性分析,既為一些遺傳研究較落后的作物,提供了開展現代基因組學研究的基本分析工具,促進種間遺傳信息的借鑒、交流,也有助于研究近緣種間的遺傳演化規律等。本文從EST-SSR標記在不同種屬間谷類作物的通用性進行論述,同時相較于G-SSR(Genomic-SSR)標記通用性情況進行分析,并對其今后在基因組研究中的深入利用進行了討論和展望,以期為EST-SSR標記開展遺傳多樣性分析、基因定位等研究人員提供參考。

1 EST-SSR標記

EST是指mRNA逆轉錄成cDNA,利用噬菌體或質粒作為載體,形成cDNA文庫后,大規模的在cDNA文庫中隨機挑選克隆,對3′端或5′端進行一步法測序,形成的一段大小在150～500 bp、具有特異性的DNA片段,可以反映出mRNA的部分信息。盡管不同作物EST中SSR的分布頻率各不相同,但研究表明,8%的EST序列中存在SSR,其中近半數可以成功設計引物,EST-SSR標記則是根據這一特點在EST中篩選含有SSR的序列,根據序列兩端側翼具有高度保守性的特點為其設計引物,經PCR擴增和凝膠電泳檢測,將得到的EST序列與數據庫中的已知資源進行blast比對,判斷其可能代表的功能或信息[13]。EST技術的不斷成熟使其在不同物種間的應用也更加廣泛和深入,隨著DNA測序技術的不斷發展,EST資源數據庫不斷充實,可以根據需求直接獲取,但并非所有的EST-SSR都可以成功設計引物。首先要利用SSR篩選軟件在EST數據庫中進行可利用性篩選,通過拼接和聚類將質優、無冗余的EST留下。通常根據核苷酸的核心序列重復次數選擇,如二核苷酸,n≥10,三核苷酸,n≥7等,需要注意的是,不同軟件的篩選條件和計算標準各不相同,在設計篩選參數時一定要寬嚴適中,否則會導致SSR不精準或拼接錯誤。為提高數據的準確性,在篩選SSR時可以將幾種軟件結合使用,相互驗證篩選結果。EST-SSR的引物設計一般遵循以下原則:引物長度在20 bp左右,(C+G)含量盡量控制在50%,SSR兩端距3′端或5′端20 bp以上,且3’端末尾不能是T或A等[14]。

近些年,隨著EST-SSR技術的不斷發展,其應用領域及研究內容也不斷拓展,在谷類作物品質性狀評價、果實營養成分研究中應用廣泛,為谷類作物營養物質合成分子機制研究及品質改良提供理論依據和技術支持。姜鵬[15]等基于SSR分子標記技術發現了一些與“寧麥9號”低蛋白質含量、低面筋強度等優質性狀相關聯的等位變異;林延慧[16]等構建了包括18個連鎖群的大豆分子連鎖圖譜,得到4個與大豆蛋白質含量相關的QTL;梁慧珍[17]等對與大豆異黃酮、脂肪及蛋白質含量相關的基因進行定位,共檢測到23個與上述重要品質性狀相關的QTL并準確定位到各連鎖群,同時在相關性研究中發現大豆中蛋白質含量分別與異黃酮及脂肪含量呈極顯著負相關,為進一步明確大豆中各營養成分關聯關系及大豆優質品質性狀在染色體的具體位置及效應提供重要價值,對促進大豆品質性狀優化具有重要意義;張曉娜[18]等利用179對SSR引物構建了水稻遺傳連鎖圖譜,得到4個能夠控制糙米中維生素E含量的QTL;劉克琦[19]利用SSR技術對水稻中維生素A含量與水稻米色性狀關聯關系進行研究,發現水稻中維生素A性狀由至少兩對獨立顯性基因控制,而與米色沒有直接關系,為水稻中維生素種類及合成機制研究及富含維生素水稻品種的選育與推廣奠定基礎。禾谷類作物中的維生素、蛋白質、脂肪等都是重要的品質性狀,EST-SSR標記技術可通過尋找影響各品質性狀含量的QTL,明確谷類作物中部分EST-SSR序列特征及與營養成分的關聯性,利用克隆、雜交等手段將傳統谷類作物進行品質改良,最終實現作物品質優化,突出各谷類作物功能特性使其滿足人們在日常攝食過程中對營養物質的需求。

