一種煙草細菌性病害病原菌分離培養及致病性測定

蔣承耿+瞿鴻飛+王忠宇

摘要：從貴州六盤水煙區采集感病煙株，采用組織分離法進行病原菌分離純化，并將培養條件進行優化，以南江3號煙草品種為試材，進行病原菌致病性測定。結果表明，該菌培養最適NaCl濃度4%，葡萄糖濃度10%，pH值5～7，培養溫度25～30℃，最佳侵染溫度20～25℃，相對濕度70%以上，該病害應屬于中溫高濕侵染病害。

關鍵詞：煙草；病原菌；分離培養；致病性

中圖分類號：S435.72 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）11-0072-04

Abstract The isolation and purification of pathogen of a tobacco bacterial disease was conducted from tobacco-growing areas in Liupanshui of Guizhou Province using the issue separation method. Its culture conditions were optimized， and the pathogenicity was measured with Jiangnan 3 as material. The results showed that the optimum growth conditions of this pathogen were 4% of salt concentration， 10% of sugar concentration， 5 to 7 of pH value， and 25～30℃ of cultivation temperature. And the best infesting conditions of this pathogen were 20～25℃ of infesting temperature， and more than 70% of relative humidity. Thus， the disease was easy to infection under middle temperature and high humidity conditions.

Keywords Tobacco； Pathogen； Isolation and culture； Pathogenicity

煙草作為我國重要的經濟作物，其產業的良好發展得到廣泛關注[1]。而煙草細菌性病害是威脅煙草生產的主要病害之一，其發生普遍且危害嚴重，嚴重影響著煙草的質量和產量，進而導致經濟效益極大受損。已經報道的細菌性病害有青枯病、細菌性角斑病、野火病、空莖病、細菌性黑桿病等[2-8]。余磊等于2004年報道了云南文山州西疇縣和保山市昌寧縣發現1種由細菌銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）侵染引起的煙草新病害[1]。2007年，筆者在貴州省盤縣煙區忠義、保田發現一種煙草未知病害，該病害在忠義鄉開始零星發生，主要為害煙株中下部葉片葉柄，造成葉片呈水浸狀腐爛，發病嚴重時，煙株中下部莖稈與葉柄連接處開始出現水浸狀斑點，最后呈潰瘍狀腐爛，2009年發生面積達60多公頃，重病田塊病株率達100%，嚴重田塊造成絕收，2010年發生面積增大，有逐漸蔓延趨勢，嚴重制約著該地區烤煙生產。本試驗對該病的病原菌進行培養條件優化及致病性測定，以明確其生物學特性，為病害防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試煙草品種 從盤縣忠義發病煙田采回發病煙葉及莖稈（品種：南江3號），室內接種鑒定品種南江3號。

1.1.2 主要試劑 牛肉膏 （北京奧博星生物科技有限責任公司）； 蛋白胨 （北京雙旋微生物培養基制品廠）；瓊脂 （福建莆田市聯邦瓊脂有限公司）； NaCl （重慶川江化學試劑廠）。

1.1.3 培養基配方 NA培養基：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，瓊脂 20.0 g，pH 6.8～7.0，加水定容到1 000 mL，121℃濕熱滅菌20 min。

JNFb培養基：DL-蘋果酸5 g·L-1、K2HPO4 0.6 g·L-1，KH2PO4 1.8 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，CaCl2·H2O 0.2 g·L-1，FeEDTA 0.066 g·L-1，溴香酚藍指示劑2 mL，微量元素2 mL，KOH 4.5 g·L-1，pH 5.8，固體培養基加入瓊脂17 g。微量元素成分如下：Na2MoO4·2H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.235 g，H3BO3 0.28 g，CuSO4·5H2O 0.008 g，ZnSO4·7H2O 0.024 g，溶于200 mL蒸餾水中。

1.2 病原菌的分離純化

病原菌分離參照伯杰氏細菌手冊[9]及饒小麗試驗方法[10]。將病株莖稈表面用清水洗凈晾干，再用85%酒精擦拭，迅速過火燒盡酒精，用消過毒的解剖刀刮去表面皮層，刮其褐色組織，置于無菌培養皿中，滴入2滴無菌水，用無菌玻棒搗碎組織，靜置5 min，用玻棒取搗碎組織液在NA培養基上劃線，28℃培養48 h。待培養基上長出菌落后，挑取小圓形、稍隆起、白色稀湯狀、有光澤菌落于NA培養基上培養，純化3～4次，然后再挑取單一菌落，置于裝有10 mL無菌水的試管中，保存菌種備用。

1.3 病原菌菌懸液制備

用滅菌接種環蘸取1.2中純化菌種，在NA培養基上劃線，于28℃恒溫箱中培養。待病原菌在NA培養基上長滿培養皿后，取病原菌于3 mL無菌水中配制成菌原液，經系列稀釋，配制濃度約1×108 cfu·mL-1的病原菌懸浮液。

1.4 菌體培養條件優化

1.4.1 菌株耐鹽性試驗 在JNFb培養基中加入NaCl調節鹽濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%，以不加NaCl為對照。每處理重復3皿，每皿接種1×106 cfu·mL-1濃度病原菌懸浮液2 mL，在28℃恒溫培養箱培養24 h后觀測細菌數量，以測定細菌耐鹽性。

1.4.2 菌體最適糖濃度試驗 在鹽濃度為4%的JNFb培養基中分別加入5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%葡萄糖，以不加葡萄糖為對照。每處理重復3皿，每皿接種1×106cfu·mL-1病原菌懸浮液2 mL，在28℃恒溫培養箱培養24 h后觀測細菌數量，以測定最適生長糖濃度。

