好氧反硝化細菌LKX—1的分離、鑒定及初步應用研究

劉立立+蘭時樂+楊友才

摘要：為篩選分離好氧反硝化細菌菌株用于農村生活污水處理，從水稻田中分離高效好氧反硝化細菌菌株，并進行鑒定及除氮效果分析。結果表明，通過菌體、菌落形態特征和生理生化指標并結合16S rDNA序列分析將該菌株鑒定為蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）；農村生活污水除氮條件初步研究結果表明，在葡萄糖添加量0.03%、接種量0.00015%、搖床轉速120 r/min和發酵處理時間48 h條件下，總氮和亞硝酸鹽氮去除率分別達到91.55%和96.33%。

關鍵詞：好氧反硝化細菌；分離；農村生活污水；除氮率

中圖分類號：S154.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）11-0076-05

Abstract A high efficient aerobic denitrifier was isolated from rice field to dispose the rural domestic sewage， then the strain was identified and its nitrogen removal effect was analyzed. The results showed that the strain was identified as Pseudomonas monteilii through analyzing the cell morphology， colony morphology， physiological and biochemical characteristics combined with 16S rDNA sequence. The preliminary study on nitrogen removal conditions of rural domestic sewage showed that with the glucose additive amount of 0.03%， inoculation amount of 0.00015%， rotation speed of 120 r/min and cultural time of 48 hours， the removal rate of TN and NO-2-N reached 91.55% and 96.33% respectively.

Keywords Aerobic denitrifier； Isolation； Rural domestic sewage； Nitrogen removal rate

隨著我國農村生活水平的大幅度提高，農村生活污水中的COD、TN含量增加。據統計，我國農村生活污水每年的排放量為80～90億噸[1]。由于農村生活污水具有面廣分散、成分不穩定、排放不均勻、幾乎不含有毒有害有機污染物、水量系數變化大等特點，加上我國大部分農村沒有污水排放管網和污水處理系統，這些生活污水未經任何處理就直接排放到自然環境中，使得農村河道、地下水水體污染越來越嚴重，對生態環境造成了極大破壞。我國農村生活污水處理技術的研究起步較國外晚，目前國內較為成熟的處理技術主要有穩定塘處理技術[2]、人工濕地處理系統[3]、土地處理技術[4]和生物膜技術[5，6]等。盡管這些污水處理技術在實際應用中取得了一定效果，但也存在投資和處理成本較高、工藝復雜、占地面積大以及處理效果不穩定等缺點。因此，研究一種適合農村生活污水處理的技術，對解決農村污染問題具有迫切的現實意義。目前利用好氧反硝化菌來處理污水中氮素正得到廣泛關注和研究。本研究試圖通過篩選具有反硝化作用的目標菌，開展對農村生活污水的除氮研究，以期為好氧反硝化細菌在農村生活污水處理中的應用提供理論支持與實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 本試驗反硝化菌株篩選所用土壤來自湖南農業大學周邊水稻田，當天采集當天分離。

農村生活污水：取自長沙市某小區生活污水。

1.1.2 培養基 反硝化細菌富集、分離培養基：參照文獻[7]配制。

斜面培養基：牛肉膏蛋白胨培養基。

液體種子培養基：葡萄糖3%，蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NH4NO3 0.5%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH 7.0～7.5。

反硝化性能測定培養基（g/L）：參照文獻[7]配制。

發酵基礎培養基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH 7.0～7.5。

以上培養基均在121℃滅菌25 min。

1.1.3 主要試劑與設備 Na2HPO4·7H2O、KH2PO4 、NH4Cl、MgSO4·7H2O、HCl、KNO3、丁二酸鈉、葡萄糖（ 以上均為AR，國藥集團），NaNO2 （AR，上海山浦化工有限公司）。

高壓濕熱滅菌鍋（SS-325，TOMY.KOGYO.CO.LTD）、電熱恒溫干燥箱、單人單面超凈工作臺、可見光分光光度計（752型，上海光譜儀器有限公司）、恒溫搖床、恒溫培養箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 反硝化細菌的富集和初篩 稱取1 g水稻田土壤接種到裝有100 mL反硝化細菌富集培養基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min條件下富集48 h。然后按10倍稀釋法將富集液適當稀釋，分別取不同濃度的稀釋液0.1 mL接種到反硝化細菌分離固體培養基平板中央并涂布均勻，置于30℃恒溫培養箱中培養至長出單菌落。挑取菌落形態特征不同的單菌落于分離培養基平板上劃線純化后進行斜面保存并編號。

