丹參酮通過抑制miR-376b-5p逆轉自發性高血壓大鼠左室重構

陳 強 陳麗珠 郭曉華

(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院心內科，內蒙古 包頭 014010)

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丹參酮通過抑制miR-376b-5p逆轉自發性高血壓大鼠左室重構

陳 強 陳麗珠 郭曉華

(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院心內科，內蒙古 包頭 014010)

目的 探討miR-376b-5p在丹參酮逆轉老年自發性高血壓大鼠(SHR)左室重構中的作用。方法 將60只17月齡的SHR隨機分為對照組、丹參酮組和丹參酮+miR-376b-5p組(n=20)，其中丹參酮組和丹參酮+miR-376b-5p組接受5 ml·kg-1·d-1的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液灌胃處理，連續12 w；此外，丹參酮+miR-376b-5p組尾靜脈注射過表達miR-376b-5p的慢病毒載體，對照組接受5 ml·kg-1·d-1的生理鹽水灌胃處理。12 w后分離右側頸總動脈，采用PowerLab生物信號記錄分析系統分析血壓及血流動力學指標〔左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP) 和左心室壓力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)〕，稱量體質量及左心室質量并計算左心室質量指數。取左心室中部冠狀切面石蠟切片行HE染色、Masson染色以評估左室重構情況(心肌細胞直徑、心肌間質纖維化指數和心肌血管周圍纖維化指數)。結果 與對照組相比，丹參酮組的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓及LVSP和LVEDP均降低，±dp/dt max均升高(P<0.05)；丹參酮組的左心室質量、左心室質量指數、心肌細胞直徑、心肌間質纖維化指數及心肌血管周圍纖維化指數均低于對照組。miR-376b-5p過表達后可消除丹參酮對SHR血壓及左心室重構的保護效果，丹參酮+miR-376b-5p組的以上指標與對照組均無統計學差異(P>0.05)。結論 丹參酮對老年SHR左室重構有保護作用，而過表達miR-376b-5p可消除丹參酮對老年SHR左室重構的逆轉作用，提示丹參酮可能通過降低miR-376b-5p水平發揮對老年SHR左室重構的保護作用。

miR-376b-5p；丹參酮；自發性高血壓；左室重構

左室重構是高血壓患者發生心血管事件的重要危險因素，主要包括心肌肥大及心肌纖維化，前者為心肌纖維對慢性壓力或容量負荷的適應性反應，后者是心肌肥大過程中伴有膠原纖維過度沉積，最終導致心功能惡化〔1,2〕。目前在高血壓治療中，理想的治療措施應在有效降壓的同時對左室重構有改善效果。丹參酮具有較廣泛的心血管保護作用，同時對心室重構有較好的保護作用〔3,4〕。MicroRNAs(miRNAs)可調控基因的表達，且在多種心血管病理過程中發揮作用，如心肌纖維化、心肌肥厚、心力衰竭與心律失常〔5～7〕。miR-376b-5p是一種具有多種生物活性的microRNA，可參與M3受體對心肌的保護作用〔8〕，同時可調控腦缺血后血管新生〔9〕。本研究在老年自發性高血壓大鼠(SHR)中發現，miR-376b-5p參與了丹參酮對老年SHR左室重構的逆轉過程。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液購自上海第一生化有限公司，高表達miR-376b-5p的慢病毒載體購自上海吉凱基因公司，PowerLab數據分析處理系統購自美國AD Instruments公司，Masson三色染色試劑盒購自福州邁新生物科技開發公司，HE染色液購自徐州博立達生物技術有限公司。

1.2 動物與分組 60只17月齡的SHR購自北京維通利華公司，體重400～420 g，隨機分為對照組、丹參酮組和丹參酮+miR-376b-5p組(n=20)，其中丹參酮組和丹參酮+miR-376b-5p組接受5 ml·kg-1·d-1的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液灌胃處理，連續12 w；此外，丹參酮+miR-376b-5p組尾靜脈注射0.1 ml過表達miR-376b-5p的慢病毒載體，對照組接受5 ml·kg-1·d-1的生理鹽水灌胃處理。所有大鼠均飼養于同一SPF環境中，自由攝食與飲水，飼養環境溫度(23±2)℃，相對濕度45%～65%，光照與黑暗周期為12 h/12 h。

