芽孢桿菌T3菌株對鎘脅迫下蔞蒿生理特性和根際微生物的影響

周小梅，趙運林，董 萌，庫文珍

(1 湖南城市學院 建筑與城市規劃學院，湖南益陽 413000；2 中南林業科技大學，長沙 410004；3 湖南城市學院 化學與環境工程學院，湖南益陽 413000)

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芽孢桿菌T3菌株對鎘脅迫下蔞蒿生理特性和根際微生物的影響

周小梅1，趙運林2*，董 萌3，庫文珍3

(1 湖南城市學院 建筑與城市規劃學院，湖南益陽 413000；2 中南林業科技大學，長沙 410004；3 湖南城市學院 化學與環境工程學院，湖南益陽 413000)

為探討鎘(Cd)脅迫條件下蔞蒿對促生細菌(PGPB)的響應機制，以芽孢桿菌T3(Bacillussp.)菌株為對象，通過盆栽試驗，研究不同Cd處理水平下芽孢桿菌T3菌株對蔞蒿生長、生理、Cd富集轉運以及根際微生物的影響。結果表明：(1)在Cd脅迫條件下，芽孢桿菌T3菌株可顯著促進蔞蒿地上部、地下部及總干物質的積累，但對株高和根冠比的影響不明顯。(2)芽孢桿菌T3菌株能顯著促進Cd脅迫條件下蔞蒿對Cd的富集與轉運，相比單一Cd脅迫，蔞蒿地上部生物富集系數(BCF)增加了8.3%～29.3%，地下部BCF減少了6.6%～11.1%，同時轉運系數(TF)增加了20.8%～38.3%。(3)在Cd脅迫和芽孢桿菌T3菌株的共同作用下，蔞蒿葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量明顯增加。(4)芽孢桿菌T3菌株使Cd脅迫條件下蔞蒿體內丙二醛(MDA)含量顯著減少，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性明顯增加，可有效抵御由Cd脅迫所產生的氧化傷害。(5)芽孢桿菌T3菌株能顯著增加Cd脅迫條件下蔞蒿根際土壤細菌、放線菌數量及微生物總量，可減少蔞蒿根際土壤真菌的數量，但與對照差異不顯著。研究表明，在Cd脅迫條件下芽孢桿菌T3菌株對蔞蒿生長、生理和根際土壤微生物環境可產生積極影響，可增強蔞蒿植物對Cd脅迫環境的適應性，從而提高其對Cd的耐受能力。

促生細菌；鎘脅迫；蔞蒿；生長生理；根際微生物

近年來，由于工農業的快速發展和農藥化肥的不合理使用等，致使土壤發生嚴重重金屬污染[1]。鎘(Cd)毒性極強，一旦被農作物吸收富集，將危害極大。洞庭湖流域是湖南省乃至全國重要的農業生產區，濕地土壤Cd污染較為嚴重[2]，急需生態修復。蔞蒿(ArtemisiaselengensisTurcz.)屬菊科蒿屬多年生草本，俗稱蘆蒿、藜蒿等，是洞庭湖濕地優勢植物，是一種較具潛力的Cd污染修復植物[3]，但由于生物量相對較小，極大地影響了其在濕地Cd土壤污染修復中的運用。

植物促生細菌(plant growth-promoting bacteria，PGPB)近年來被廣泛運用于改善植物根際土壤微生物環境，促進植物生長，增強植物對逆境的適應，提高植物的修復效率等[4-6]。因此，研究蔞蒿對Cd脅迫環境中PGPB的響應機制極其重要。Ma等[7]研究表明，接種具鎳(Ni)抗性的PGPB菌株SRA2可使印度芥菜的生物量增加285%。Sheng等[8]將具多金屬抗性的PGPB菌株芽孢桿菌(Bacillussp. )J119接種到玉米、油菜等植物中，發現菌株J119可顯著促進重金屬向植物地上部轉運。Zhang等[9]研究發現，接種PGPB菌株后植株體內的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)以及過氧化氫酶(CAT)活性均顯著增加，增強了植物抵御逆境脅迫的能力。韓坤等[10]將芽孢桿菌(Bacillussp.)菌株接種到小麥根系后，發現鹽脅迫下小麥幼苗的葉綠素含量明顯增加，抗氧化酶活性顯著增強，有效緩解了鹽脅迫對小麥的毒害效應。趙青云等[6]發現，香草蘭接種枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)Y-IVI后，其根際微生態有明顯改善并且干物質重也顯著增加。然而關于PGPB對Cd脅迫下蔞蒿生長、生理與根際微生物的影響研究目前尚無報道。

