丁基苯酞對帕金森模型小鼠中腦黑質多巴胺能神經元數及TH、TNF-α蛋白表達的影響

耿海威， 馬麗麗， 王欲立， 楊 洋， 王占友， 聶瑩雪

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丁基苯酞對帕金森模型小鼠中腦黑質多巴胺能神經元數及TH、TNF-α蛋白表達的影響

耿海威1， 馬麗麗1， 王欲立2， 楊 洋2， 王占友3， 聶瑩雪4

目的 研究丁基苯酞(dl-3n-butylphthalide，NBP)對由MPTP誘導的C57BL/6小鼠帕金森模型中腦黑質多巴胺能神經元數及TH、TNF-α蛋白表達的影響，進一步探討其保護機制。方法 24只C57BL/6小鼠，隨機分成3組：正常對照組，MPTP組，NBP治療組。MPTP腹腔注射法制備帕金森模型，免疫組織化學法觀察中腦黑質TH陽性神經元細胞數，蛋白質印跡法觀察中腦黑質TH、TNF-α蛋白含量的變化。結果 (1)與正常對照組比較，MPTP組可見帕金森病小鼠中腦黑質TH陽性神經元明顯減少(P<0.01)；與MPTP組比較，NBP治療組帕金森病小鼠中腦黑質TH陽性神經元數目明顯增加(P<0.01)；(2)與正常對照組比較，MPTP組帕金森病模型小鼠中腦黑質TH蛋白表達減少(P<0.01)，而TNF-α蛋白表達增加(P<0.05)；(3)與MPTP組比較，NBP治療組帕金森病模型小鼠中腦黑質TH蛋白表達明顯增加(P<0.01)，而TNF-α蛋白表達減少(P<0.05)。結論 丁基苯酞可能通過提高中腦黑質中TH的含量及減少TNF-α炎性介質表達發揮對MPTP所致C57BL/6小鼠帕金森模型的神經元保護作用。

丁基苯酞； MPTP； TH； TNF-α

帕金森病(Parkinson disease，PD)為中老年人常見的神經系統變性疾病，其病理基礎是以中腦黑質致密部多巴胺(DA)能神經元大量變性、紋狀體多巴胺遞質含量顯著減少為特征，其紋狀體多巴胺遞質含量的降低程度與多巴胺能神經元數目的減少程度相一致[1，2]。近年來，一直試圖尋找有效的神經保護藥物，以阻止神經元變性和疾病進展。丁基苯酞(dl-3n-butylphthalide)可有效阻斷缺血性腦卒中的多個病理環節發揮神經保護治療，在氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等發病機制方面與帕金森病有共通點，目前尚缺乏丁基苯酞抑制炎癥反應發揮對帕金森病神經保護的文獻報道[3，4]。本實驗主要通過研究丁基苯酞對MPTP誘導的C57BL/6帕金森模型小鼠黑質多巴胺能神經元數量及TH、TNF-α的蛋白表達的影響，進一步探討丁基苯酞對帕金森多巴胺能神經元的炎性保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組 24只C57BL/6 小鼠隨機分為3組，每組各8只。(1)正常對照組(NS+植物油)：腹腔注射與MPTP組等體積生理鹽水5 d，再注射與治療組等體積植物油14 d；(2)MPTP組(MPTP+植物油)：MPTP( 30 mg/kg) 連續5 d腹腔注射，然后改用生理鹽水注射14 d；(3)治療組( NBP+MPTP)：MPTP( 30 mg/kg) 連續腹腔注射5 d，然后NBP(40 mg/kg)腹腔注射14 d(NBP由石藥集團恩必普藥業有限公司提供，植物油溶解后使用)。

1.2 帕金森動物模型的制備 月齡C57BL/6小鼠24只，體重20～30g，MPTP( 40 mg/kg) 連續腹腔注射5 d，間隔24 h。注射藥物后小鼠即刻出現步態蹣跚，易激惹，毛及鼠尾豎起，抓鼻，全身抽搐等反應，約5～10 min 后恢復常態，即視為模型制備成功。

1.3 免疫組織化學染色標本制備 每組動物于19 d處死后取腦組織進行固定石蠟包埋，取中腦黑質部位切片進行免疫組化染色。(1)烘片( 60～65 ℃) 4 h，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，0.01 mmol /L磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細胞3次，5 min /次，新鮮配制的 3%過氧化氫室溫下反應 10 min，0.01 mmol /L磷酸鹽緩沖液沖洗細胞3次，5 min/次，微波修復(檸檬酸緩沖液)，高火3.5～4 min，使其快速達到95 ℃，然后自然冷卻至室溫。0.01 mmol /L磷酸鹽緩沖液沖洗細胞3次，5 min/次，5%羊血清37 ℃封閉1 h，去掉多余羊血清后加入兔抗小鼠 TH 抗體(1∶200)、GFAP 抗體(1∶1000)，4 ℃過夜，37 ℃復溫1 h，0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液沖洗細胞3次，5 min /次，加入生物素化羊抗兔、抗鼠IgG(1∶50)，置 37 ℃室溫下反應1 h，辣根過氧化物酶(HRP)標記的ABC復合物于37 ℃室溫下反應1 h，0.01 mmo/L磷酸鹽緩沖液沖洗細胞3次，5 min /次，DAB顯色，室溫下反應 5～10 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。(2)陽性結果判定：根據實驗過程中 DAB 被辣根過氧化物酶氧化后呈現棕黃色的原理，進行陽性結果判定，免疫組織化學染色陽性細胞呈棕黃色。對每張切片中腦黑質特定高倍視野下全部陽性細胞進行計數。

