芍藥苷對大鼠皮質酮損傷的海馬神經元TrkB/BDNF信號通路的影響

董海影 張 春 弓 箭 張曉杰 李春旭

(齊齊哈爾醫學院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

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芍藥苷對大鼠皮質酮損傷的海馬神經元TrkB/BDNF信號通路的影響

董海影 張 春1弓 箭 張曉杰 李春旭

(齊齊哈爾醫學院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 觀察芍藥苷對皮質酮誘導海馬神經元損傷的影響。方法 體外培養新生SD大鼠海馬神經元，采用皮質酮誘導原代培養海馬神經元建立皮質酮損傷模型。培養體系中加入不同濃度的芍藥苷進行預處理。采用WST-1法檢測芍藥苷對神經元存活率的影響，應用PCR與Western印跡檢測神經元腦源性神經營養因子(BDNF)與酪氨酸激酶受體B(TrkB)的表達。結果 與皮質酮組相比，中高劑量芍藥苷可明顯增加海馬神經元活力(P<0.05)，可明顯增加海馬神經元TrkB與BDNF的 mRNA與蛋白表達水平(P<0.05)。結論 芍藥苷對皮質酮誘導的原代培養海馬神經元損傷具有保護作用，具有抗抑郁作用。

芍藥苷；海馬神經元；TrkB/BDNF

芍藥具有養血調經、柔肝止痛、平抑肝陽等功效，主要有效成分為芍藥苷〔1〕，具有顯著的抗抑郁樣活性〔2〕。本實驗主要研究芍藥苷對皮質酮誘導海馬神經元損傷和腦源性神經營養因子(BDNF)及其受體酪氨酸激酶受體B(TrkB)表達的影響，進而探討芍藥苷抗抑郁的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及動物 芍藥苷標準品(CAS：23180-57-6)；細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒(Beyotime公司，P20028)；TRIzon Reagent 總RNA提取試劑盒，Prime ScriptTMRT reagent Kit(TaRaKa，cat：RR370A)，SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，cat：RR420A)。原代海馬神經元源于新生24 h的SD大鼠的乳鼠，清潔級，雌雄不限。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經元的原代培養 選取新生24 h內的SD大鼠的乳鼠，將其置于無菌環境下，借助于解剖顯微鏡取出海馬，將收集的海馬組織修剪為約1 mm3，置于預冷的HBSS培養皿中，加入預熱的0.25%EDTA-胰蛋白酶溶液，在37℃水浴條件下消化15 min；應用牛血清終止反應后棄掉上清液，應用HBSS洗滌；加入種植液，吸取上清液置于離心管中，細胞濃度調整為(0.5～1)×107個/ml，接種于6孔板、24孔板和96孔板；待24 h貼壁后換為飼養液，抑制膠質細胞生長，7 d用于實驗。

1.2.2 海馬神經元的鑒定 應用Nissl染色方法進行鑒定。將細胞接種于6孔板，采用4%多聚甲醛固定，Nissl染色，蒸餾水和乙醇洗滌，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3 神經元分組 原代神經元培養第7天后，分為空白對照組，皮質酮組(200 μmol/L)，芍藥苷組(0.1、1、10 μmol/L)。芍藥苷各組先加入芍藥苷預處理48 h后，再加入皮質酮損傷神經元共孵育24 h。

1.2.4 WST-1檢測海馬神經元增殖活性 海馬神經元培養于96孔板，然后孔內加入10 μl WST-1工作液，在5%CO2、37℃的條件下培養4 h，檢測OD值。

1.2.5 PCR檢測海馬神經元TrkB與BDNF的mRNA表達 首先采用光度計和凝膠電泳對提取的RNA進行純度、濃度和完整性檢測；然后借助Prime ScriptTMRT reagent Kit 反轉錄反應試劑盒進行逆轉錄反應。反應參數：反轉錄反應42℃ 15 min，反轉錄酶失活反應85℃ 5 s。PCR反應引物由TaKaRa 公司設計合成，序列如下：TrkB正義：5＇-GGGGCTTATGCTTGCTGGTC-3＇；反義：5＇-CTCTGGGTCATTGCTGTTAGGTT-3＇；BDNF正義：5＇-CCCTTCTACACTTTACCTCTT-3＇；反義：5＇-GTTTCACCCTTTCCACTCCTA-3＇。

