豬流行性腹瀉病毒的分子生物學特性以及胰酶對其作用機理

張永香　陳海南　陳樨　張如梅（.福州大北農生物技術有限公司35004；.湖北省襄陽市襄州區畜牧獸醫局4404）

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豬流行性腹瀉病毒的分子生物學特性以及胰酶對其作用機理

張永香1陳海南2陳樨1張如梅1
（1.福州大北農生物技術有限公司350014；2.湖北省襄陽市襄州區畜牧獸醫局441104）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）在體外分離培養需依賴胰酶，目前胰酶對豬流行性腹瀉病毒的作用機理尚未完全清晰，文中從分子生物學方面闡述胰酶對豬流行性腹瀉病毒的作用。

豬流行性腹瀉病毒分子生物學胰酶

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒引起的豬的高度接觸性腸道傳染性疾病。臨床上以引起仔豬水樣腹瀉、嘔吐、脫水等為主要特征。該病一年四季均可發生，但以每年的冬、春季節為發病高峰期。傳播途徑主要通過消化道傳播，即糞-口傳播，無需傳播媒介。豬群一旦感染病毒可持續存在，各個年齡段的豬均易感，但以哺乳仔豬的發病率和病死率最為嚴重，且耐過的仔豬也易成“僵豬”［1-2］。由于當前缺乏有效的治療和防控措施，使其成為業界持續關注的焦點。

1　PEDV的病原學特性

PEDV屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬的成員，與其他冠狀病毒成員一樣，該病毒粒子的形態特征呈多形性，外有囊膜，囊膜上有花瓣狀纖突。病毒在4℃、pH 5.0～9.0以及37℃、pH 6.5～7.5時穩定［1］。豬的胃內pH 4左右，腸道pH值較穩定，從十二指腸pH 7.5到結腸pH 6.5呈逐漸衰減。小腸是病毒感染宿主的主要靶器官，而病毒是如何抵抗胃酸和蛋白酶的水解作用而保持侵染活性進入小腸的，至今尚未見明確報道，推測病毒在37℃條件下可能具更強的耐酸堿能力。目前PEDV只有一個血清型，無凝集紅細胞的特性，但經胰酶處理后可凝集兔的紅細胞，使病毒具血凝性［3］。

2　PEDV分子生物學特性

2.1基因組結構PEDV為不分節段的單股正鏈RNA病毒，其核酸具感染性，大小為28～30 kb。基因組5'端有一個帽子結構（cap），3'端有一個Poly（A）尾，其從5'→3'依次為5'-UTR-ORF1-S-ORF3-sM-M-N-3'-UTR。與其他冠狀病毒相比，該病毒的ORF1基因與S基因之間無其他基因，推測缺乏的可能就是冠狀病毒編碼相關血細胞凝集酶的基因［4］，所以，PEDV不具血凝性。

2.2基因編碼非結構蛋白及其功能ORF1基因編碼的是一種非結構的復制酶蛋白（Rep），該蛋白在病毒早期侵入宿主細胞發揮著極為重要的作用。而ORF3基因編碼的是一個功能未知的多態性非結構蛋白，通過ORF3基因序列比對，發現野毒株、弱毒株之間存在基因缺失現象，而缺失的基因可作為病毒強弱毒株的鑒定，同時ORF3蛋白的表達還被認為與病毒毒力有關［5-6］。

2.3基因編碼的結構蛋白及其功能S基因編碼的S蛋白（纖突蛋白）是一種病毒粒子表面的糖蛋白，該蛋白可識別靶細胞，促進病毒和細胞膜的融合達到介導病毒進入靶細胞的作用。同時在疫苗的免疫反應中也起著重要的作用，還可介導機體中和抗體的產生［6-7］。sM基因（E基因）編碼E蛋白（小膜蛋白），M基因編碼M蛋白，都在病毒的自我組裝和出芽過程中起重要的作用；其中M蛋白還能介導機體產生ɑ-干擾素，而且在補體存在時還可誘導中和抗體的產生［8］。M蛋白和E蛋白可以形成具有干擾源活性的類似病毒粒子樣的偽顆粒［9］。N基因編碼N蛋白，主要形成核衣殼，在病毒基因組的轉錄復制中起作用。