1.2.2 反硝化細菌的復篩 將初篩菌株的斜面菌種接種于液體種子培養基中，30℃、180 r/min恒溫振蕩培養24 h。然后將液體種子分別按2%（V/V）接種量接種在裝有100 mL滅菌反硝化性能測定培養基的250 mL錐形瓶中，30℃、180 r/min搖床恒溫振蕩培養48 h，按照文獻[8]測定發酵前后培養液中NO-2-N和總氮含量，計算亞硝酸鹽氮和總氮的去除率。

去除率（%）=（處理前污水含氮量-處理后污水含氮量）/處理前污水含氮量×100

1.2.3 篩選菌株的鑒定 ①形態及生理生化試驗。將待測反硝化細菌接種于牛肉膏蛋白胨培養基平板上活化2～3代，根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》[8]進行形態學和生理生化特征鑒定。

②菌株16S rDNA序列分析。用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取待分析反硝化細菌的16S rDNA，用引物27F（5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。PCR擴增產物經純化回收后，送上海生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果通過http：//www.ncbi.nih.nlm.gov網站用BLAST與GenBank數據庫中已有細菌的16S rDNA序列進行序列同源性比對，用MEGA 6.06的Neighbor-Joining法構建系統發育樹，并進行1 000次Bootstraps檢驗。

1.2.4 篩選菌株對農村生活污水的除氮效果 ①葡萄糖添加量對除氮效果的影響。在250 mL三角瓶中加入150 mL農村生活污水，分別加入0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和0.05%的葡萄糖，接種量為0.0002%（V/V），30℃、100 r/min恒溫振蕩培養箱中培養48 h，測定總氮和亞硝酸鹽氮含量，并計算總氮和亞硝酸鹽氮的去除率。每處理重復3次。

②接種量對除氮效果的影響。在農村生活污水中分別加入接種量為0.00005%、0.00010%、0.00015%、0.00020%和0.00025%（V/V）的液體種子，葡萄糖添加量按已優化值，其它條件不變，測定總氮和亞硝酸鹽氮含量，并計算總氮和亞硝酸鹽氮的去除率。

③搖床轉速對除氮效果的影響。將裝有農村生活污水的三角瓶分別置于60、80、100、120 r/min和140 r/min的恒溫振蕩培養箱中，葡萄糖添加量、接種量按已優化值，其它條件不變，測定總氮和亞硝酸鹽氮含量，并計算總氮和亞硝酸鹽氮的去除率。

④處理時間對除氮效果的影響。按前述優化條件處理，在處理24 h開始第一次取樣，以后每隔12 h取樣一次，直至培養72 h，測定總氮和亞硝酸鹽氮含量，并計算總氮和亞硝酸鹽氮的去除率。

2 結果與分析

2.1 好氧反硝化細菌菌株初篩結果

經富集分離，從水稻田土壤中分離到28株菌落形態特征差異明顯且具有反硝化能力的細菌，進一步純化后，保存于牛肉膏蛋白胨固體培養基斜面上，并分別編號LKX-1～LKX-28。

2.2 好氧反硝化細菌菌株除氮效果復篩結果

從篩選得到的28株菌株中選擇生長速度快的13株細菌進行除氮效果復篩，其總氮和亞硝酸鹽氮的去除率分別見圖1、圖2。可見，不同菌株對總氮和亞硝酸鹽氮去除的效果不同，其中菌株LKX-1對總氮和亞硝酸鹽氮去除率最高，分別達到66.22%和98.36%。因此選擇LKX-1進行后續試驗。

2.3 菌株LKX-1的鑒定結果

2.3.1 菌株形態及部分生理生化特征 菌株LKX-1的菌落形態特征為：乳白色，圓形，凸起，菌落表面濕潤粘稠，不透明，菌落大小為0.1～0.3 mm；菌體形態特征為：短桿狀，不產芽孢，具運動性，革蘭氏染色陰性；生理生化特征為：V-P、吲哚和氧化酶接觸試驗陰性，淀粉水解陰性，明膠液化陽性，乳糖和蔗糖發酵不產酸不產氣，葡萄糖發酵產酸不產氣。根據菌株形態特征和部分生理生化的結果，初步鑒定菌株LKX-1為假單胞菌屬。