1.2.6 Western印跡檢測TrkB與BDNF蛋白水平的表達 電泳分離蛋白，轉膜，封閉，加抗，曝光。最后應用ImageJ2x分析軟件分析條帶灰度，進行半定量比較分析，以目的基因條帶與內參基因GAPDH的比值表示蛋白的表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 各組海馬神經元WST-1檢測結果 與空白對照組(1.308±0.081)比較，皮質酮組細胞活力(0.688±0.059)明顯降低(P<0.05)；與皮質酮組比較，芍藥苷0.1 μmol/L組(0.597±0.101)無明顯差異(P>0.05)，芍藥苷1 μmol/L組(1.323±0.978)與芍藥苷10 μmol/L組(1.319±0.130)的細胞活力明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，且二者相比無明顯差異(P>0.05)。

2.2 各組海馬神經元TrkB與BDNF mRNA檢測結果 與空白對照組比較，皮質酮組TrkB與BDNF mRNA表達均明顯降低(P<0.05)；而與皮質酮組相比，芍藥苷0.1 μmol/L組無明顯差異(P>0.05)，芍藥苷1 μmol/L組與芍藥苷10 μmol/L組的TrkB與BDNF mRNA表達水平均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3 各組海馬神經元TrkB與BDNF蛋白水平檢測 與空白對照組比較，皮質酮組TrkB與BDNF 蛋白表達均明顯降低(P<0.05)；而與皮質酮組相比，芍藥苷0.1 μmol/L組無明顯差異(P>0.05)，芍藥苷1 μmol/L組與芍藥苷10 μmol/L組的TrkB與BDNF蛋白表達水平均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖1。

表1 各組海馬神經元TrkB與BDNF mRNA表達的比較

與空白對照組比較：1)P<0.05；與皮質酮組比較：2)P<0.05；下表同

表2 各組海馬神經元TrkB與BDNF 蛋白表達的比較

A：空白對照組；B：皮質酮組；C：芍藥苷0.1 μmol/L組；D：芍藥苷1 μmol/L組；E：芍藥苷10 μmol/L組圖1 TrkB與BDNF的Western印跡檢測結果

3 討 論

芍藥苷是提取于芍藥中的中藥單體，是芍藥的主要活性成分，不僅具有抗炎、抗過敏、改善認知能力和改善血循環等多種藥理作用，還具有抗抑郁樣活性〔3〕。本課題組在前期實驗過程中發現，芍藥苷在抑郁癥經典行為學實驗中，能夠顯著縮短行為絕望模型小鼠懸尾不動時間，提示芍藥苷具有一定的抗抑郁作用。神經病理學研究結果顯示，抑郁癥的發生發展與腦內重要邊緣系統結構——海馬區域神經細胞的萎縮和壞死有重要關系〔4〕。臨床的影像學研究資料亦提示，與正常人的大腦海馬體積相比，抑郁癥患者海馬體積明顯縮小，且縮小程度與抑郁持續時間呈正相關〔5〕。諸多研究結果證實抑郁癥的發病與海馬結構關系密切。因此，如果能夠激活海馬區內源性神經前體細胞，進而促進成年腦神經元再生，將有可能是抑郁癥治療的一個突破性變革。BDNF作為神經生長因子家族中的重要成員，主要通過與神經元細胞膜表面受體 Trkb 結合，進而調控神經元的發育、分化、功能維持以及突觸可塑性〔6〕。研究亦發現，如果增加BDNF及其受體TrkB的表達強度，進而增強其神經營養的作用、促進多種類型神經元的生長、發育、存活、分化和功能表達，同時也能維持中樞神經系統成熟神經元的正常功能，也是抗抑郁治療的主要靶向之一〔7〕。