2 EST-SSR標記在不同谷類作物間的通用性分析

隨著測序技術的不斷發展,各種作物EST序列的開發數量急劇上升,發掘未知EST-SSR位點,揭示更多基因信息成為分子生物學研究的重要目標。但由于部分谷類作物的分子標記研究起步較晚,已知的EST序列數量較少,遺傳研究基礎相對薄弱,因此,近緣物種轉移法逐漸成為發展EST-SSR標記的有效方法[20]。幾種谷類作物EST-SSR的通用性情況見表1。同一種屬作物間,EST-SSR側翼序列具有高度的保守性和相似性,因此,一套EST-SSR引物可以通用于同一種屬間的不同作物,一部分引物能夠擴增出清晰的條帶,甚至具有很好的多態性,特別是近緣作物之間,親緣關系越近,同源序列越多,擴增效果越好。EST-SSR在不同谷類作物間具有良好的通用性,將一種已研究成熟作物中開發出的EST-SSR引物通用于其他作物,可降低開發成本、提高效率、擴充EST數據資源、促進不同作物間基因信息的交流、推動作物基因組學發展。

表1 幾種谷類作物EST-SSR的通用性情況Table 1 The transferability of EST-SSR in different crops

2.1 EST-SSR標記在種間不同谷類作物的通用性分析

近些年,EST數量呈指數級快速增長,為作物EST-SSR的開發提供了廣闊空間。張體付[23]等隨機挑選了119對藜麥EST-SSR引物,對4個同屬不同種藜麥資源的研究表明通用性比率為55.9%。李曉嵐[25]等利用40對烏拉爾甘草引物構建了4種、22份甘草屬材料的EST-SSR指紋圖譜,并對其進行聚類分析,發現有效擴增率為100%,其中15對引物可產生多態性條帶,共獲得59個等位基因,多態性比率為89.4%。郭紅媛[26]等利用40對燕麥EST-SSR引物分析了另外15份燕麥種質資源的遺傳多樣性,共獲得89個等位基因,對其進行聚類分析,在相似系數為0.93時可將其分為3類。進一步利用上述40對EST-SSR引物鑒定31份遺傳信息不明確的燕麥種質資源的基因組倍性,發現應試種質中可能存在新的燕麥資源。以上數據表明,谷類作物種間基因同源性較高,EST-SSR標記在谷類作物種間具有良好的適應性和通用性,得到的引物與傳統途徑開發的EST-SSR標記一樣,均可應用于遺傳研究中,在谷類作物種間親緣關系分析、指紋圖譜數據構建、種質資源鑒定、基因組鑒定等方面發揮重要作用。

2.2 EST-SSR標記在屬間不同谷類作物的通用性分析

EST-SSR不僅可以通用于同屬間近緣作物,在許多不同屬作物間也具有一定的轉移性。宿俊吉[27]將351對小麥EST-SSR引物通用于四倍體冰草中,其中314對引物能成功擴增,通用性比率高達89.5%。龔亞明[28]等設計了163對豌豆EST-SSR引物,以26份蠶豆為模板驗證其通用性,發現其中99對可產生有效擴增,通用性比率為61%,其中36對引物具有多態性,平均等位基因數為4.1,平均PIC值達0.48,聚類分析顯示可將應試的26份蠶豆資源劃分成兩大類。Varshney等[29]選取了165對大麥EST-SSR引物驗證其在小麥、黑麥以及水稻中的通用性,發現通用率分別為78.2%、75.2%、42.4%,且在各應試品種的擴增產物中均檢測出不同程度的多態性片段。EST-SSR標記在不同屬谷類作物間具有一定的通用性,這極大豐富了谷類作物的SSR標記信息,在一定程度上緩解了部分谷類作物SSR引物數量少、多態性低的現狀,同時得到的多態性引物在谷類作物的遺傳多樣性分析、聚類分析、屬間資源親緣關系驗證等研究中具有較好的適用性,特別是對于一些研究進步晚、開發標記數量少的谷類作物,利用近緣作物轉移法將一些開發成熟作物的EST-SSR標記進行通用,在節約開發成本的同時可以加強屬間作物的基因交流,豐富基因信息,對其他近緣作物的分子標記開發起到借鑒作用,為其基因組信息開發提供新的思路與途徑。