1.3 無創尾袖法測定血壓 每組取8只大鼠，將大鼠置于配套固定器中，溫水浸泡軟化尾巴，采用PowerLab ML125/R無創尾動脈血壓測定分析系統測定大鼠血壓。重復3次，取均值。

1.4 血流動力學評價 12 w后對各組大鼠進行稱重，腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg后固定，行頸部正中切口，暴露氣管后插管連接呼吸機維持呼吸(50次/min)，游離右側頸總動脈并于其表面切一小口，將PE-50聚乙烯管(充滿50 U/ml肝素生理鹽水)向近心端插入并結扎固定，經PowerLab數據分析處理系統記錄收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)，并對血壓信號進行處理，記錄平均動脈壓(MAP)。進一步插管進入左心室內監測血流動力學指標，包括左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP) 和左心室壓力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.5 心臟解剖學指標 待完成血流動力學評價后記錄各組大鼠體質量，過量麻醉處死大鼠后，迅速開胸取出心臟組織，清洗后移除心房及右心室游離壁，稱重左心室，同時根據公式計算左心室質量指數：左心室質量指數=左心室質量/體質量×100%。

1.6 心臟病理學指標 待實驗結束后，每組取8只大鼠采用靜脈注射過量的KCl使心臟收縮停止于舒張期，迅速開胸取出心臟組織，清洗后依次經4%中性甲醛固定、梯度酒精脫水及二甲苯透明后，適當修剪組織，取左心室中部冠狀切面進行石蠟包埋，石蠟切片機制備5 μm切片，每個組織樣本取5張切片分別進行HE染色以測量單個心肌細胞直徑及Masson染色測量心肌間質和心肌血管周圍膠原分布情況，最后計算心肌間質纖維化指數和心肌血管周圍纖維化指數，共同評價心肌纖維化情況。

1.7 統計學處理 采用SPSS16.0軟件，多組計量資料分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA檢驗)，兩兩比較采用SNK法。

2 結 果

2.1 3組大鼠的血壓及心率比較 3組大鼠心率無顯著差異(P>0.05)，丹參酮組的SBP、DBP及MAP均低于對照組(P<0.05)；與丹參酮組比較，丹參酮+miR-376b-5p組的SBP、DBP及MAP均升高，均無統計學差異(P<0.05)，而丹參酮+miR-376b-5p組以上指標與對照組(P>0.05)。見表1。

表1 3組大鼠的血壓水平及血流動力學情況±s)

與對照組比較：1)P<0.05；與丹參酮組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 3組大鼠的血流動力學指標比較 丹參酮組的LVSP和LVEDP均低于對照組，dp/dtmax和-dp/dtmax均高于對照組(P<0.05)；與丹參酮組比較，丹參酮+miR-376b-5p組的LVSP和LVEDP均升高，dp/dtmax和-dp/dtmax水平降低(P<0.05)，且丹參酮+miR-376b-5p組以上指標與對照組均無統計學差異(P>0.05)。見表1。

2.3 3組大鼠的心臟解剖學指標比較 3組大鼠體質量無統計學差異(P>0.05)；丹參酮組的左心室質量及左心室質量指數均低于對照組(P<0.05)；與丹參酮組比較，丹參酮+miR-376b-5p組的左心室質量及左心室質量指數均升高(P<0.05)，且丹參酮+miR-376b-5p組以上指標與對照組均無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 3組大鼠的心臟解剖學指標比較±s)

2.4 3組大鼠的心臟病理學指標比較 丹參酮組的心肌細胞直徑、心肌間質纖維化指數及心肌血管周圍纖維化指數均低于對照組(P<0.05)；與丹參酮組比較，丹參酮+miR-376b-5p組的心肌細胞直徑、心肌間質纖維化指數及心肌血管周圍纖維化指數均升高(P<0.05)，且丹參酮+miR-376b-5p組以上指標與對照組均無統計學差異(P>0.05)。見表4。

表4 3組大鼠的心臟病理學指標比較±s)