肝郁氣滯證為中醫證候最常見的證候類型，居各證之首，而柴胡疏肝散是臨床上治療抑郁癥最常用的經典名方之一，臨床及實驗研究均顯示該經典方劑具有確切的抗抑郁作用〔8，9〕。柴胡疏肝散中白芍與柴胡相伍一散一收，助柴胡疏肝，相反相成共為主藥，而芍藥苷是白芍的主要活性成分〔10〕。本文通過觀察芍藥苷對皮質酮誘導海馬神經元損傷的影響，進一步探討芍藥苷抗抑郁癥的作用機制。研究結果顯示，芍藥苷對皮質酮誘導的原代培養海馬神經元損傷具有保護作用，增加神經元活力，還能夠增加與神經元突觸可塑性有關的TrkB和BDNF mRNA表達水平，說明芍藥苷具有一定的抗抑郁作用。至于其抗抑郁癥具體作用機制還有待以后進一步深入研究。

1 金樹梅，蘇文華，崔廣智.芍藥苷在藥物誘發抑郁模型中的抗抑郁作用觀察〔J〕.山東醫藥雜志，2013；53(19)：28-9.

2 Mao QQ，Ip SP，Tsai SH，etal.Antidepressant like effect of peony glycos ides in mice〔J〕.J Ethnopharmacol，2008；119(2)：272.

3 Chen T，Guo ZP，Jiao XY，etal.Peoniflorin suppresses tumor necrosis factor-α induced chemokine production in human dermal microvascular endothelial cells by blocking nuclear factor-κB and ERK pathway〔J〕.Arch Dermatol Res,2011；303(5)：351-60.

4 McEwen BS.Plasticity of the hippocampus：adaptation to chronic stress and allostatic load〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2001；933(3)：265-77.

5 Egger K，Schocke M，Weiss E，etal.Pattern of brain atrophy in elderly patients with depression revealed by voxel-based morphometry〔J〕.Psychiatry Res，2008；164(3)：237-44.

6 張子韜.BDNF信號通路調節神經元突觸形成及遞質釋放的機制研究〔D〕.南京：南京醫科大學，2013.

7 Costa MS，Botton PH，Mioranzza S，etal.Caffeine improves adult mice performance in the object recognition task and increases BDNF and TrkB independent on phospho-CREB immunocontent in the hippocampus〔J〕.Neurochem Int，2008；53(3-4)：89-94.

8 董海影，張曉杰.柴胡疏肝散對抑郁模型大鼠海馬乙酰膽堿代謝的影響〔J〕.中華中醫藥雜志，2011；26(1)：163-7.

9 楊滿菊.柴胡疏肝散改善帕金森病患者抑郁癥狀療效評價〔J〕.光明中醫,2010；25(1)：31-2.

10 李春香，丁里玉，丁 芳，等.白芍養血柔肝止痛作用與其配伍及芍藥苷含量的相關性研究〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2011；22(1)：54-6.

〔2016-05-25修回〕

(編輯 曲 莉)

Effect of Paeoniflorin on the TrkB/BDNF signaling pathway of corticosterone-damaged hippocampal neurons

DONG Hai-Ying,ZHANG Chun,GONG Jian,et al.

Pathology Diagnosis Center of Qiqihar Medical College,Qiqihaer 161006,Heilongjiang,China

Objective To observe the effect of paeoniflorin on the damage of hippocampal neurons induced by corticosterone and investigate the mechanisms of paeoniflorin against depression.Methods Hippocampal neurons derived from newborn SD rats were cultured in vitro,using primary cultured hippocampal neurons induced by corticosterone to set up the corticosterone-injured model.The culture system was added to different concentrations of corticosterone pretreatment.WST-1 assay was used to detect the effect of paeoniflorin on the neuronal survival rate.The expression of TrkB/BDNF was detected by PCR technology.Results Compared with the model group,the medium and high dosage of corticosterone could significantly increase the hippocampal neuronal viability.The differences were significant(P<0.05).The medium and high dosage of corticosterone could obviously enhance the mRNA expression level of TrkB/BDNF(P<0.05).Conclusions Paeoniflorin has protective effect on corticosterone-induced primary cultured hippocampal neurons and antidepressant effect.

Paeoniflorin;Hippocampal neurons;TrkB/BDNF

國家自然科學基金項目(81173576)；黑龍江省衛生廳科研課題(2012-338)

李春旭(1965-)，男，碩士，副教授，主要從事臨床病理學研究。

董海影(1982-)，女，博士，講師，主要從事神經精神疾病的病理學研究。

R74

A

1005-9202(2016)22-5499-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.003

1 寧夏醫科大學顱腦疾病重點實驗室