EST-SSR序列的通用性在不同作物間各不相同,其通用性高低在一定程度上受二者遺傳關系的影響。SahaP[30]等將145對高羊茅EST-SSR引物通用于黑麥草、草甸羊茅、小麥及水稻中,通用性比率分別為86%、83%、71%、59%,表明通用性比率與應試品種和高羊茅的親緣關系遠近相關。EST-SSR翼序列的保守程度與作物親緣關系遠近相關,親緣關系越近,序列同源性越高,其引物通用性越好,一般來講,同屬(族)不同種作物間的通用性高于同科不同屬間作物的通用性[31]。鐘敏[32]研究綠豆SSR引物與其同屬作物豇豆(50%)與小豆(73.3%)間的通用性明顯高于陳明麗[33]研究的菜豆SSR引物在豇豆(43.9%)與小豆(38.2%)間的通用性。徐磊[34]將禾本科高粱EST-SSR引物通用于其同屬作物割手密中,通用性為70%,而李宏偉[35]將禾本科小麥的597對EST-SSR引物通用于其同科不同屬作物玉米中,僅有393對引物成功擴增,通用率為65.8%。此外,EST-SSR引物在親緣關系較遠的物種間也具有通用性。Savadi[36]、Backiyarani[37]等發現高粱、芭蕉的EST-SSR引物在花生(39%)、姜目(58%)中均具有一定的通用性。谷類作物間EST-SSR標記通用性研究為一些遺傳研究基礎較薄弱的作物提供了新思路,初步實現了EST-SSR標記的資源共享,充分利用了近緣作物間基因具有一定同源性的特點。與此同時,EST來源于編碼區,是對作物基因內部變異的直接評價,可以直接將標記與性狀或生理生化特征相聯系,為后續的基因定位等研究提供重要參考。

3 G-SSR標記與EST-SSR標記的通用性比較分析

SSR標記具有數量豐富、重復性好等特點,是一種比較成熟的分子標記技術,按照SSR來源可分為Genomic-SSR和EST-SSR,二者在谷類作物間具有不同程度的通用性。文明富[38]等將419對木薯EST-SSR引物和182對G-SSR引物通用于麻瘋樹和橡膠樹中,其EST-SSR引物和G-SSR引物在麻瘋樹的通用性比率分別為55.85%和37.36%,在橡膠樹中的通用性比率分別為38.9%和26.37%,木薯EST-SSR引物在麻瘋樹和橡膠樹中的通用性明顯高于其G-SSR引物。Yu[39]等將47對水稻EST-SSR引物和41對G-SSR引物分別通用于中國芒中,其中24對EST-SSR引物和17對G-SSR引物成功擴增,通用性比率分別為51%和41%,說明水稻SSR引物可通用于芒屬作物中,且其EST-SSR引物的通用性明顯高于G-SSR引物。丁西朋等[40]以4份柱花草為模板,探究103對G-SSR引物和117對EST-SSR引物的通用性情況。其中93對G-SSR引物可在至少一份供試材料中發生有效擴增,其中44對可以在4種供試材料中同時發生擴增,通用性比率為42.7%,117對EST-SSR引物中,98對是有效引物,其中81對可在4種供試材料中同時發生擴增,通用性比率為69.2%。Chandra等[41]也對柱花草的20對EST-SSR引物和21對G-SSR引物的通用性進行分析,發現EST-SSR標記的通用性比率高達86%,而G-SSR標記僅為45%,表明柱花草EST-SSR的通用性高于G-SSR。

