秦巴山區石斛屬親緣關系及金釵石斛遺傳多樣性ISSR分析

江愛明，曹 俊，蔡高磊

(1 漢江師范學院 生物化學與環境工程系，湖北十堰 442000；2 十堰市農業科學院，湖北十堰 442000)

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秦巴山區石斛屬親緣關系及金釵石斛遺傳多樣性ISSR分析

江愛明1，曹 俊1，蔡高磊2*

(1 漢江師范學院 生物化學與環境工程系，湖北十堰 442000；2 十堰市農業科學院，湖北十堰 442000)

為研究秦巴山區石斛屬親緣關系，利用5條ISSR引物對秦巴地區石斛屬植物12個居群的遺傳多樣性進行了初步探討。結果表明：(1)UPGMA聚類分析結果顯示，金釵石斛(DendrobiumnobileLindl)、曲莖石斛(D.flexicauleZ. H. Tsi)和細葉石斛(D.hancockiiRolfe)分別聚為三支，在分子水平上出現了明顯的分化，揭示三者是獨立物種。(2)金釵石斛種下6個居群可明顯分為2支，LJ、MT、YP和WF遺傳一致度較近聚為一支；YJ和PT遺傳高度一致，遺傳距離最近聚在一起。(3)金釵石斛種下居群間Nei’s總基因多樣性(Ht)為0.388，基因分化系數(Gst)為0.934，顯示金釵石斛居群間存在較高的遺傳分化。研究結果揭示了秦巴山區石斛屬植物的親緣關系，從分子水平上為其鑒定提供了依據，并為金釵石斛的資源利用和遺傳改良奠定理論基礎。

金釵石斛；ISSR；遺傳多樣性

石斛屬(DendrobiumSw.)植物多為附生植物，約1 000種，廣泛分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區至大洋洲。中國有74種和2變種，主要分布在秦嶺以南諸省區。國內種類中具細莖而花小的類群，如細莖石斛、鐵皮石斛、梳唇石斛、美花石斛、鉤狀石斛、霍山石斛和金釵石斛等，這其中以金釵石斛(DendrobiumnobileLindl)尤為珍貴[2]，以秦巴山區產量較多，質量最好[3]。因其含有石斛堿及多糖類物質，具有較高的藥用價值而名列“中華九大仙草”之首[4]。由于近年來過度開采、生態環境破壞及自身生長緩慢等原因，野生金釵石解愈來愈少。近幾年研究人員主要進行野生金釵石斛資源的保護，但是對該地區金釵石斛遺傳多樣性研究還很欠缺。

ISSR(inter-simple sequence repeat，簡單重復序列間擴增)是由Zietkiewicz[5]等于1994年創建的一種基于聚合酶鏈式反應(PCR)的新型分子標記，該技術具有DNA用量小、成本低、重復性好、操作簡便等特點，而被廣泛應用于品種鑒定、遺傳關系及遺傳多樣性、基因標記、指紋圖譜的建立等多方面的研究[6-7]。馬佳梅等[8]建立并優化了流蘇石斛ISSR反應體系；盧家仕等[9]采用ISSR技術對云南及廣西地區石斛屬親緣關系進行了研究，將24份不同產地石斛樣品劃分為 6個類群，揭示了居群間豐富的遺傳多樣性，為石斛屬親緣關系的鑒定提供了依據。本研究采用ISSR標記，對秦巴山區不同海拔、不同地點12個居群的石斛屬進行基因組多態性研究，分析石斛樣品的遺傳多樣性和親緣關系，為更好地保護和利用本地區的石斛資源提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

實驗材料12個居群，共計514個個體，其中金釵石斛、曲莖石斛(圖1)和細葉石斛的居群數分別為6、4、2個。各居群的樣地信息和采樣個體數見表1，居群采樣時，每個個體間隔50 m以上，并將野外采集的個體引種栽培于實驗室備用。

1.2 ISSR標記

稱取新鮮石斛葉片5 g于研缽中液氮研磨，采用MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit(TaKaRa公司提供)提取基因組DNA，最后加入100μL×1TAE Buffer(pH8.0)溶解DNA。用紫外分光光度計檢測DNA樣品的濃度和純度，-20℃下貯存備用。根據哥倫比亞大學(UBC)公布的引物序列，從中篩選出穩定性好，重復性強且條帶清晰的引物作為本次實驗引物，引物編號及序列見表2。