因此，本研究通過盆栽試驗，以具促生功能的植物促生細菌芽孢桿菌T3菌株為對象，探討PGPB對不同Cd處理水平下蔞蒿生長、抗性生理、Cd富集轉運與根際微生物的影響，以揭示蔞蒿在Cd脅迫下對PGPB的響應機制，為洞庭湖濕地Cd污染土壤構建有效的生態修復技術提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

PGPB菌株T3分離自蔞蒿根際土壤，經鑒定為芽孢桿菌(Bacillussp.)。它能產酸、分泌吲哚乙酸(IAA)和合成鐵載體，對Cd2+的耐受濃度為50 mg·L-1[11]。在超凈工作臺上，挑取少量T3菌體于液體LB培養基中，于培養箱內震蕩培養16 h(30 ℃、150 r·min-1)，菌液經離心 5 min(4 ℃、8 000 r·min-1)后，倒出上清液，用無菌生理鹽水潤洗2次，再用無菌生理鹽水調節菌懸液濃度為6.8×108cfu·mL-1，制成接種菌劑。

基質是采用購自湖南省長沙市紅星花卉大市場的營養土，經測定全Cd含量為0.25 mg·kg-1，自然風干與滅菌處理后，添加不同濃度的Cd(以Cd2+計算，使各處理培養基質中Cd2+濃度分別為0、10、20、30 mg·kg-1)，并施入N、P、K復合肥100 mg·kg-1拌勻，于實驗室平衡備用。

蔞蒿植株采自南洞庭湖管竹山(112°19′33.4″E，28°55′14.9″N)，并定植于湖南城市學院苗圃。為保證試驗用苗的一致性，剪取長勢基本一致的蔞蒿莖段若干于苗圃大棚進行扦插栽培。

1.2 試驗設計

2014年8月18日，將平衡了45 d的基質進行裝盤(孔穴盤的底徑為3 cm、高為8.5 cm、上口徑為6.2 cm)，每穴稱裝基質100 g，量取菌劑50 mL，以等量無菌生理鹽水為對照(CK)，與基質充分混勻。選取生長健壯的、長勢基本一致的蔞蒿扦插苗若干(帶3片完全展開葉)移栽至孔穴盤，每處理移栽16株，澆透水，置于湖南城市學院苗圃大棚，正常養護管理60 d后(蔞蒿生長期間棚內氣溫為25 ℃～37 ℃，相對濕度為60%～90%，盤內土壤含水量為70%～80%)，取樣進行各指標的測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 植株生長指標 將從孔穴盤中取出的蔞蒿植株于自來水下沖冼干凈，并于Na2-EDTA溶液(濃度為20 mmol·L-1，為去除吸附在根表面的Cd2+)中浸泡20 min，之后去離子水反復沖冼并吸干多余水分。直尺測量蔞蒿植株的株高，置于烘箱中，105 ℃殺青15 min，75 ℃烘干至恒重，分別稱量蔞蒿植株的總干重、地下部和地上部干重并計算根冠比。

根冠比=地下部干重/地上部干重。

1.3.2 植株生理生化指標 選用蔞蒿植株的第4葉進行葉綠素、丙二醛(MDA)含量及SOD、POD和CAT活性的測定。參照李合生[12]的方法進行葉綠素含量，SOD、POD與CAT活性的測定[12]，參照Cakmak和 Marschner[13]的方法進行MDA含量的測定。

1.3.3 植株鎘含量、富集系數和轉運系數 將各處理的蔞蒿地下部與地上部干樣分別研磨粉碎，并稱取樣品0.2 g，參照梁泰帥等[1]方法進行樣品的消解，采用原子吸收分光光度計法測定其地下部和地上部Cd含量，并計算總Cd含量、生物富集系數(BCF)以及轉運系數(TF)。