G-SSR與EST-SSR的來源序列不同導致其引物通用性及多態性情況存在差異。G-SSR來源于基因間序列,而EST-SSR來源于轉錄區域。作為基因的一部分,EST-SSR中包含一些控制植物基本生理生化代謝、與其生命過程息息相關的基因。為縮小其后代與親本的遺傳差異,更好的保留親本優良特性,這部分基因在物種間往往具有較好的穩定性,不易突變,在生物進化過程中表現出的序列同源性和共線性更明顯[42-43]。因此,相較于G-SSR,EST-SSR位點在遺傳過程中更穩定,EST-SSR標記的通用性也普遍高于G-SSR標記。微衛星的多態性主要由于其復制過程中發生的滑動或染色單體的不等交換等原因產生的,主要表現為其核心重復單元種類及重復次數在同一物種的不同基因位點上迥然不同,而這部分多態性很有可能通過內含子表現出來,由于G-SSR與EST-SSR的序列來源不同,EST-SSR中不含有內含子,當用G-SSR引物擴增模板DNA時,很有可能將內含子擴增出,表現出的多態性一部分來源于內含子,而并不僅僅是微衛星的。此外,在生物進化過程中,作物的部分基因會受到搭載效應的影響,承受強選擇作用使其在群體中的遺傳多樣性降低,搭載效應在對作物生命休戚相關性狀的選擇中比較明顯,而對其它性狀選擇引起的選擇牽連效應較小[44-46]。因此,搭載效應可能使EST的多態性降低,一些關鍵性狀出現雜合變異的物種被淘汰,而EST序列來自編碼區,控制作物性狀,部分非關鍵性狀發生變異的作物卻能在生物進化和自然選擇過程中保留下來[47]。因此,EST-SSR引物的多態性普遍低于G-SSR。

綜上所述,谷類作物EST-SSR標記的通用性普遍高于G-SSR,而多態性則普遍低于G-SSR。但也存在特殊情況,賀潤麗等[48]分別選取66對大豆G-SSR引物和43對EST-SSR引物通用于6種不同來源的黃芪中,通用比率分別為31.82%和76.74%,多態性比率分別為18.18%和53.49%,表明經過篩選的大豆G-SSR和EST-SSR均可通用于黃芪中,且EST-SSR的通用性比率和多態性比率均高于G-SSR。程雪妮[49]等將小麥的203對SSR引物和46對EST-SSR引物通用于無雀麥芒中,其中137對(67.49%)SSR引物和30對(65.22%)EST-SSR引物成功擴增,表明小麥G-SSR和EST-SSR在無芒雀麥中都具有一定的通用性,但是G-SSR標記的通用性高于EST-SSR,這與前人的研究結果正好相反。出現這種現象可能因為所選取的EST-SSR標記數量較少,不能準確、全面的反映出作物的基因組信息。此外,還可能與所選取EST-SSR標記的來源有關。研究證明,來源于3′UTR和5′UTR的EST-SSR標記的多態性非常好,遠遠高于其它來源于編碼區的序列,可能其中部分EST-SSR標記來源于其基因的3′UTR和5′UTR,故而其整體多態性比率升高。SSR多態性高低是決定其是否能成為有效遺傳標記的關鍵,盡管EST-SSR的通用性較高,但其多態性較低仍是阻礙其應用于基因組學研究中的一塊短板。EST-SSR固有的高保守性特點使EST-SSR引物開發之后的多態性篩選、核心引物確定等工作難度較大,因此,在選擇EST-SSR標記時要充分考慮其多態性情況。在選擇EST-SSR標記時要參考其所在位置,盡可能選擇靠近高變異區的。同時,可以借鑒切割擴增多態性的方法,將沒有表現出多態性的擴增產物回收,利用限制性內切酶處理,進一步分析片段內部差異。此外,還可以提升檢測手段,使用分辨率更高的毛細管熒光電泳技術等。

4 討論與展望

作為人類重要的糧食作物,谷物籽粒不僅為人類提供極重要的營養物質,還可以作為原料生產主副食品,促進谷物及其食品加工業的發展。近些年,谷物因其特殊的營養品質及藥用價值已成為人們理想的健康食品,但由于一些小宗谷類作物的研究還不夠透徹,在育種及生產加工方面仍存在很多問題亟待解決,因此,要不斷拓展谷物研究領域,加強谷物中蛋白質、維生素、纖維素等營養品質性狀的研究,將分子標記技術與谷物育種有機結合,進行谷物育種實用性轉化,對谷物功能特性成分及作用機理進行深入研究,發掘谷物潛在特性,推動谷物及其食品加工業的發展,加強谷物的市場競爭力。