表1 石斛屬采樣基本數據

圖1 石斛屬植物形態Fig.1 The morphology of Dendrobium

從每個居群選取4個個體進行預實驗，最終確定PCR擴增反應體系總體積為25 μL：包含1 μL Tks Gflex DNA Polymerase(TaKaRa公司提供)，12 μL 2×Gflex Buffer(TaKaRa公司提供)，1 μL基因組DNA，1 μL SSR引物，10 μL ddH2O。反應條件：94 ℃預變性5 min； 94 ℃變性45 s，53 ℃～57 ℃(視引物Tm而定)退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存。用含有Gold view的1.5%瓊脂糖凝膠于120 V恒壓電泳45 min。最后在凝膠成像系統(北京六一WD-9413B)上進行拍照并保存，用于后續分析。

1.3 數據統計與分析

當三喜突然撲出將那只呆頭呆腦的肥大野兔死死摁住的時候，他心里興奮的不是如何將它做成清蒸、紅燒或者烹炒的種種兔肉，與全家人一番大快朵頤，而是心里迅速就堅定了一個信念：我必須用槍來把它射殺，對，就是用槍，而不是其它的任何一種方式，以此給全村人一個說法：我三喜不但會打槍，而且槍法相當相當的準。不是說眼見為實嗎，那你們就好好看看吧，這，就是我三喜打死的兔子！

ISSR作為顯性分子標記視每一個多態位點為一個等位基因。在同一相對遷移位置出現清晰條帶的計為1，沒有或模糊的條帶記為0，將條帶數據信息構建成0和1的原始數據矩陣。使用POPGENE1.32軟件分析遺傳變異的各項參數：Nei’s基因多樣度指數(H)、平均每個位點上的觀察等位基因數(Na)、平均每個位點的有效等位基因(Ne)、Shannon多樣性信息指數(I)、居群間遺傳分化系數(Gst)、居群內基因多樣度(Hs)、總的基因多樣度(Ht)、基因流(Nm)等。利用NTSYS2.1軟件計算供試材料之間的遺傳距離，采用非加權類平均法(UPGMA)對遺傳距離進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA純度檢測

用TaKaRa 9770A試劑盒提取12份石斛基因組DNA后，經1% Agarose 電泳檢測，結果顯示：12個泳道都出現一條清晰的DNA條帶，無拖尾現象，表明蛋白質和 RNA的含量極少(圖2)。用紫外分光光度法檢測所有DNA的OD260/OD280值，均在1.85～1.98，質量濃度在 350～360 ng/μL。以上結果表明提取的DNA純度較高，質量濃度均勻，符合PCR模板的要求。

2.2 ISSR結果分析

圖3為引物UBC 900對12個石斛屬材料的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。其它引物都達到很好的擴增效果，表明選定的反應體系和PCR擴增程序效果較好，擴增產物可用于下一步的數據分析。

用ISSR引物UBC840、UBC 841、UBC 842、UBC 899、UBC 900對全部石斛屬樣本進行擴增檢測，擴增條帶清晰，如圖3中引物UBC 900對樣品擴增結果所示。表2分析表明，5條引物擴增共檢測到80個清晰的條帶，每條引物平均擴增出16個片段。采用POPGENE1.32軟件進行分析，5條引物在12個石斛屬居群中擴增的遺傳多樣性參數(表3)顯示：共檢測到13個等位基因，觀測的等位基因數(Na)3.4～8.2，平均等位基因數為5.38。有效等位基因(Ne)1.633～1.982，平均值為1.852。Nei’s基因多樣度指數(H)0.388～0.495，平均值為0.457。Shannon多樣性信息指數(I)0.576～0.689，平均值為0.649，表明5條引物擴展產物均具有多態性，可用于石斛屬各居群的遺傳多樣性分析。

M.DL2000；1．LJ；2．MT；3．YJ；4．WF；5．YP；6．PT；7．HS；8．QL；9．ZJ；10．HF；11．BM；12．CL；居群編號同表1；圖3同圖2 提取石斛DNA電泳圖M.DL2000；1．LJ；2．MT；3．YJ；4．Wsame as Table 1；The same as Fig.3Fig.2 DNA electrophoresis of Dendrobium Sw extracted with kit

圖3 引物UBC900對樣品的擴增結果Fig.3 ISSR bands of Dendrobium Sw amplified with primer UBC900

