帕金森病患者外周血Th17/Treg平衡及相關細胞因子水平測定及意義

姜立剛， 慕振興， 孫博謙

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帕金森病患者外周血Th17/Treg平衡及相關細胞因子水平測定及意義

姜立剛， 慕振興， 孫博謙

目的 探討帕金森病(PD)患者外周血Th17/Treg平衡及相關細胞因子含量變化的意義。方法 收集50例PD患者(PD組)及50例健康體檢者(Control組)，采集所有研究對象外周血。采用流式細胞儀檢測外周血中Th17細胞及Treg細胞含量；采用ELISA檢測血漿中細胞因子TGF-β、IL-6和IL-17水平。結果 流式細胞計數結果顯示，PD組的外周血Treg細胞和Th17細胞水平較Control組均顯著增加(P均<0.01)，Treg細胞的增長程度明顯大于大于Th17細胞，同時PD組Treg/Th17細胞比較Control組也明顯增加(P均<0.01)。ELISA檢測結果顯示，與Control組相比，PD組的血漿TGF-β1、IL-6及IL-17含量均有顯著增加(P均<0.01)。結論 PD患者的外周血Treg/Th17平衡存在失衡，提示PD病理過程可能與其外周血Treg/Th17失衡有關。

帕金森病； Th17細胞； Treg細胞； TGF-β1； IL-6

帕金森病(PD)是一種由大腦黑質多巴胺神經元減少及腦區域α-突出核蛋白沉淀引起的神經退化性疾病，腦黑質神經元缺少導致紋狀體多巴胺的減少并出現一些運動性癥狀如運動遲緩、僵直及震顫等[1～3]。目前PD的神經元退化機制尚未研究透徹，可能涉及α-突出核蛋白聚集、氧化應激、線粒體復合物I活性缺失、鐵含量增加及蛋白質加工程序的改變等，而根據近年來流行病學和遺傳學的研究，PD的進展也和神經炎癥過程存在相關性[4，5]。炎癥反應通常與免疫反應有關，Th17細胞及Treg細胞作為重要的T細胞亞型，在機體的免疫反應中具有重要的調節作用，Th17細胞能夠分泌多種細胞因子，具有增強和促進炎癥反應的作用，與Treg細胞的生理功能相互拮抗，因此當機體發生炎癥等問題時，Th17/Treg細胞平衡比例將會發生變化[6～8]。這些研究結果提示引起帕金森病的神經炎癥反應可能也會導致血清中Th17/Treg細胞平衡比例發生變化，然而在目前的研究中，尚未見有關PD患者血清中Th17/Treg細胞平衡比例變化的報道。本文研究了50例PD患者及50例健康體檢者，分別比較兩組志愿者外周血Th17/Treg細胞比例差異，并檢測血清中相關細胞因子如TGF-β1、IL-6表達水平，探討血清中Th17/Treg比例及相關細胞因子如TGF-β1、IL-6在PD發生發展過程中的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 RPMI 1640培養基購自美國Thermo Scientific公司；胎牛血清購自美國Life Technologies公司；佛波酯PMA、離子霉素、莫能菌素、抗人IL-17A的FITC標記的單抗、抗人CD127的PE標記單抗購自美國eBioscience公司；抗人CD3的PE-cy5標記單抗、抗人CD8的PE標記單抗、抗人CD4的FITC標記單抗及抗人CD25的PE-cy5標記單抗購自美國Beckman Coulter公司；紅細胞裂解液購自美國Invitrogen公司；TGF-β1及IL-6 ELISA檢測試劑盒購自美國Market公司；流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；全波長酶標儀購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 病例選擇 于2011～2015年期間收集北華大學附屬醫院50例PD患者(PD組)及50例健康體檢者(Control組)，患者年齡40～74歲，平均58.6±12.7歲，患病年齡36～69歲，平均54.1±12.2歲，病程1～10 y ， 平均4.48±5.62 y，健康體檢者年齡41～76歲，平均57.1±15.3歲。PD組和Control組中所有研究對象均抽取10 ml外周靜脈血。本研究在所有研究對象完全知情的情況下進行，并經倫理委員會批準。

1.3 細胞及樣品準備 獲取外周血后將血細胞和血漿分離，血漿儲存于-80 ℃，用于檢測血漿中細胞因子TGF-β1和IL-6濃度，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心(室溫條件下3000 r/min離心10 min)分離單核血細胞。單核細胞采用RPMI 1640培養基(加入10%胎牛血清)重懸并使細胞密度保持每毫升2×106個/細胞。

