依卡倍特鈉對反流性食管炎大鼠食管黏膜的保護作用及可能機制

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依卡倍特鈉對反流性食管炎大鼠食管黏膜的保護作用及可能機制

目的：探討依卡倍特鈉(ES)對反流性食管炎大鼠食管黏膜病變的保護作用及其機制。方法：采用食管十二指腸吻合術建立大鼠RE模型，進行藥物干預。HE染色檢測各組大鼠食管黏膜損傷情況；ELISA檢測各組大鼠血清炎癥因子水平；Real-time PCR檢測食管內TNFα、IL-1、Cox2 mRNA表達；Western blot檢測食管內ERK及P38通路活化。結果：ES低、中、高濃度干預不同程度緩解了食管黏膜病變，降低血清中TNFα、IL-1β水平及食管中TNFα、IL-1、Cox2表達(P<0.05)，抑制ERK及P38通路的異常活化(P<0.05)。結論：ES通過抑制MAPK信號通路抑制TNFα、IL-1、Cox2的表達,影響炎癥因子的釋放和炎癥發生，從而緩解食管黏膜病變。

胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease, GERD)嚴重時可導致Barrett食管及食管癌[1]。反流性食管炎(Reflux esophagitis, RE)是胃食管反流病的一種。依卡倍特鈉(Ecabet sodium，ES)作為一種胃黏膜保護劑，可以選擇性的在胃黏膜損傷處形成保護層，改善內膜局部血流量，增強防御因子的作用，一直主要用于胃炎、胃潰瘍的臨床治療[2]，近年來開始進行RE治療方面的應用。有研究指出其對大鼠RE具有緩解作用[3]，但是具體分子機制尚未清楚。有報道指出，ES可能通過MAPK信號途徑保護腸上皮細胞損傷[4]。因此，本文擬建立大鼠混合反流性食管炎及依卡倍特鈉治療模型，研究MAPK信號通路及相關細胞因子變化情況，觀察ES對RE的治療作用是否與該信號通路相關，以期尋找臨床治療RE的理想藥物。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物:健康8周齡SD雄性大鼠70只，體重約200 g，購買自遼寧長生生物技術有限公司。

1.2 實驗儀器:微量移液器購自美國Eppendorf公司；離心機為美國Sigma公司產品；光學顯微鏡購自日本OLYMPUS；石蠟切片機購自德國Leica公司；電熱恒溫鼓風干燥箱購自上海精宏實驗設備公司；電熱恒溫培養箱購自天津泰斯特公司；超純水系統購自香港Heal Force公司。

1.3 實驗試劑:奧美拉唑為廣東逸舒制藥有限公司產品；依卡倍特鈉為天津田邊制藥有限公司產品；二甲苯、無水乙醇及曙紅Y(醇溶)均為國藥集團股份有限公司產品；蘇木精為Solarbio公司產品；大鼠血清TNFα及IL-1β ELISA檢測試劑盒為Boster公司產品；ERK、p-ERK、P38和p-P38抗體為沈陽萬類生物科技有限公司產品。

2 方 法

2.1 大鼠混合反流性食管炎模型建立及藥物干預：大鼠于實驗前在動物房環境中適應3 d，隨機分成對照組、假手術組、模型組、ES干預組(低、中、高劑量)及奧美拉唑(療效對照)組，每組10只，除對照組和假手術組外，其余組均按食管十二指腸吻合術進行反流性食管炎建模。具體方法為：先予10 %水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定于手術臺上，消毒后腹部正中切口，將食管下段分離，保留迷走神經，切斷食管，胃賁門端作荷包縫合，將胃曠置，距幽門端約l cm處縱行切開十二指腸壁約0.4～0.5 cm，與食管下端行端側吻合，然后逐層縫合腹部傷口。對照組不作任何處理，假手術組只開腹不做其他處理，15 min后逐層縫合腹部傷口。模型建立后0 d，ES干預組分別以20 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg給予低、中、高濃度的依卡倍特鈉灌胃，療效對照組以20 mg/kg給予奧美拉唑灌胃，對照組、假手術組、模型對照組給予等體積蒸餾水，每天給藥一次連續給藥2周。

2.2 蘇木精-伊紅(HE)染色：各組固定后的食管組織標本，經常規脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，約5 μm厚連續切片，每組隨意取10張切片用于HE染色，每組隨意抽取5張切片于200倍光鏡下觀察并拍照。