表2 ISSR引物序列及其PCR擴增的多態性

Note：Y=C/T

表3 石斛居群遺傳多樣性

表4 石斛屬居群多樣性Nei’s分析

2.3 石斛居群遺傳分化分析

石斛屬居群多樣性Nei’s分析(表4)顯示，金釵石斛6個居群Ht為0.388，Hs為0.158，Gst為0.934，即93.4%的變異存在于居群之間，6.6%的變異存在于居群內，結果顯示居群間的遺傳分化大于居群內的分化。居群間的基因流(Nm)為0.214，表明居群之間的基因流水平較低。曲莖石斛4個居群Ht為0.254，Hs為0.083，Gst為0.772，居群間的基因流(Nm)為0.136，說明遺傳變異主要來自于居群間。細葉石斛2個居群Ht為0.171，Hs為0.111，Gst為0.533，居群間的基因流(Nm)為0.214。物種間Nm為0.035，表明物種之間的基因交流幾乎不發生。

2.4 石斛屬聚類分析

采用POPGENE1.32軟件分析得出，石斛屬12個居群兩兩間的Nei’遺傳一致度(Hi)范圍為0.593 3～0.911 8，遺傳距離(D)為0.092 3～0.522 0(表5)。YJ與PT居群間遺傳一致度最高(Hi=0.911 8)，遺傳距離最近(D=0.092 3)；通過NTSYSpc-2.1聚類分析軟件構建各居群間親緣關系系統樹，并計算表5金釵石斛居群間遺傳相似系數(Gs)(圖4)。各材料間UPGMA聚類結果顯示，Gs范圍0.36～0.88，平均值為0.62。Gs最低值存在于細葉石斛和金釵石斛之間為0.36，這表明其親緣關系最遠；最高值0.88為金釵石斛YJ和PT居群之間，說明其親緣關系最近。金釵石斛6個居群按照遺傳距離遠近以及遺傳一致度高低聚為2個大支。其中YJ和PT遺傳高度一致，遺傳距離最近，首先聚在一起為CladeⅡ；LJ、MT、YP和WF遺傳一致度與地理距離較近聚為CladeⅠ。通過聚類分析也表明，細葉石斛與曲莖石斛先聚為一支，二者親緣關系較近；金釵石斛單獨聚為一支，與曲莖石斛、細葉石斛親緣關系較遠。

表5 石斛屬各個居群間的Nei’s遺傳一致度(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)

圖4 石斛屬UPGMA聚類圖Fig.4 UPGMA dendrogram of the genetic relationship of Dendrobium Sw

3 討 論

3.1 秦巴山區石斛屬遺傳多樣性與種間親緣關系

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，一個居群遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，表明其對環境變化的適應能力就越強。因此對遺傳多樣性的研究可以揭示物種或居群的進化歷史，也能為進一步分析其進化潛力和未來的命運提供重要的資料，尤其有助于物種稀有或瀕危原因及過程的探討。秦巴山區地處中國北亞熱帶向暖溫帶過渡地帶并對中國植物區系的演化與分化研究具有重要意義，該區域地貌類型豐富、氣候溫暖濕潤，是中國生物多樣性分布的中心地區之一[10]。本研究中，通過 ISSR標記顯示金釵石斛(D.nobileLindl)、曲莖石斛(D.flexicauleZ.H.Tsi)具有較高的遺傳多樣性。金釵石斛6個居群聚為2個大支，且CladeⅠ和CladeⅡ的遺傳分化明顯。曲莖石斛4個居群也聚為2類，但是HS居群和金釵石斛CladeⅡ的遺傳距離較近，究其原因可能是種群間還存在一定程度的基因流，針對石斛屬植物的特點而言，花粉的擴散可能是植物基因流主要形式。這一發現說明，居群內和居群間存在基因交流，秦巴山區石斛屬品種遺傳多樣性豐富，也為今后研究秦巴山區石斛屬種質資源進化發展提供依據。

3.2 秦巴山區金釵石斛遺傳多樣性及居群間遺傳分化

根據ISSR分析結果顯示，金釵石斛種下居群間Nei’s總基因多樣性(Ht)為0.388，基因分化系數Gst為0.934，這說明金釵石斛居群間存在較高的遺傳分化。這一較高的遺傳多樣性一方面可能與秦巴山區復雜的地質地貌有較大關聯[11-13]。山地的溫度、濕度、光照和土壤等環境因子較復雜，生活環境多變，可能會使物種的分布展現出較高的遺傳多樣性。這種現象在秦巴山區藥用植物群落物種多樣性的研究中也有發現[14]。另一方面，長期的地理隔離導致各居群間適應不同的環境，從而產生較大的遺傳變異，從NTSYSpc-2.1聚類分析來看CladeⅠ和CladeⅡ正好處在秦嶺山脈的兩側，居群間基因之間正常的交流可能被山脈所阻斷，基因流(Nm)較小為(0.214)也驗證了這一假設。