1.4 流式細胞計數 Th17細胞采用的是CD3陽性表達、CD8陰性表達且IL-17陽性表達的T細胞，其染色步驟如下，在1.7 μg/ml莫能菌素存在下，于六孔板中加入25 ng/ml佛波酯PMA和1 μg/ml離子霉素刺激Th17細胞懸浮液，在37 ℃、5% CO2條件下培養5 h。將細胞轉移至管子中，采用PBS洗滌一次后加入10 μI抗人CD3的PE-cy5標記單抗和20 μl抗人CD8的PE標記單抗，在室溫條件下孵育15 min。按照說明書采用抗人IL-17A的FITC標記的單抗對細胞進行染色。Treg細胞采用的是CD4、CD25高表達及CD127低表達的T細胞，其染色步驟如下，將20 μI抗人CD127的PE標記單抗、20 μI抗人CD4的FITC標記單抗及10 μI抗人CD25的PE-cy5標記單抗加入到Treg細胞中室溫孵育20 min，加入2 ml紅細胞裂解緩沖液繼續孵育20 min。同型的對照用于非特異性結合的校正，Th17細胞和Treg細胞分別采用流式細胞儀進行分析。

1.5 ELISA檢測 血漿中細胞因子TGF-β、IL-6和IL-17水平采用ELISA試劑盒檢測，具體操作按照說明書進行，450 nm出的吸收值采用全波長酶標儀進行檢測。

2 結 果

2.1 外周血Th17細胞及Treg細胞含量檢測 為檢測PD組及Control組外周血中Treg細胞和Th17細胞水平，在熒光抗體標記兩種細胞后采用流式細胞儀分別對Treg細胞和Th17細胞進行計數，結果見表1及圖1所示，PD組和Control組的Treg細胞水平為6.57%±0.821%和2.31%±0.412%、Th17細胞為2.32%±0.469%和1.27%±0.328%、Treg/Th17細胞比為2.83±0.437及1.82±0.312。結果顯示，與Control組相比，PD組的外周血Treg細胞和Th17細胞水平均顯著增加(P均<0.01)，Treg細胞的增長程度明顯大于大于Th17細胞，同時PD組Treg/Th17細胞比也明顯增加(P均<0.01)。

2.2 血漿TGF-β1、IL-6及IL-17水平檢測 為考察PD組及Control組血漿中細胞因子TGF-β、IL-6和IL-17含量差異，采用ELISA法分別進行檢測，檢測結果見表2及圖2所示，PD組和Control組的TGF-β1含量為130±21.1 pg/ml及32.3±17.4 pg/ml、IL-6含量為42.3±7.32 pg/ml及21.4±6.47 pg/ml、IL-17含量為121±13.2 pg/ml及81.3±12.7 pg/ml。結果顯示，與Control組相比，PD組的血漿TGF-β1、IL-6及IL-17含量均有顯著增加(P均<0.01)。

表1 外周血Treg細胞、Th17細胞及Treg/Th17水平

表2 血漿TGF-β1、IL-6及IL-17水平檢測(pg/ml)

A、B、C分別代表外周血Th17細胞、Treg細胞及Treg/Th17水平，數據采用Mann-Whitney U檢驗分析

A、B、C分別代表血漿TGF-β1、IL-6及IL-17水平(pg/ml)，數據采用Mann-Whitney U檢驗分析

3 討 論

炎癥反應能夠刺激機體產生炎癥介質，從而是機體產生強烈的促炎和抗炎反應，進而使機體免疫功能產生異常。很多研究顯示，在機體免疫系統中，Treg細胞及Th17細胞在調節機體免疫功能過程中具有很重要的作用，兩種細胞通過多種途徑參與免疫功能調節，其相對水平相對穩定，使機體免疫功能達到穩定健康的狀態，而一旦機體發生炎癥反應，則機體內Treg細胞和Th17細胞比例將發生變化[9～12]，因此在研究炎癥反應中，對Treg細胞和Th17細胞比例進行檢測是一項比較有效的方式。近年來多項研究顯示，神經炎癥與多種神經退化性疾病如帕金森病、阿爾茨海默病、亨利頓病等存在相關性[13，14]，因此PD患者外周血中Treg細胞和Th17細胞比例很可能會因為神經炎癥而發生變化。

Th17細胞具有多種功能，能夠分泌IL-17，并誘導分泌IL-6等多種細胞因子，其中細胞因子IL-17是強致炎因子，因此在炎癥的發展過程中該細胞扮演重要的角色[15]。有研究顯示，在具有炎癥反應的機體外周血和組織中均發現Th17細胞和IL-17含量的顯著增加，這些發現提示在炎癥反應中的免疫應答與Th17細胞和IL-17存在很重要的關系[16]。本研究中，與Control組相比，PD組的Th17細胞含量均有顯著性增加(P均<0.01)，這一結果也提示Th17細胞與PD的發展存在相關性，并且這一結果與PD組血漿IL-17(P<0.01)相一致。

