海島棉GbTCP15基因的克隆與表達分析

鄭 凱，倪志勇，曲延英，王 怡，蔡永生，陳全家

(新疆農業大學 農學院/農業生物技術重點實驗室，烏魯木齊 830052)

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海島棉GbTCP15基因的克隆與表達分析

鄭 凱，倪志勇，曲延英，王 怡，蔡永生，陳全家*

(新疆農業大學 農學院/農業生物技術重點實驗室，烏魯木齊 830052)

根據陸地棉GhTCP15基因序列，設計1對引物，通過PCR技術從海島棉品種‘新海21號’中克隆一個同源基因，命名為GbTCP15。海島棉GbTCP15基因具有一個1 056 bp開放閱讀框，編碼351個氨基酸，預測分子量約為38 057.4 kD，等電點為9.01，序列中含有一個高度保守的TCP結構域。氨基酸序列對比表明，海島棉GbTCP15蛋白與其他植物中的TCP蛋白有較高的一致性，說明該基因在進化過程中是相當保守的。亞細胞定位結果顯示，GbTCP15主要分布在細胞核上，推測GbTCP15在復制和轉錄的過程中發揮著信號轉導以及轉錄調控等作用。進化樹分析表明，海島棉GbTCP15基因與雷蒙德氏棉GrTCP15基因分布在同一分支上。實時熒光定量PCR表明，海島棉GbTCP15基因在莖部和15 d纖維中表達量較高。研究表明，GbTCP15轉錄因子可能參與棉花纖維以及表皮毛的發育。

海島棉；TCP；克隆；序列分析；表達分析

TCP家族是植物特有的一類轉錄因子，在植物中廣泛存在，同時也在植物的生長發育過程中起重要作用，目前已知在擬南芥中有24個TCP轉錄因子[1]，在水稻中有20個TCP轉錄因子[2]。早期發現的4個TCP基因分別為玉米(Zeamays)的TB1(teosintebranched1)、金魚草(Antirrrhinummajus)的CYC(cycloidea)，以及水稻(Oryzasativa)的PCF1和PCF2(proliferatingcellfactors1，proliferatingcellfactors2)，TCP則分別來自這幾個基因名稱的首字母[3]。通過對這4個基因序列比較發現，序列中均含有一個由60個氨基酸組成的高度保守的區域，也叫TCP結構域(TCP domain)，能夠形成一個堿性-螺旋-環-螺旋的結構又稱(bHLH結構域)[4]。推測TCP結構域的功能可能作用于蛋白二聚化以及與DNA結合這些方面。除了bHLH結構外，CYC和TB1還有一個保守的富含極性氨基酸的區域[3]，大約有18個氨基酸組成，可以形成一個親水α螺旋的R結構區。

根據TCP基因家族與DNA結合的位點序列不同，TCP家族又被分為2個亞族(ClassⅠ和ClassⅡ)。由于TCP結構的差異，ClassⅡ類又被分成兩類進化分支。一類是含有金魚草生長調節因子cincinnata，稱為CIN支；另一類在bHLH區之間有一個富含谷氨酸和半胱氨酸的保守區域ECE區(也稱ECE支)，包括CYC、TB1以及擬南芥的TCP1、TCP12等[5-6]。在功能上大致也分兩類，即ClassⅠ類和ClassⅡ類,ClassⅠ類在植物生長發育過程中發揮正調控的功能，主要是促進細胞分化，在植物分生組織中起作用[7]；ClassⅡ類對生長發育進行負調控，主要是抑制細胞的增值[8]。目前，針對棉花纖維發育相關的TCP轉錄因子的研究還很少。夏桂先研究組從陸地棉中克隆了一個GhTCP14轉錄因子，研究表明GhTCP14可能是生長素調控纖維起始和伸長的一個上游調控子[9]。張獻龍研究組在海島棉中分離了一個TCP家族的轉錄因子GbTCP，在棉纖維伸長期(5～15 d)高表達[10]。

TCP家族的轉錄因子在植物的整個生長周期中參與多種途徑的調控。然而，有關TCP轉錄因子參與調控棉花纖維發育的相關研究還不是很多，尤其是在海島棉纖維發育時期的功能還有待進一步的探究。本研究從海島棉中克隆一個TCP轉錄因子GbTCP15，分析該基因的蛋白結構和表達特征，為今后棉花TCP轉錄因子在纖維發育階段的功能及分子機制的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