BCF=植株組織中Cd含量/土壤中Cd含量)；

TF=植株地上部Cd含量/植株地下部Cd含量)。

1.3.4 根際土壤微生物數量 輕輕抖動從孔穴盤中取出的蔞蒿植株，即附著在根系上的土為根際土壤，參照李振高等[14]方法進行根際土壤細菌、真菌和放線菌數量的測定。

1.4 數據統計分析

采用Excel 2003處理數據，SPSS19.0統計分析，LSD做差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌 T3菌株對鎘脅迫下蔞蒿生長特性的影響

由表1可知，蔞蒿株高、地下部、地上部及總干重與根冠比均隨Cd脅迫濃度的增加表現為先增后減的趨勢，并在CK20和T20處理水平下達到最大值，且最大值大多與相應對照(CK0和T0)差異顯著。與單一Cd脅迫(CK)相比，T3菌劑和Cd2+共同處理的蔞蒿上述生長指標均不同程度增加，T0、T10、T20處理的地上部干重、總干重以及T20處理的地下部干重的增幅均達到顯著水平，其中T20處理地下部干重、地上部干重、總干重分別比CK20顯著增加25.0%、15.1%和15.9%。另外，與CK相對，蔞蒿地下部干重的增幅(22.2%～28.6%)遠大于地上部(5.0%～17.0%)。除此，與CK0相比較，CK30處理的地上部干重和總干重均顯著降低，T30處理的地上部干重雖仍顯著降低，但其總干重已與CK0無顯著差異。可見，適宜濃度Cd脅迫能明顯促進蔞蒿植株生長，但過高濃度Cd脅迫卻顯著抑制其干物質積累，芽孢桿菌 T3菌株能夠有效促進Cd脅迫環境中蔞蒿干物質積累，緩解高濃度(30 mg·kg-1)Cd脅迫造成的傷害。

2.2 芽孢桿菌 T3菌株對鎘脅迫下蔞蒿葉綠素含量的影響

研究表明，隨Cd脅迫濃度的增加蔞蒿葉綠素含量呈先升后降的趨勢，在CK10和T10處理水平下，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量均達最大值并與相應對照(CK0和T0)差異顯著，之后隨Cd脅迫濃度的增加均呈下降趨勢(表2)。與單一Cd(CK)脅迫相比，蔞蒿葉綠素a含量在T10和T30處理水平下顯著增加10.1%和14.1%，而葉綠素b和總葉綠素含量在所有處理水平下均顯著增加且增幅分別為14.1%～40.4%和8.8%～20.6%(表2)。可見，適應濃度Cd脅迫有利于促進蔞蒿葉綠素含量的增加，而高濃度Cd脅迫則引起其含量的減少，芽孢桿菌 T3菌株有利于促進Cd脅迫環境中蔞蒿葉綠素含量的增加。

2.3 芽孢桿菌 T3菌株對鎘脅迫下蔞蒿MDA含量與抗氧化酶活性的影響

首先，研究表明，隨Cd脅迫濃度的增加蔞蒿MDA含量呈上升趨勢，與CK0相比，CK10、CK20和CK30處理水平下MDA含量均顯著增加，但與T0相比，T10處理水平下蔞蒿MDA含量變化不明顯。與單一Cd(CK)脅迫相比，蔞蒿MDA含量明顯下降，其中在T20和T30處理水平下，MDA含量顯著減少了13.7%和19.4%(表3)。其次，從表3可以看出，隨Cd脅迫濃度的增加蔞蒿SOD、POD和CAT活性呈先升后降的趨勢，在CK10和T20處理水平下，SOD、POD和CAT活性達最大值并與相應對照(CK0和T0)差異顯著，之后隨Cd脅迫濃度的增加，SOD、POD和CAT活性呈下降趨勢。與單一Cd(CK)脅迫相比，蔞蒿SOD、POD和CAT活性在T10、T20和T30處理水平下顯著增加6.3%～27.1%、12.7%～43.1%和14.1%～45.8%。另外，與CK0相比，CK30處理下的SOD、POD和CAT活性均顯著降低，而T30處理下的CAT活性仍顯著增加，雖然SOD、POD活性有所下降，但差異不顯著。可見，Cd脅迫處理增強了蔞蒿的膜質過氧化程度，促進其MDA含量的增加，適宜濃度Cd脅迫處理可增強蔞蒿體內的抗氧化酶活性，芽孢桿菌 T3菌株能顯著減少Cd脅迫條件下蔞蒿的MDA含量并增強其抗氧化酶活性。