EST-SSR作為一種新型分子標記技術,在具備一般分子標記技術特點的同時還具有一些特殊優勢,已經在基因組學研究中起到重要作用,但也仍存在一定的缺陷。其一,開發EST時需要對3′端或5′端進行一步法測序,在這一過程中很容易出現測序錯誤,進而會影響EST數據庫的準確性。研究發現,EST數據庫中只有97%是精確的,錯誤數據會在判斷EST代表哪種基因功能或信息時產生影響;其二,在EST序列中篩選SSR位點時,由于選用軟件及參數設置的差異性和局限性,導致測序成本、效率及準確性均受到影響;其三,由于不同生物體的不同組織在不同時空條件下的基因表達頻率不同,導致cDNA文庫中的mRNA豐度各不相同,高豐度的EST一般具有冗余性,不利于提取,而低豐度的基因往往具有特異性,有很高的研究價值;其四,由于EST來源于編碼區,開發出的EST-SSR只能反映作物轉錄區序列的差異,而對于一些調控序列、內含子等位于非編碼區的信息差異則不能體現出來。為克服上述缺點,可從以下四個方面進行優化。第一,提高cDNA文庫質量。在構建cDNA文庫時,要盡可能的選取質量高、代表性強的材料,如在不同發育階段和環境條件下取不同器官的組織,這樣可以包含更多的基因信息。第二,利用減法雜交技術有效實現目的基因序列的富集,大幅度減少高豐度非特異性cDNA,提高低豐度cDNA所占比例。第三,進行特異性篩選以降低冗余性EST對測序的影響。第四,在對EST數據庫中的SSR進行可用性篩選時,可以將幾種篩選軟件有機結合,相互驗證篩選結果以提高準確性。

EST-SSR標記起步雖晚,但發展迅猛,隨著EST-SSR技術的不斷發展,EST數據庫逐漸豐富,EST-SSR標記在谷類作物間的通用性應用已成為作物基因發掘、親緣關系鑒定、遺傳多樣性分析等研究的可靠根據,目前已經在禾谷類、豆菽類等谷類作物中廣泛應用,在降低引物開發成本、提高研發效率等方面的優勢十分顯著。對不同谷類作物間EST-SSR標記通用性進行分析,將會快速推進種屬內不同作物基因結構和相關功能信息的開發,能夠使不同科屬作物間的基因研究成果相互交叉,形成合力,共同促進谷類作物基因組學的發展。

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Research progress in transferability of EST-SSR makers in grain crops

ZHAO Ya-nan1，WANG Ying1,2，ZHANG Dong-jie1，*，SHEN Yan1，YANG Yi-jie1

(1.College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy,Daqing 163319,China;2.National Coarse Cereals Engineering Research Center,Daqing 163319,China)

EST-SSRisanewmoleculemarkingtechnologytoexploitSimpleSequenceRepeats(SSR)basedonExpressSequenceTags(EST).Itwaswidelyusedinthestudyofcropgenomicsbecauseofitsgoodtransferabilityindifferentcrops.ThetransferabilityofEST-SSRindifferentgraincropscouldcutthecostsofprimersdevelopmentandimproveefficiency.Itcouldlaythefoundationofthecropsthatgeneticstudiesareweak.EST-SSRmakersanditstransferabilityindifferentgraincropscomparedwithG-SSRwereintroducedinthispaper.ThedisadvantagesandimprovementsinordertoacceleratethedevelopmentofcropgenomicsbyusingthehightransferabilityofEST-SSRwerereviewed.

EST-SSR;graincrops;transferability

2016-06-02

趙雅楠(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：農產品加工及貯藏工程，E-mail:zyn658@163.com。

*通訊作者:張東杰(1966-)，男，博士，教授，研究方向：農產品加工及貯藏工程，E-mail:byndzdj@126.com。

“十二五”農村領域國家科技計劃項目(2012BAD34B02)；黑龍江省應用技術與開發重大項目(GA14B104)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)21-0357-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.061