棉花品種‘新海21號’由新疆農業大學農業生物技術重點實驗室提供，試驗材料于2015年7月種植在阿克蘇16團新疆農業科學研究院試驗基地。按照正常田間管理，在花期掛牌標記棉鈴，開花當天記為0 d以及開花后的5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d(開花天數)的棉花纖維，以及開花當天的花瓣、花萼、子房以及柱頭，取樣后置于液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

室內取‘新海21號’種子剝去種皮，將種仁浸泡于70 %無水乙醇消毒3 min后，用無菌水反復沖洗3～5次，將種子平鋪在放有濾紙的發芽盒中，28 ℃暗培養4 d然后取下胚軸，剩余的移植到營養液中繼續生長，待第一片真葉展開時，取根、莖、葉，將樣品置于液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于提取總RNA。

1.2 方 法

1.2.1 棉花總RNA提取及第一鏈cDNA合成 按Trizol試劑盒(Tiangen)使用說明，分別提取0 d、5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d以及根、莖、葉、下胚軸和開花當天的花瓣、花萼、子房、柱頭的總RNA。使用DnaseⅠ(Tiangen)去除基因組DNA污染。按照First Strand cDNA Synthesis試劑盒(Thermo試劑公司)說明書操作步驟，以獲得不同時期棉花纖維和其他組織的總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈。

1.2.2 海島棉GbTCP15基因的克隆及序列分析 以擬南芥AtTCP15基因(AT1G69690.1)序列作為BlaseP查詢序列，在全基因組信息庫(https://phytozome.jgi.doe.gov)和美國國家生物技術信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索棉花TCP家族基因與AtTCP15序列保守的序列，將其在已經公布的棉花數據庫中比對，獲得1個cDNA序列，然后根據該序列的ORF設計了引物。

表1 引物序列

根據海島棉GbTCP15 基因的cDNA序列設計引物，用引物GbTCP15-F 和GbTCP15-R 擴增GbTCP15 ORF(表1)，以棉花纖維0 d的cDNA第一鏈為模板，擴增基因。擴增體系為25 μL，其中含有cDNA 1 μL；10×緩沖液(含Mg2+)2.5 μL；2.5 mmol/L dNTP 2 μL；Taq酶0.5 μL；正反引物各1 μL，補充水到25 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s；55 ℃復性30 s；72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃延伸1 min。PCR產物置1%瓊脂糖中電泳，經紫外凝膠成像儀觀察結果。采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN )回收目的片段，回收產物與 載體pEASY-T1(全式金生物公司)連接后轉化Trans1-T1 Phage Resistant 感受態細胞(全式金生物公司)，涂在含有卡那抗性的LB固體培養基上，過夜培養后，挑取陽性克隆經菌液PCR驗證后，將陽性克隆送深圳華大基因公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 將所得的GbTCP15基因的ORF用DNAMAN翻譯成蛋白序列，利用SMART軟件預測蛋白質的保守功能域(http://smart.embl-heidelberg.de/)。用EXPASy的Prot-Param tool 在線程序(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)預測蛋白的分子量和等電點。使用在線軟件InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/sequencesearch)對蛋白質進行一級結構分析。利用PSIRRED Server工具預測蛋白質的二級結構(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)。利用SWISS-MODEL工具預測蛋白質三級結構(http://swissmodel.expasy.org/)。利用DNAMAN軟件和Blast檢索GenBank進行多重序列比對和同源性分析。用ClustalX比對蛋白氨基酸序列，用MEGA6.0軟件構建系統進化樹，采用鄰位相連法(Neighbor-Joining, NJ)構建進化樹，BootStrap 參數設置為1000次重復，使分支結果更為可靠。用Post(http://www.psort.org/)在線工具預測蛋白的亞細胞定位。

1.2.4 實時熒光定量PCR 根據GbTCP15基因的cDNA序列設計引物GbTCP15-qF和GbTCP15-qR，以GbUBQ7基因為內參基因，擴增引物為GbUBQ7-F和GbUBQ7-R(表1)，利用實時熒光定量PCR，以棉花開花當天(0 d)的胚珠和開花后5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d的纖維組織反轉錄的產物以及根、莖、葉、下胚軸和開花當天的花瓣、花萼、子房、柱頭反轉錄的產物為模板，檢測GbTCP15基因在不同組織和不同發育時期棉纖維中的表達情況。20 μL PCR擴增體系為：混合液2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL(全式金生物公司)；校正液Passive Reference Dye(50×)0.4 μL(全式金生物公司)；正反引物各0.4 μL；模板1 μL；ddH2O 7.8 μL。用實時熒光定量專用96孔板(applied biosystems，美國)，ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀(ABI Prism，美國)進行實時定量PCR分析，每個樣品重復3次。采用兩步法，PCR程序為94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環；結果采用2-ΔΔCt法處理數據，并制作柱形圖顯示該基因在不同棉花組織和不同棉纖維時期的表達情況。試驗進行3次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 海島棉GbTCP15基因的克隆與序列分析