表1 芽孢桿菌 T3菌株對鎘脅迫下蔞蒿生長特性的影響

注: 處理組合中，CK和T分別表示無菌生理鹽水和T3菌劑處理，0、10、20、30分別表示Cd脅迫濃度(mg·kg-1)；同列不同小寫字母表示5%水平上的差異顯著；下同

Note: in the process of combination, CK and T represent sterile saline and T3 inoculants, respectively; 0,10,20 and 30 represent Cd stress concentration(mg·kg-1), respectively; the different normal letters in the same column mean significant difference at the 5% level; the same as followed

表2 芽孢桿菌T3菌株對鎘脅迫下蔞蒿葉綠素含量的影響

2.4 芽孢桿菌 T3菌株對鎘脅迫下蔞蒿Cd富集轉運的影響

首先，與CK0和T0相比，各濃度Cd脅迫處理蔞蒿地下部、地上部與總Cd含量顯著增加，且隨Cd脅迫濃度的增加呈上升趨勢；與單一Cd(CK)脅迫處理相比，芽孢桿菌 T3菌株處理促進了蔞蒿地上部Cd的積累和總Cd含量的增加，而減少了地下部Cd的含量，其中T10、T20和T30處理蔞蒿地上部Cd含量，以及T20和T30處理蔞蒿從土壤中富集的總Cd含量均顯著增加，而T20和T30處理地下部Cd含量顯著減少；相同處理下，蔞蒿地上部Cd含量明顯大于地下部含量(表4)。

其次，生物富集系數(BCF)是評價植物從土壤中富集重金屬能力強弱的指標[1,15]。表4顯示，與CK0和T0相比，各濃度Cd脅迫處理蔞蒿地上部和地下部的BCF值均顯著增加，且隨Cd脅迫濃度的增加呈下降趨勢，并分別在T10和CK10處理下達到最大值。與單一Cd(CK)脅迫相比，芽孢桿菌 T3菌株處理蔞蒿地上部BCF值顯著增加8.3%～29.3%，而地下部BCF值降低了6.6%～11.1%；在相同處理下，蔞蒿地上部的BCF值明顯大于地下部，表明地上部是蔞蒿富集Cd的主要部位。

再次，轉運系數(TF)可用來評價植物將重金屬由地下部轉運至地上部的能力[1,15]。從表4可知，與CK0和T0相比，各濃度Cd脅迫處理蔞蒿TF值都不同程度降低，并隨Cd脅迫濃度的增加基本呈下降趨勢，CK20和CK30處理下達到顯著水平；相比單一Cd(CK)脅迫，芽孢桿菌 T3菌株處理蔞蒿TF值顯著增加了20.8%～38.3%。

以上結果說明：Cd脅迫處理可顯著增加蔞蒿對Cd的生物富集，但卻降低了蔞蒿對Cd的轉運，芽孢桿菌 T3菌株促進了Cd脅迫條件下蔞蒿地上部對Cd的富集，但卻降低了蔞蒿地下部Cd的富集量，促進了Cd向蔞蒿地上部的轉運。