2.3.2 菌株LKX-1的16S rDNA序列分析 序列同源性比對結果顯示，菌株LKX-1與Pseudomonas monteilii親緣關系最近，同源性最高，達99%。結合菌株的形態特征、生理生化特征、16S rDNA測序結果的同源性相似度比對及系統發育樹分析，確定該菌株為蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）（圖3）。

2.4 菌株LKX-1對農村生活污水的除氮效果

2.4.1 葡萄糖添加量對除氮效果的影響 由圖4可以看出，不同葡萄糖添加量對總氮和亞硝酸鹽氮的去除率影響較大。在一定范圍內，總氮和亞硝酸鹽氮的去除率隨葡萄糖添加量的增加而提高。當葡萄糖添加量為0.03%時，亞硝酸鹽氮去除率最高，達86.74%；而總氮去除率在葡萄糖添加量為0.02%時最大，且葡萄糖添加量超過0.02%，總氮去除率差異不顯著。綜合考慮對總氮和亞硝酸鹽氮的去除效果，選擇葡萄糖添加量為0.03%。

2.4.2 接種量對除氮效果的影響 由圖5可見，總氮和亞硝酸鹽氮去除率隨接種量增加變化趨勢不同。亞硝酸鹽氮去除率隨接種量的增加先上升后下降，當接種量為0.00015%時，去除率最大，達92.73%；而總氮去除率在接種量為0.00010%時迅速增加，后趨于穩定。因此選擇菌種接種量為0.00015%（V/V）。

2.4.3 搖床轉速對除氮效果的影響 氧氣濃度也是影響微生物生長和代謝的主要因素之一。對于好氧菌來說，氧氣濃度高，有利于微生物的生長和代謝。圖6結果顯示，在一定范圍內，隨搖床轉速增加，總氮和亞硝酸鹽氮去除率也隨之增加。當搖床轉速為120 r/min時，亞硝酸鹽氮去除率最高，達95.42%，搖床轉速超過120 r/min，亞硝酸鹽氮去除率下降；而總氮去除率一直隨搖床轉速的增加而增加，但搖床轉速在120～140 r/min之間，總氮去除率變化不顯著。因此，搖床轉速選擇120 r/min。

2.4.4 處理時間對除氮效果的影響 由圖7可以看出，總氮和亞硝酸鹽氮的去除率隨著發酵時間的延長而增加，當發酵時間為48 h時，總氮和亞硝酸鹽氮的去除率均達最高，分別為91.55%和96.33%；發酵處理時間超過48 h，亞硝酸鹽氮去除率略有下降，但差異不顯著，總氮去除率先下降后略有上升。

3 討論與結論

農村生活污水相對于城市生活污水而言，具有分散性和排放不集中等特點，難以采用城市生活污水的處理模式。好氧反硝化細菌包括泛養副球菌（Paracoccus pantotropha）、假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）的某一種、糞產堿菌（Alcaligenes faecalis）、Aquaspirillum、Thauera、生絲微菌屬（Hyphomicrobium）[9-11]等。蔡亞君等[12]分離到一株具有好氧反硝化特性的銅綠假單胞菌NO62，該菌在對數生長期硝態氮迅速被還原成亞硝態氮，繼續培養則亞硝態氮濃度也逐漸降低；吳美仙等[13]分離到一株具有較強反硝化作用能力的菌株（D），并對其發酵條件進行了研究；楊浩鋒等[14]從處理城鎮污水的移動床生物膜反應器中分離獲得一株反硝化細菌D3，研究表明其反硝化速率最大為19.86 mg/（L·h）。

本研究從水稻田土壤中分離到一株具有反硝化作用的細菌，通過形態特征、生理生化特征并結合16S rDNA序列分析，確定該菌株為蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）。初步探討了好氧條件下該菌株對農村生活污水除氮效果，表明在葡萄糖添加量0.03%、接種量0.00015%、搖床轉速120 r/min和發酵處理時間為48 h時，污水中的總氮和亞硝酸鹽氮的去除率分別達到91.55%和96.33%，具有良好的應用前景。

參 考 文 獻：

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