以‘新海21號’5 d 棉花纖維cDNA為模板，根據引物GbTCP15-F和GbTCP15-R，用RT-PCR方法，獲得目的片段。GbTCP15編碼區長1 056 bp(圖1)，運用DNAMAN分析得出，該編碼區編碼351個氨基酸，其中絲氨酸占11.7%，蘇氨酸占8.5%，甘氨酸和脯氨酸各占8.3%，亮氨酸占7.4%，丙氨酸占6.8%；預測分子量為38 057.4 kD，等電點為9.01。通過NetPhos 2.0 Serve預測GbTCP15蛋白的磷酸化位點(圖2)，GbTCP15含有26個絲氨酸(Ser)、8個蘇氨酸(Thr)、1個絡氨酸(Tyr)位點。由此推測磷酸化作用可能主要與這2個蛋白的活性調控有關。

通過對蛋白質結構域分析發現(圖3)GbTCP15蛋白的N端具有一個TCP家族特有保守結構域，該結構域為ClassⅠ型TCP家族基因所特有的，因此認定該基因屬于棉花TCP轉錄因子家族。

M. Marker；1. GbTCP15圖1 棉花GbTCP15基因PCR產物電泳分析Fig.1 Electrophoresis of PCR product of cotton GbTCP15 genes

圖2 GbTCP15蛋白磷酸化位點預測Fig.2 GbTCP15 protein phosphorylation sites prediction

Helix.α螺旋；Sheet.β折疊 圖4 GbTCP15蛋白的氨基酸二級結構預測Helix. Alpha helix；Sheet. Beta foldingFig.4 GbTCP15 protein secondary structure prediction

A. GbTCP15蛋白的氨基酸序列；B. 蛋白結構示意圖,方框部分代表TCP結構域圖3 GbTCP15蛋白的氨基酸序列以及蛋白結構示意圖A. Amino acid sequence of GbTCP15；B. Schematic diagram of GbTCP15，Box part represents TCP domain structureFig.3 GbTCP15 protein amino acid sequence and protein structure diagram

圖5 GbTCP15蛋白的三級結構Fig.5 Tertiary structure of GbTCP15

利用PSIRRED Server程序(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預測蛋白質的二級結構，GbTCP15蛋白由351個氨基酸組成，其中7個氨基酸形成α-螺旋，1個氨基酸可能形成β-折疊。組成α-螺旋氨基酸的比例占87%，β-折疊占13%。分布如圖4所示。

通過SWISS-MODEL工具預測蛋白質三級結構，得到該蛋白的三級結構圖(圖5)，與其他TCP蛋白的三級結構類似，其三級結構主要為α-螺旋—β-折疊—α-螺旋，這與二級結構預測結果基本一致。

GbTCP15.海島棉；GaTCP15.亞洲棉(Cotton_A_33342); GhTCP15.陸地棉(CotAD_65741); GrTCP15.雷蒙德氏棉(XP_012465080); AtTCP15.擬南芥(AT1G69690); BrachypodiumTCP15.二穗短柄草(XP_003570652); SorghumTCP 15.高粱(EES07255); PrunusTCP.果梅(XP_008221641); ArachisTCP15.花生(XP_016202735);CucumisTCP15.黃瓜(XP_011655678); CacaoTCP.可可(XP_007046143); ViniferaTCP15.葡萄(XP_002274048); OryzaTCP15.水稻(XP_015641757); ZeaTCP14.玉米(XP_0086462571)圖6 GbTCP15與其他TCP氨基酸序列對比分析GbTCP15. Gossypium barbadense; GaTCP15.Gossypium arboreum(Cotton_A_33342); GhTCP15.Gossypium hirsutum(CotAD_65741); GrTCP15.Gossypium raimondii(XP_012465080); AtTCP15.Arabidopsis thaliana(AT1G69690); BrachypodiumTCP15.Brachypodium distachyon(XP_003570652); SorghumTCP15.Sorghum bicolor(EES07255); PrunusTCP15.Prunus mume(XP_008221641); ArachisTCP15.Arachis ipaensis(XP_016202735); CucumisTCP15.Cucumis sativus(XP_011655678); CacaoTCP.Theobroma cacao(XP_007046143); ViniferaTCP15.Vitis vinifera(XP_002274048); OryzaTCP15.Oryza sativa(XP_015641757); ZeaTCP14.Zea mays(XP_0086462571)Fig.6 Amino acid sequence alignment of GbTCP15 with other related proteins