Treg細胞能夠分泌可溶性的細胞因子TGF-β1及IL-10等，其主要功能是通過下調自身免疫應答來調節免疫應答與T細胞在炎癥反應等過程中對抗原應答的平衡[17]。在炎癥反應過程中，Treg細胞含量會發生變化，研究顯示，機體在病毒感染引發炎癥時血清和組織Treg細胞數會顯著增加，Treg細胞增加能夠抑制T細胞的應答[18]。本研究中，我們發現與Control組相比，PD組患者外周血中Treg細胞含量顯著增加(P均<0.01)，且血漿中TGF-β1含量也有顯著性增加(P均<0.01)，這說明PD與Treg細胞的功能也存在相關性。

機體中Treg細胞與Th17細胞分別具有抑制和促進炎癥反應的功能，這一對生理功能相互拮抗的細胞含量比例(Treg/Th17)平衡在機體正常免疫功能的發揮中具有重要的作用[19]，通常情況下其指數在1.5～2.5之間，在多種免疫性疾病發生發展過程中，都會出現Treg/Th17平衡變化，因此Treg/Th17平衡可以作為多種免疫性疾病包括炎癥反應的一個主要指標。在本研究中，較Control組，PD組外周血Treg細胞與Th17細胞含量均出現了顯著性增加(P均<0.01)，其中Treg細胞含量增加則更為顯著，這導致了平衡發生變化，使PD組的Treg/Th17顯著高于Control組(P<0.01)，這指示PD患者Treg/Th17平衡失調。

強致炎細胞因子IL-17具有促進腫瘤壞死因子α(TNFα)及IL-6分泌的作用，而IL-6又能夠催化Th17細胞的形成，因此，Th17細胞、IL-17及IL-6含量的增加是具有因果性的。根據本研究結果，與Control組相比，PD組血漿IL-6水平也有顯著性增加(P<0.01)，這指示Th17細胞含量增加，也預示著在IL-6的催化促進下Th17細胞含量將進一步增加。另外本研究結果還顯示，PD組血漿TGF-β1含量也顯著增加，由于該細胞因子具有促進Treg細胞分泌更多的細胞因子，因而該細胞因子含量增加也將加重Treg/Th17平衡失調[20]。雖然細胞因子IL-6和TGF-β1水平均增加，但是顯然TGF-β1水平增加更為顯著，這提示TGF-β1促進Treg細胞含量增加將更顯著。

本文通過研究PD患者與健康體檢者外周血Treg/Th17平衡變化及血漿細胞因子TGF-β1、IL-6和IL-17水平變化情況，發現PD患者的外周血Treg/Th17平衡失衡，且與免疫相關的細胞因子TGF-β1、IL-6和IL-17在血漿中含量也均存在不同程度的增加。機體外周血Treg/Th17平衡失調顯示機體免疫機能的異常，而相關細胞因子TGF-β1、IL-6和IL-17含量的變化不僅印證了外周血Treg/Th17平衡失調結果，也提示了PD病理過程中機體免疫功能的異常。

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The significance of Treg/Th17 balance and the associated cytokines in the peripheral blood of Parkinson’s disease

JIANG Ligang，MU Zhenxing，SUN Boqian.

(Department of Neurology，Affiliated Hospital of Beihua University，Jilin 132013，China)

Objective To explore the roles of Treg/Th17 and the associated cytokines in the peripheral blood of Parkinson’s disease (PD) patients. Method The Blood blood samples were obtained from 50 PD patients (PD group) and 50 healthy volunteers (Control group). The percentage of Treg cells and Th17 cells were assessed by flow cytometry，respectively. The levels of TGF-β1，IL-6 and IL-17 of the plasma were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Result The frequencies of Treg and Th17 cells were significantly increased in the peripheral blood of PD patients(P<0.01)，but the increase of Treg cells was less than that of Th17 cells，which led to an increased ratio of Treg/Th17 cells. The plasma levels of TGF-β1，IL-6 and IL-17 were significantly increased in PD group (P<0.01). Conclusion The imbalance of Treg/Th17 exists in the peripheral blood of PD patients，and this suggests that the imbalance of Treg/Th17 may be associated with the PD.

Parkinson’s disease； Th17 cell； Treg cell； TGF-β1； IL-6

1003-2754(2016)03-0222-04

2016-01-29；

2016-03-06

吉林省科技廳青年科研基金項目(No. 20130522026JH)

(北華大學附屬醫院神經內科，吉林 吉林 132013)

孫博謙，E-mail：beihua78726@163.com

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