2.3 ELISA檢測血清中炎癥因子TNFα、IL-1β的水平：處死各組大鼠后，取血，于室溫下放置30 min左右待其凝固后,于離心機上3000 rpm離心10 min，取血清，參照說明書用TNFα及IL-1β ELISA檢測試劑盒檢測大鼠血清中TNFα、IL-1β的水平。

2.4 RT-PCR檢測食管組織TNFα、IL-1、Cox2 mRNA表達水平：取食管組織，正常提取組織總RNA，行Real time PCR擴增，用β-actin做內參。取5 μl的PCR產物，電泳、染色、成像，用Quantity One軟件行灰度分析，目的基因mRNA的表達值用基因產物與內參的灰度比值表示。

2.5 Western blot檢測ERK、p-ERK、P38、p-P38的表達及磷酸化：取食管組織，正常提取蛋白質，化學發光法顯色，對條帶進行吸光度積分掃描。用β-actin做內參。采用目的蛋白吸光度值/內參吸光度值的比值進行比較。

結 果

1 各組大鼠食管粘膜損傷程度 食管組織連續切片HE染色結果顯示，對照組大鼠食管未見明顯的組織學病變。模型組大鼠食管可見鱗狀上皮細胞增生，鱗狀上皮的黏膜固有層乳頭伸長，部分可見黏膜糜爛或潰瘍形成。療效對照組鱗狀上皮未見增生，黏膜尚完整，未見明顯糜爛、潰瘍等病變，固有膜乳頭縮短，固有膜內可見少許慢性炎細胞浸潤。ES低濃度干預組大鼠食管黏膜部分區域仍可見糜爛，ES中濃度干預組大鼠的食管黏膜損傷有所改善，而高濃度ES干預組大鼠食管鱗狀上皮未見明顯細胞病變，黏膜較完整，未見糜爛、潰瘍等病變，這與療效對照組相似(圖1)。

圖1 各組大鼠食管粘膜病理形態學觀察[HE染色;×200；對照組(A)、假手術組(B)、模型組(C)、低劑量ES干預組(D)、中劑量ES干預組(E)、高劑量ES干預組(F)和療效對照組(G)]

2 各組大鼠血清TNFα、IL-1β炎癥因子水平 模型組血清TNFα、IL-1β炎癥因子明顯高于正常對照組(P<0.001)；對照組TNFα及IL-1β水平明顯低于模型組(P<0.01)；低濃度ES干預組TNFα的水平明顯低于RE模型組(P<0.05)，而IL-1β的水平與RE模型組無明顯差異；中濃度及高濃度ES干預組TNFα、IL-1β的水平均明顯低于RE模型組(P<0.05)。此外，高濃度的ES干預組TNFα的水平明顯低于對照組(P<0.01)，但IL-1β水平無明顯差異(圖2)。

3 各組大鼠食管組織TNFα、IL-1、Cox2 mRNA相對表達水平mRNA表達水平 模型組食管組織TNFα、IL-1、Cox2 mRNA表達明顯高于對照組(P<0.001)；低、中、高濃度ES干預組TNFα、IL-1和Cox2 mRNA的表達均明顯低于模型組(P<0.05)。此外，療效對照組TNFα、IL-1和Cox2 mRNA的表達均明顯低于高濃度的ES干預組(P<0.001)(圖3)。

4 各組大鼠食管組織ERK、p-ERK、P38、p-P38蛋白水平 模型組ERK的表達明顯高于對照組(P<0.001)，而P38的表達明顯低于對照組(P<0.001)，但是p-ERK和p-P38的表達都明顯高于對照組(P<0.001)。對照組ERK及P38的表達明顯高于對照組(P<0.05)，但是其p-ERK和p-P38的表達都明顯低于對照組(P<0.001)。中、低濃度ES干預組ERK的表達與模型組相比無明顯差異，高濃度ES干預組ERK的表達明顯低于模型組(P<0.05)，但高、中、低濃度ES干預組p-ERK的表達均明顯低于RE模型組(P<0.001)；高、中、低濃度ES干預組P38的表達雖然都明顯高于模型組(P<0.05或P<0.001)，但其p-P38的表達均明顯低于模型組(P<0.001)。這與療效

對組大鼠食管中ERK、p-ERK、P38、p-P38蛋白的表達情況相似(圖4)。

圖2 各組大鼠血清TNFα、IL-1β炎癥因子水平(與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與療效對照組相比，&P<0.05，&&P<0.01)

圖3 各組大鼠食管組織TNFα、IL-1、Cox2 mRNA表達水平(與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與療效對照組相比，&P<0.05，&&P<0.01)