3.3 金釵石斛可持續利用與保護策略

金釵石斛是中國傳統的名貴中藥，在“神農本草經”中列為上品。現代醫學和中醫藥理研究表明，石斛在提高人體免疫能力、抗衰老、抑制腫瘤、補五臟虛勞等方面有明顯的效果，具有很高的藥用價值[15]。同時它還含有豐富的蛋白質和氨基酸，并含有豐富的Ca、Mg、P等無機元素，具有較高的營養價值[16-17]。秦巴山區是金釵石斛主要分布區之一，存在大量保存良好的野生資源。近年來，由于環境的破壞和人為掠奪性采挖，導致野生金釵石斛數量急劇下降。本研究通過石斛屬形態、經緯度及海拔生長特性結合ISSR分子標記，把同名異種、同種異名或不同地方來源的品種資源進行客觀的種質鑒定,弄清它們之間的遺傳變化及親緣關系，從而更好地指導科研和實踐生產工作，更好地開發、利用和保護秦巴山區石斛屬植物種質資源。通過聚類分析顯示，金釵石斛6個居群可明顯分為2支，居群間93.4%變異，居群內6.6%變異，居群間變異遠大于居群內，說明具有很高的遺傳分化。通過野外實地調查發現，金釵石斛各居群所處生境有很大不同。LJ、MT和YP居群位于自然保護區內，居群生境破壞較少，但也遭到了人們過度的采挖。WF、YJ和PT居群多位于非自然保護區，處于荒山野嶺，人類開墾、砍伐等因素干擾較明顯，導致這些居群的數量銳減，因此，對有巨大藥用價值的金釵石斛野生資源以及遺傳多樣性的保護意義重大。對現存金釵石斛居群應該采取一些有效的保護措施，針對LJ、MT和YP居群，其生境破壞較少，應主要采取就地保護，禁止人們過度采挖措施；針對WF、YJ和PT居群，應采取保護居群的生存環境的措施，同時在一些具有優良種質庫的地區進行育種繁殖，增加居群的數量。

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(編輯:宋亞珍)

Genetic Relationship of Dendrobium and Genetic Diversity of Dendrobium nobile in Qinling-Daba Mountains Revealed by ISSR

JIANG Aiming1，CAO Jun1，CAI Gaolei2*

(1 Faculty of Biochemistry and Environmental Engineering，Hanjiang Normal University, Shiyan，Huibei 442000, China；2 Shiyan Academy of Agricultural Science, Shiyan，Huibei 442000, China)

To understand the genetic relationship ofDendrobiumin Qinba，the genetic diversity of 12 populations was analyzed using five inter-simple sequence repeat(ISSR) markers．(1) The UPGMA analysis exhibited significant genetic differentiation amongD.nobileLindl，D.flexicauleZ. H. Tsi andD.hancockiiRolfe，which revealed that they are independent species．(2) Six populations ofD.nobilewere obviously divided into two branches，the populations of LJ, MT, YP and WF are classified as Clade I because of the close genetic consistency among them；the populations of YJ and PT are classified as CladeⅡdue to the highest degree of genetic consistency and genetic distance. (3) The Nei’s gene diversity (Ht) and coefficient of gene differentiation (Gst) ofD.nobilewere 0.388 and 0.934, respectively, which indicated that there were high diversity and gene differentiation among the populations ofD.nobile．Our findings clearly evidenced the genetic diversity ofD.nobilein different areas of Qinba, which will be used in identification and intellectual property protection．

Dendrobiumnobile；inter-simple sequence repeat(ISSR)；genetic diversity

1000-4025(2016)10-1977-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.1977

2016-04-10;修改稿收到日期:2016-10-08

湖北省教育廳(Q20156001)

江愛明(1982-)，男，碩士，講師，主要從事藥用植物育種研究。E-mail：jiangaiming2003@126.com

*通信作者:蔡高磊，碩士，農藝師，主要從事植物遺傳育種研究。E-mail：caigaolei@163.com

Q346+.5; Q789

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