3　胰酶的作用機理

3.1胰酶作用于病毒的機理冠狀病毒是囊膜病毒，進入宿主細胞主要有兩種途徑，即細胞膜與病毒囊膜的融合和細胞的胞吞。而冠狀病毒一般是通過S蛋白的融合而進入宿主細胞的［10］。PEDV的早期分離需依賴胰酶，目前胰酶對PEDV的作用機理尚未完全清晰，但它在病毒進入細胞和釋放出細胞的過程中都發揮著重要的作用。當病毒在體外培養時，一旦與受體結合后，其S蛋白需借助外源蛋白酶（胰酶）改變其構象（將S蛋白切割成S1區域和S2區域），促進病毒與細胞發生融合。其中切割成的S1區位于蛋白的表面，主要與宿主細胞上的受體結合；而S2區位于病毒內部，能介導病毒與宿主細胞的融合［7］；而在胰酶缺失時，PEDV與受體結合后可利用酸性環境激活S蛋白使其融合［10］。當病毒與細胞發生融合后才會介導核衣殼穿入宿主細胞進行復制，同時S蛋白繼續留在細胞膜表面，以介導細胞與相鄰細胞之間的融合，形成多核體，正是這種多核體細胞的形成才有利于病毒的復制。當病毒完成復制后還需借助胰酶作用才能釋放出來，進而感染鄰近的細胞［11］。所以，胰酶的作用主要是作用于病毒本身，幫助病毒的穿入與釋放。也有學者提出胰酶對PEDV的切割作用，僅針對粘附在宿主細胞表面的病毒起作用，并非是病毒感染細胞所必需的。

3.2胰酶作用于細胞的機理胰酶在細胞分散消化過程中主要是使細胞間的蛋白質水解，達到細胞相互離散的效果。冠狀病毒感染宿主細胞主要通過細胞間的融合，形成易于觀察的合胞體，但PEDV感染宿主細胞卻需借助外源蛋白（胰酶）的作用才可觀察到合胞體［10-11］。由于Vero細胞可抵抗較高濃度胰酶的作用，因此，該細胞常用于PEDV的分離培養。并且隨著胰酶濃度增加，病毒感染Vero細胞的效果就越明顯［10］。同時胰酶還能增強病毒對Vero細胞的感染力。經胰酶處理后的病毒可使細胞間發生融合，形成合胞體和細胞空泡化［3］，因此，胰酶不僅作用于病毒本身還可作用于靶細胞；有文獻還指出胰酶能破壞干擾素，使病毒更易侵染宿主細胞［12］。因此，胰酶可促進病毒感染細胞和增加病毒的滴度。

4　小結

胰酶是PEDV早期體外分離培養所必需的，胰酶在病毒感染細胞、細胞間的融合以及病毒的釋放過程中都起著重要的作用。因此，胰酶不僅可以作用于病毒還可作用于細胞。病毒經繼代后可在不依賴外源蛋白（胰酶）的培養液中也能感染宿主細胞，但被胰酶“馴化”的病毒（商品化弱毒疫苗）經基因測序發現，其S基因上存在堿基或氨基酸突變現象，而M基因和N基因卻無明顯突變［13］，這可能是導致目前商品化疫苗免疫效果不佳的原因。

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M olecular biological characteristics of porcine epidem ic diarrhea virus and itsmechanism of trypsin

Zhang Yongxiang1Chen Hainan2Chen Xi1Zhang Rumei1
（1.Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.，Fuzhou 350014；2.Xiangzhou District Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Xiangyang City，Hubei 441104）

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）isolated in vitro rely on trypsin，the currentmechanism of action of trypsin on porcine epidemic diarrhea virus has not yet fully clear，this paper from the molecular biology of trypsin porcine epidemic diarrhea virus effect.

Porcine epidemic diarrhea virus Molecular biology Trypsin

A

1003-4331（2016）03-0031-02

福建省科技重大專項（2013Y31010019）資助。

張永香（1985-），女。華南農業大學碩士研究生，臨床獸醫學專業，zyxvet@163.com。