2.5 芽孢桿菌 T3菌株對鎘脅迫下蔞蒿根際土壤微生物的影響

從表5可以看出，蔞蒿根際土壤細菌、放線菌、真菌和微生物總數均隨Cd脅迫濃度的增加呈先升后降的趨勢，在CK20和T20處理水平下，細菌、放線菌和微生物總數均達最大值并與相應對照(CK0和T0)差異顯著，在CK10和T10處理水平下，真菌數量達到最大值并與相應對照(CK0和T0)差異顯著。另外，與CK0和T0相比，CK30和T30處理下真菌數量仍有所增加，雖然CK30處理下放線菌數量顯著低于對照，但T30處理下其數量仍顯著高于對照。與單一Cd(CK)脅迫相比，蔞蒿根際土壤細菌和微生物總數在所有的處理水平下均顯著增加，真菌數量略有減少，在T0、T10和T30處理水平下，放線菌數量顯著增加。可見，適宜濃度Cd脅迫能明顯增加蔞蒿根際土壤細菌、放線菌和微生物總數，但過高濃度則引起其數量的下降，真菌數量在所有的Cd脅迫條件下均高于相應對照(CK0和T0)，芽孢桿菌 T3菌株能明顯增加Cd脅迫條件下蔞蒿根際土壤細菌、放線菌和微生物總數，但對真菌影響不明顯。

表3 芽孢桿菌T3菌株對鎘脅迫下蔞蒿MDA含量與抗氧化酶活性的影響

表4 芽孢桿菌 T3菌株對鎘脅迫下蔞蒿Cd富集轉運特征的影響

表5 芽孢桿菌T3菌株對鎘脅迫下蔞蒿根際土壤微生物數量的影響

3 討論與結論

Cd的生物毒性和遷移性極強，進入植物體可產生多種傷害，其中生物量的變化是植物響應Cd脅迫的綜合反映[1]。相關研究表明， PGPB菌株能合成鐵載體與土壤中難溶性的氧化態高價鐵螯合形成可溶性的鐵-鐵載體復合體，可滿足植物生長對鐵素的需求；另外PGPB菌株可通過分泌IAA來促使植物對土壤中養分的吸收，進而促進植物的生長[16-18]。本研究中的芽孢桿菌 T3菌株鐵載體的合成量為5.5 μmol·L-1，IAA的分泌量為7.583 mg·L-1[11]，相比單一Cd脅迫，蔞蒿地下部干重、地上部干重、總干重均有顯著增加，說明芽孢桿菌 T3菌株可促進Cd脅迫環境中蔞蒿干物質的積累，并在一定程度上能增強蔞蒿植株對Cd脅迫的適應性反應。另外，本研究中蔞蒿地下部干物質重的增幅遠大于地上部，可能是由于芽孢桿菌 T3菌株的作用促使Cd向蔞蒿地上部轉運，減輕了其地下部Cd的脅迫傷害。

同時，Cd脅迫會影響植物的抗性生理[19]。葉綠素含量的高低通常作為植物干物質積累能力與抗性生理的評價指標[19-20]。Cd脅迫會影響葉綠體的結構與功能，從而抑制其生物合成[19]。接種PGPB菌株或施入PGPB菌肥能有效提高植物葉綠素酶的催化能力，從而可顯著提高植物葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的含量，提高其干物質積累并增強其抗逆性[21-22]。在本研究中，接種芽孢桿菌 T3菌株后，Cd脅迫環境中的蔞蒿植株葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量均顯著增加，說明芽孢桿菌 T3菌株在一定程度上可提高蔞蒿植株的光合能力并可促進其干物質的積累，這一結論與表1的結果是相吻合的。

BCF和TF是表征植物從土壤中富集重金屬并向地上部轉運的重要指標[1,15]。據報道，PGPB菌株①可通過分泌低分子量有機酸來降低土壤的pH，從而增加土壤中重金屬的植物有效性；②可通過產生鐵載體來增加土壤中重金屬離子的流動性，從而促進植物的吸收；③可通過分泌有機配位體來與重金屬螯合，從而促進重金屬向植物地上部的轉運[18]。在本研究中，與對照(CK)相比，芽孢桿菌 T3菌株作用后，蔞蒿地上部Cd和總Cd含量明顯增加，而地下部Cd含量顯著減少，與此同時，蔞蒿地上部BCF和TF值均明顯增加，表明芽孢桿菌 T3菌株可促進蔞蒿對Cd的富集與轉運。另外，蔞蒿地下部BCF顯著減少，說明在Cd脅迫環境中，芽孢桿菌 T3菌株可減輕蔞蒿地下部受到的傷害程度，這也說明了為什么在芽孢桿菌 T3菌株的作用下蔞蒿地下部干物質重的增幅要遠大于地上部。