圖4 各組大鼠食管組織ERK、p-ERK、P38、p-P38蛋白水平(與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與療效對照組相比，&P<0.05，&&P<0.01)

討 論

反流性食管炎(RE)容易長期、反復發作，能夠并發潰瘍、出血、穿孔以及Barrett食管等，嚴重者能夠發展成食管腺癌，嚴重影響患者生活質量[5]。

依卡倍特鈉(ES)是一種胃黏膜保護劑，主要用于胃炎、胃潰瘍的臨床治療[2]，近年來有研究指出其對大鼠RE具有緩解作用[3]。奧美拉唑是臨床治療RE的代表藥物之一[6],因此選作療效對照。為探究ES治療RE的分子機制，本研究采用食管十二指腸吻合術建立大鼠RE模型，比較了ES干預前后各組大鼠食管黏膜的病理學變化。結果顯示，與正常對照組相比，模型組呈現明顯的食管黏膜炎癥表現，說明食管十二指腸吻合術可成功建立大鼠RE模型；經ES干預治療后，RE模型組上皮增生、糜爛和潰瘍均有不同程度減輕。可見，ES對RE模型大鼠受損食管黏膜確有保護和修復作用。研究表明，多種促炎性細胞因子在RE的發生發展中發揮重要作用[7]。Ku等人[8]通過仙茅根莖提取物緩解RE大鼠食管損傷，同時降低了TNFα、IL-1及IL-6的表達。本實驗結果顯示，ES干預顯著降低模型組大鼠血清及食管TNFα、IL-1水平，提示ES可能通過抑制TNFα、IL-1β等炎癥因子的表達緩解RE模型中的食管損傷。環氧合酶-2(Cox2)與炎癥性疾病的關系非常密切。Hayakawa等[9]的研究證實Cox2在反流性食管炎的致病機制中發揮重要作用。本實驗中，ES干預顯著降低模型組食管Cox2的升高，提示ES可通過抑制Cox2的表達減少炎癥反應，從而緩解RE模型中的食管損傷。文獻表明，抑制P38 MAPK信號通路的激活可以緩解RE大鼠的食管粘膜損傷[10]，說明P38 MAPK信號通路可能參與RE的病理進程。在本實驗中，ES干預能夠顯著抑制模型組大鼠ERK和P38的異常活化，提示ES可能通過抑制ERK和P38的磷酸化參與RE模型中的食管損傷修復。

綜上，ES通過抑制MAPK信號通路影響TNFα、IL-1、Cox2的表達，進而抑制炎癥因子的釋放和炎性反應，緩解RE模型中的食管黏膜病變。本研究探討了ES緩解RE食管損傷的分子機制，可為臨床預防及治療RE提供重要的理論依據及實驗基礎。

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(收稿：2016-03-18)

中國醫科大學附屬第一醫院(沈陽 110001) 楊 柳 孫明軍 黃玉紅△

Esophageal mucosa protective effects and its mechanism of Ecabet sodium in rat reflux esophagitis

The First Hospital of China Medical University(Shenyang 110001) Yang Liu Sun Mingjun Huang Yuhong

Objective: To inquire into the esophageal mucosa protective effects of Ecabet sodium(ES) in rat reflux esophagitis (RE) and its possible mechanism. Methods: The operation of end-to-side anastomosis of the esophagus and duodenum was performed to establish rat RE model. Esophageal mucosa lesion was examined by HE stain. The level of TNFα and IL-1β in sera was determined by ELISA. The level of TNFα, IL-1 and Cox2 in esophageal tissues were detected by Real-time PCR. The activation of ERK and P38 was detected by western blot. Results: Low, middle and high concentration ES intervention showed different levels of alleviation of esophageal mucosa disease, decreased the level of TNFα and IL-1β in serum and TNFα, IL-1, Cox2 in esophagus (P<0.05). Otherwise, ES inhibited the abnormality activation of ERK and P38(P<0.05). Conclusion: By inhibiting the MAPK signaling pathways and suppress the expression of TNFα, IL-1 and Cox2, ES thereby inhibits the release of inflammatory cytokines and inflammation, and as a result reduces esophageal mucosal lesions in RE model.

Ecabet sodium Reflux Esophagitis/drug therapy Demullents/pharmacology Gastroesophageal reflux @MAPK signaling pathway Rats

食管炎/藥物療法 黏膜保護劑/藥理學 胃食管反流 @MAPK信號通路 大鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.004

△通訊作者