1.4.3 菌體最適生長酸堿度試驗 在鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%的JNFb培養基中采用鹽酸和氫氧化鈉將pH值分別調為3、4、5、6、7、8、9、10。每處理重復3皿，每皿接種1×106cfu·mL-1病原菌懸浮液2 mL，在28℃恒溫培養箱培養24 h后觀測細菌數量，以測定菌體最適生長酸堿度。

1.4.4 菌體最適培養溫度試驗 在鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%、pH值調為5～7的JNFb培養基中每皿接種1×106 cfu·mL-1病原菌懸浮液2 mL，置于在5、10、15、20、25、30、35、40、45℃恒溫培養箱培養中。每處理重復3皿，24 h后觀測細菌數量，以測定最適培養溫度。

1.5 病原菌致病條件

1.5.1 接種濃度試驗 調節JNFb液體培養基鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%、pH值為5～7，接種致病菌菌懸液，接種濃度設為1×10、1×102、1×103 、1×104、 1×105、1×106、1×107、1×108 cfu·mL-1，另設清水對照（CK），共9個處理。每處理重復3盆，苗齡40～50 d，接種后常溫培養，每天觀察致病情況。

1.5.2 致病溫度試驗 調節JNFb液體培養基鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%、pH值為5～7，致病菌菌懸液接種濃度1×108 cfu·mL-1，接種后置于15、20、25、30、35℃恒溫光照培養箱中培養，相對濕度為75%，共5個處理，每處理重復3盆，苗齡40～50 d，每天觀察致病情況。

1.5.3 致病濕度試驗 調節JNFb液體培養基鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%、pH值為5～7，致病菌菌懸液接種濃度1×108 cfu·mL-1，苗齡40～50 d，接種，置于人工氣候室培養，培養溫度25℃，濕度設50%、60%、70%、80%、90%共5個處理，每處理重復3盆。每天觀察致病情況。

2 結果與分析

2.1 病原菌培養條件

2.1.1 病原菌耐鹽性 在一定鹽濃度范圍內，該菌生長量隨鹽濃度增加而增大，在含4%NaCl的培養基中生長量達到最大，而后降低，在鹽濃度10%時已不能再生長。表明，所分離到的細菌耐鹽性最大不能超過10%，最適生長鹽濃度為4% （圖1） 。

2.1.2 病原菌培養最適葡萄糖濃度 在不含葡萄糖培養基中，菌體能生長；隨著培養基含糖量增加，菌體生長量增大，在含糖量10%時，生長最為旺盛，而后，隨含糖量增加，菌體生長量減少，在含糖量達到35%時，菌體依然能夠生長，但生長量較小（圖2） 。

2.1.3 病原菌培養最適pH值 目標菌在pH 3～10較大范圍內都能生長，在pH 5～7之間有較高生長量，當pH值為6時最適合菌體生長（圖3）。

2.1.4 病原菌培養最適溫度 低于10℃的環境下菌株不能生長；至15℃時，菌株有少量生長，隨著溫度升高，生長量增大，在30℃生長量最大；然后隨溫度升高生長量降低，到40℃時依然有少量生長；到45℃時，菌株都不能再生長（圖4）。

2.2 病原菌致病條件

2.2.1 最佳接種濃度 1×10、1×102 cfu·mL-1和1×103 cfu·mL-1三個濃度處理未出現過敏性反應；1×104 cfu·mL-1和1×105 cfu·mL-1兩個濃度處理在接種后5～6 d出現輕微反應，在接種周圍表現葉肉黃化；1×106、1×107 cfu·mL-1和1×108 cfu·mL-1三個濃度處理3～4 d在接種周圍表現葉肉黃化，7 d葉柄邊緣表現壞死；對照未出現異常反應。表明，最佳接種濃度在1×106 cfu·mL-1以上，隨濃度增加，致病性反應加強。

2.2.2 最適致病溫度 在15℃時接種后7 d出現接種周圍葉肉黃化，10 d葉柄邊緣表現壞死；20℃接種后3 d出現致病性反應，接種周圍葉肉黃化，10 d葉柄邊緣表現壞死；25℃接種后第3 d出現致病性反應，接種周圍葉肉黃化，7 d葉柄邊緣表現壞死；30℃接種后第4 d出現致病性反應，接種周圍葉肉黃化，7 d葉柄邊緣表現壞死；35℃接種后5 d出現接種周圍葉肉黃化，10 d葉柄邊緣表現壞死。表明，在75%相對濕度下，最適侵染溫度在20～25℃。

2.2.3 最適侵染濕度 在25℃條件下， 50% RH處理接種后未出現侵染現象；60%RH處理接種后5 d出現接種周圍葉肉黃化，6 d葉柄邊緣表現壞死； 70% RH處理接種后3 d出現接種周圍葉肉黃化，5 d葉柄邊緣表現壞死； 80%、90% RH處理接種后2 d出現接種周圍葉肉黃化，4 d葉柄邊緣表現壞死。表明，最適侵染濕度應在70%以上，屬于高濕侵染病害。

3 小結

本試驗結果表明，該菌培養最適NaCl濃度為4%，葡萄糖濃度為10%，pH為 5～7，最適培養溫度在25～30℃之間。菌株最適侵染濃度在1×106 cfu·mL-1以上，最適侵染溫度在20～25℃之間，相對濕度在70%以上侵染速度快，因此該病害應屬于中溫高濕侵染病害。

參 考 文 獻：

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