另外，土壤微生物數量和結構的變化可作為植物根際土壤質量評價的重要指標[26]。重金屬脅迫會導致植物根際土壤環境質量的下降[27]。接種PGPB菌株可增強植物根際土壤微生物活性，增加根際土壤細菌數量和微生物總量，明顯降低真菌數量，促使土壤由真菌型向細菌型轉變，可有效改善植物根際土壤的微生物環境[28-29]。本研究中，相比單一Cd(CK)脅迫，蔞蒿根際土壤細菌、放線菌數量和微生物總數均顯著增加，而真菌數量略有減少。原因可能是由于芽孢桿菌 T3菌株作用后促進了蔞蒿根系的生長，為細菌和放線菌的大量繁殖提供了營養[9]。這也表明芽孢桿菌 T3菌株有改善受損土壤生態系統的可能，為蔞蒿植株的生長提供一個較健康的生長環境，進而促進其干物質積累。

綜上所述，與對照(CK)相比，芽孢桿菌 T3菌株顯著增強了蔞蒿植物的抗逆性，促進Cd向蔞蒿地上部的轉運并有效改善其根際土壤微生物環境，進而促進其干物質積累。該研究為洞庭湖濕地Cd污染土壤構建有效的生態修復技術奠定了理論基礎。

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(編輯:裴阿衛)

Effect of Bacillus sp. T3 on Growth，Physiology and Rhizosphere Microorganisms of Artemisia selengensis under Cadmium Stress

ZHOU Xiaomei1, ZHAO Yunlin2*, DONG Meng3, KU Wenzhen3

(1 College of Architecture and Urban Planning,Hunan City University,Yiyang ,Hu’nan 413000, China; 2 Central South University of Forestry Science and Technology, Changsha 410004, China;3 College of Chemistry and Environment Engineering, Hunan City University, Yiyang,Hu’nan 413000, China)

To explore response mechanism ofArtemisiaselengensison plant growth-promoting bacteria (PGPB) under cadmium stress, this study examined the effects of strain T3 on growth, physiology characteristics, cadmium concentration and translocation and rhizosphere microorganisms ofA.selengensisunder different concentrations of cadmium by pot experiment. The results indicated that (1)Bacillussp.T3 could distinctly promote the accumulation of shoot,root and total dry weight, but had no significant difference in plant height and root-shoot ratio ofA.selengensisunder cadmium stress. (2)Bacillussp.T3 could distinctly increaseA.selengensisto cadmium concentration and translocation, bioconcentration factors (BCF) of cadmium in shoot increased by 8.3%-29.3%, translocation factors(TF) increased by 20.8%-38.3%, but BCF in root reduced by 6.6%-11.1% compared with the single cadmium stress. (3) Under the joint action of cadmium stress andBacillussp.T3,A.selengensischlorophyll a, chlorophyll b and total chlorophyll contents significantly enhanced compared with the single cadmium stress. (4)Bacillussp.T3 could significantly enhance the activities of superoxide dismutase(SOD), peroxidase(POD) and catalase(CAT), whereas significantly reduced the malondialdehyde(MDA) content ofA.selengensis. Therefore it could effectively strengthenA.selengensisto resist oxidation damage produced by cadmium stress. (5) Under cadmium stress,Bacillussp.T3 could significantly improve the number of bacteria, actinomyces and the total number of microorganisms ofA.selengensisrhizosphere soil, but could not distinctly reduce the number of fungi compared with CK. The study suggested thatBacillussp.T3 was conducive to improve growth, physiology and rhizosphere microorganisms environment ofA.selengensisand then strengthenA.selengensisadaptability to cadmium stress environment as well as tolerance.

plant growth-promoting bacteria;cadmium stress;Artemisiaselengensis;growth and physiology; rhizosphere microorganisms

1000-4025(2016)10-2030-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.2030

2016-03-30;修改稿收到日期:2016-10-03

湖南省自然科學基金(2015JJ4012，2016JJ4015)；湖南省教育廳優秀青年項目(15B045)

周小梅(1977-)，女，博士，副教授，主要從事土壤污染生態修復研究。E-mail:864759100@qq.com

*通信作者:趙運林，教授，博士生導師，主要從事濕地生態研究。E-mail:zyl8291290@163.com

Q945.79

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