3 討 論

長期高血壓會導致心室重構，主要表現為心肌細胞肥大及纖維化，后者可分為心肌間質纖維化和心肌血管纖維化〔2〕。心肌纖維化增加了心臟中非心肌細胞比例，嚴重影響心室功能，最終導致心力衰竭。丹參酮是傳統中藥丹參的心血管活性成分，具有改善微循環、抗氧化及抗炎等作用〔10〕。在老年高血壓動物模型中的研究還證實丹參酮具有確切的抗心室重構作用〔11〕，但其具體機制尚不清楚。

miRNA是一類具有廣泛調節作用的內源性RNA，能與靶基因的3'端非翻譯區結合從而對靶mRNA進行調控。目前大量的miRNA被發現參與了心室重構的發生發展過程，如miR-133、miR-99a、miR-30及miR-34等〔5～7〕。Pan等〔8〕發現M3亞型乙酰膽堿受體可通過抑制miR-376b-5p發揮心肌保護作用。此外，通過miRNA靶基因預測軟件TargetScan發現，胰島素樣生長因子結合蛋白-2、ryanodine受體2及腦源性神經營養因子均參與了心肌缺血的調控過程〔12，13〕。本研究表明丹參酮可改善心室重構。通過基因載體手段過表達miR-376b-5p，發現接受丹參酮處理后大鼠的心室重構指標無變化，直接證實過表達miR-376b-5p可消除丹參酮對老年SHR心室重構的改善效果，可能通過影響其靶基因表達逆轉丹參酮的心血管保護作用。

此外，本研究發現miR-376b-5p對丹參酮改善老年SHR血壓及血流動力學的作用亦有逆轉效果，由于較高的基礎血壓和異常血流動力學狀況可影響心室重構的進程，本研究推測miR-376b-5p可能通過影響血壓及血流動力學參與對丹參酮作用的調控。

1 朱桂平,王 卓,林忠偉,等.MMP-9/TIMP-1在自發性高血壓大鼠左室重構中的表達及血脂康膠囊的調控作用〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(11):2946-9.

2 魏 梅,劉永升,陳 潔,等.螺內酯聯合美托洛爾對老年慢性心力衰竭患者左室重構及心功能的影響〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(6):1509-10.

3 馮 俊,李樹生,梁黔生,等.丹參酮ⅡA對心力衰竭大鼠的心肌凋亡及miR-133水平的影響〔J〕.中國中西醫結合雜志,2012;32(7):930-3.

4 趙智明,常文靜,趙凌杰,等.丹參酮ⅡA 對壓力負荷增加大鼠心室膠原重構的影響〔J〕.河北中醫,2015;37(4):550-2,586.

5 Li Y,Cai X,Guan Y,etal.Adiponectin upregulates miR-133a in cardiac hypertrophy through AMPK activation and reduced ERK1/2 phosphorylation〔J〕.PLoS One,2016;11(2):e0148482.

6 Li Q,Xie J,Li R,etal.Overexpression of microRNA-99a attenuates heart remodelling and improves cardiac performance after myocardial infarction〔J〕.J Cell Mol Med,2014;18(5):919-28.

7 Bernardo BC,Gao XM,Winbanks CE,etal.Therapeutic inhibition of the miR-34 family attenuates pathological cardiac remodeling and improves heart function〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2012;109(43):17615-20.

8 Pan Z,Guo Y,Qi H,etal.M3 subtype of muscarinic acetylcholine receptor promotes cardioprotection via the suppression of miR-376b-5p〔J〕.PLoS One,2012;7(3):e32571.

9 Li LJ,Huang Q,Zhang N,etal.miR-376b-5p regulates angiogenesis in cerebral ischemia〔J〕.Mol Med Rep,2014;10(1):527-35.

10 陳 姝,張 靜,吳艷峰,等.丹參酮ⅡA磺酸鈉的臨床應用研究進展〔J〕.中國醫藥,2012;7(2):253-4.

11 馮 俊,陳華文,李樹生,等.丹參酮ⅡA對慢性心力衰竭心肌重構的影響及其機制研究〔J〕.中國中醫急癥,2015;24(12):2069-71,2126.

12 Bazzoni F,Rossato M,Fabbri M,etal.Induction and regulatory function of miR-9 in human monocytes and neutrophils exposed to proinflammatory signals〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2009;106(13):5282-7.

13 Guo Z,Wang S,Jiao Q,etal.RNAi targeting ryanodine receptor 2 protects rat cardiomyocytes from injury caused by simulated ischemia-reperfusion〔J〕.Biomed Pharmacother,2010;64(3):184-90.

〔2015-12-19修回〕

(編輯 徐 杰)

陳 強(1980-)，男，主治醫師，碩士，主要從事冠心病診治研究。

R54

A

1005-9202(2016)22-5549-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.024