借助NCBI數據庫將堿基序列翻譯成氨基酸序列，用DNAMAN對海島棉GbTCP15和雷蒙德氏棉GrTCP15(Gossypiumraimondii，XP_012465080)之間進行氨基酸序列比對，其一致性為98.01%。海島棉GbTCP15與亞洲棉GaTCP15(Gossypiumarboreum，Cotton_A_33342)、陸地棉GhTCP15(Gossypiumhirsutum，CotAD_65741)、可可TCP(Theobromacacao，XP_007046143)、高粱TCP 15(Sorghumbicolor，EES07255)、水稻TCP15(Oryzasativa，XP_015641757)、玉米TCP(Zeamays,XP_0086462571)、花生TCP15(Arachisipaensis,XP_016202735)、黃瓜TCP15(Cucumissativus,XP_011655678)、葡萄TCP15(Vitisvinifera，XP_002274048)、擬南芥TCP15(Arabidopsisthaliana，AT1G69690)和二穗短柄草TCP15(Brachypodiumdistachyon，XP_003570652)氨基酸序列一致性分別為94.56%、96.25%、81.29%、50.66%、38.11%、44.73%、51.43%、54.97%、61.49%、51.70%、50.33%。這些TCP相關的蛋白都有一個高度保守的TCP domain，其他區域一致性較低(圖6)。

2.2 海島棉GbTCP15亞細胞定位及功能預測分析

利用POSRT 3.0軟件對GbTCP15的亞細胞定位進行預測分析，結果顯示，GbTCP15在細胞核和細胞質中的分布比例分別為30%、10%，在細胞核中的分布最多，結果表明GbTCP15基因編碼的蛋白其作用發生在植物的細胞核內。

運用Protfun2.2軟件對GbTCP15的功能進行預測分類，結果顯示該蛋白在輔因子生物結合、運輸和結合、監管職能、嘌呤和嘧啶以及翻譯過程中發揮的可能性分別是0.210、0.773、0.034、0.331、0.071，而作為信號轉導分子、轉錄因子、轉錄調控因子發揮功能的可能性分別是0.205、0.219、0.111(表2)，這些數據明顯高于其他功能。考慮該基因家族的特性，綜合判斷GbTCP15可能在復制、轉錄和運輸的過程中發揮著信號轉導以及轉錄調控等作用。

2.3 海島棉GbTCP15系統進化分析

利用MEGA6軟件對上述物種的TCP氨基酸進行同源性比較并構建系統發育樹(圖7)表明，GaTCP15和GhTCP15聚集在同一分支，GbTCP15 和GrTCP15聚在同一分支，表明海島棉TCP15基因與雷蒙德氏棉的同類基因的親緣關系較近。

2.4 GbTCP15表達模式分析

采用實時熒光定量PCR方法分析GbTCP15基因在棉花不同纖維時期的表達量以及在棉花的營養器官和生殖器官中的表達情況。由圖8可知，GbTCP15基因在纖維發育的第15天時表達量最高，明顯高于其他發育時期的棉纖維，并且該基因在纖維發育的后期，即次生壁增后期和脫水成熟期表達量非常低。據此推測GbTCP15基因可能在棉纖維起始階段和纖維伸長期中發揮一定的功能。同時在根、莖、葉和下胚軸中也檢測到GbTCP15基因的表達(圖9)，而且在莖上的表達明顯高于根、葉和下胚軸，說明GbTCP15基因可能在棉花莖稈表皮毛的發育中也發揮著一定的作用。

表2 GbTCP15功能分析結果

圖7 GbTCP15蛋白與其他植物相關蛋白序列的系統進化樹Fig.7 Phylogenetic analysis of GbTCP15 with other related proteins in different plants

圖8 GbTCP15基因在不同纖維時期的表達情況Fig.8 GbTCP15 gene expression in different fiber periods

圖9 GbTCP15基因在棉花營養器官中的表達情況Fig.9 GbTCP15 gene expression in the different tissues and organs of cotton

3 討 論

棉花纖維的生長發育過程決定了成熟纖維的產量和品質，近幾年，針對棉纖維發育的相關研究備受關注，但是到目前為止，控制纖維發育的關鍵基因和調控機理還不清楚，因此針對棉花纖維開展分子機制的研究具有重要的理論意義和應用價值。

TCP轉錄因子是植物特有的一類基因家族，在植物發育過程中發揮著重要的作用；棉花纖維細胞是棉花胚珠外珠被表皮細胞經分化突起和極性伸長而形成的單細胞。現有的研究表明，TCP轉錄因子在植物生長發育過程中發揮的作用大部分與細胞的生長、增殖和分化有關，通過調控細胞分裂進一步控制植物側枝、花等器官的生長發育。如玉米的TB1基因作用在兩方面：一是抑制分生組織的生長發育，調控頂端優勢,二是通過抑制雄花原基發育調控雄花的形成[11];金魚草的CYC基因則調控花的對稱發育[12]；而水稻的PCF1和PCF2基因則是調控分生組織中的Pcan基因的轉錄[13]。

本研究從海島棉‘新海21號’材料的棉纖維中成功克隆1個TCP轉錄因子基因，將其命名為GbTCP15；該基因編碼的氨基酸序列含有一個保守的TCP結構域，通過聚類分析顯示，該基因屬于TCP轉錄家族的ClassⅠ類。現有的研究表明，擬南芥TCP家族中ClassⅠ類分支上的TCP蛋白在植物的分生組織上發揮著作用，同時也參與細胞的形成和發育。例如：擬南芥AtTCP14在種子萌發過程中起調控作用[14]；AtTCP16在花粉發育中起調控作用[15]；AtTCP15控制葉片的形狀[16]；AtTCP20參與調控細胞的分裂、伸長和分化[17]。Wang等[9]克隆了1個陸地棉的TCP轉錄因子，研究顯示該轉錄因子隸屬于Class Ⅰ 類分支，并且該轉錄因子在棉花起始和伸長階段特異性表達。

通過熒光定量PCR技術發現克隆的GbTCP15基因在棉花15 d的纖維中和植株的莖部優勢表達，說明GbTCP15基因可能在棉花的表皮細胞中表達量較高，進一步暗示該轉錄因子可能在棉花纖維發育伸長期中起一定作用。關于GbTCP15基因的功能，以及該基因在纖維伸長期的調控機理之間的關系尚需進一步的研究。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of GbTCP15 in Gossypium barbadense

ZHENG Kai, NI Zhiyong, QU Yanying, WANG Yi, CAI Yongsheng, CHEN Quanjia*

(Agronomy Courtyard/ Key Laboratory of Agricultural Biological Technology, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052,China)

According to the coding sequence ofGhTCP15 gene,a pair of primers were designed. The homologous sequence ofGbTCP15 gene,was cloned from cotton(GossypiumbarbadenseL.)cultivar Xinhai 21 using reverse transcription PCR methods in this study.GbTCP15 gene contained open reading frame(ORF) of 1 056 bp in length, 351 amino acids residues with a predicted molecular mass of about 38 057.4 kD and a basic isoelectric point of 9.01,with a highly conservative TCP domain in the encoded putative protein. Amino acid sequence alignment revealed of GbTCP15 protein shared high degree of identity with other higher plant TCP proteins and the gene in evolution has proved to be conservative. Subcellular localization showed thatGbTCP15 expressed possibly in cell nucleus. Thus, we speculated thatGbTCP15 play a role on signal transduction and transcriptional regulatory during replication and transcription. The phylogenetic tree showed thatGbTCP15 was located at the same distribute withGossypiumraimondiiGrTCP15. The experment results of real time PCR exhibited thatGbTCP15 had a higher expression level in stems and fibers (15 d). Above results suggested thatGbTCP15 transcription factor may be involved in the cotton fiber and table fur development.

GossypiumbarbadenseL.;TCP;cloning;sequence analysis;expression analysis

1000-4025(2016)10-1925-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.1925

2016-06-22;修改稿收到日期:2016-09-12

國家自然科學基金(31560405)；新疆維吾爾自治區高技術研究發展計劃(201411103)；中國博士后科學基金(2015M582741)

鄭 凱(1988-)，男，在讀碩士研究生，主要從事棉花分子育種研究。E-mail：zhengkai555@126.com

*通信作者:陳全家，教授，博士生導師，主要從事棉花遺傳育種研究。E-mail：chenqjia@126.com

Q785;Q786

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