1.4 蛋白質印跡技術檢測 將分離的黑質組織按比例加入裂解液(1 mmol/L Tris，50 mmol/L氯化鈉，0.03 μmol/L焦磷酸鈉，50 mmol/L氟化鈉，1% Triton X-100，1 mmol/L苯甲基-磺酰氟，1 mmol/L釩酸鈉，20 μg/ml抑肽酶)制成 50 mg/ml勻漿液，15000 r /min、4 ℃離心15 min，上清液80 ℃保存，采用二辛可寧酸( bicinchoninic acid，BCA)法測定裂解液中的總蛋白質含量；組織勻漿中加入2×樣品緩沖液對半稀釋，煮沸 5 min，6000 r/min 離心3 min，取上清液上樣，取30 μg樣品進行10%十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，分離蛋白質；轉膜后室溫下封閉2 h，加入一抗，置4 ℃過夜，再與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、抗鼠IgG(1∶1000，美國sigma公司)于室溫下孵育1 h，采用增強型化學發光顯色系統(美國 sigma公司)顯示蛋白條帶，感光在膠片上。

2 結 果

2.1 中腦黑質TH免疫組織化學結果 正常對照組中腦黑質TH陽性神經元排列整齊，形態正常，呈條帶狀；MPTP組與正常對照組比較TH陽性神經元數目減少，稀疏、散在，差異有統計學意義(P<0.01)；NBP組與MPTP組比較TH陽性神經元數目增多，細胞排列較整齊，差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 中腦黑質TH陽性細胞數量變化

*P<0.05，**P<0.01

圖1 中腦黑質TH陽性神經元形態變化(×40倍)

圖2 中腦黑質TH蛋白表達的變化

圖3 中腦黑質蛋TNF-α蛋白表達的變化

2.2 中腦黑質TH蛋白表達的變化 MPTP組中腦黑質TH蛋白表達較正常對照組降低明顯，二者有統計學差異(P<0.01)；NBP組與MPTP組比較中腦黑質TH蛋白含量明顯升高，二者有統計學差異(P<0.01)。

2.3 中腦黑質蛋TNF-α蛋白表達的變化 MPTP組中腦黑質TNF-α蛋白表達較正常對照組明顯升高，二者有統計學差異(P<0.05)；NBP組與MPTP組比較中腦黑質中TNF-α蛋白表達降低，二者有統計學差異(P<0.05)。

3 討 論

帕金森病( Parkinson disease，PD)是一種常見的神經系統變性疾病，臨床以靜止性震顫、肌強直、運動遲緩等為主要表現，發病機制除與多種遺傳基因突變及環境毒素有關外，氧化應激、線粒體功能障礙、神經營養因子缺乏、鈣超載、細胞凋亡等均可能參與其發病機制形成。當前抗帕金森藥物治療主要以延緩其病情進展為主，目前尚沒有任何一種藥物可有效阻止其進展，考慮多種機制共同參與，因此多靶點協同治療可能有效[5]。在本實驗中，丁基苯酞對MPTP所致帕金森小鼠模型有神經保護作用，主要通過提高中腦黑質中酪氨酸羥化酶的含量及下調TNF-α的表達起作用。

帕金森病的病理改變主要是黑質致密部多巴胺能神經元變性、缺失為主要表現，腦內多巴胺含量下降至一定程度時可出現臨床癥狀，而酪氨酸羥化酶是中腦黑質多巴胺合成的重要限速酶，酪氨酸羥化酶的變化與腦內多巴胺變化呈正相關[6]。本實驗中，MPTP組黑質多巴胺能神經元數量較正常對照組明顯下降，且TH蛋白表達降低更明顯，二者有統計學差異(P<0.01)；NBP組與MPTP組比較黑質中多巴胺能陽性神經元數量及酪氨酸羥化酶的蛋白含量明顯升高，二者有統計學差異(P<0.01)；因此，丁基苯酞可能通過增加黑質中酪氨酸羥化酶的表達而增加多巴胺含量對帕金森病起保護作用。

帕金森病中腦黑質中小膠質細胞含量相對較為集中，活化的小膠質細胞可分泌多種細胞因子，如TNF-α和IL-1等，這些細胞因子參與多巴胺能神經元的變性死亡，同時參與到帕金森病發生、發展的各個階段，而TNF-α在中樞神經系統中主要由小膠質細胞和星形膠質細胞產生，在帕金森病炎性機制的研究較多，是一種在文獻中得到證實的前炎癥因子[7，8]。本實驗中，MPTP組中腦黑質TNF-α蛋白表達較正常對照組明顯升高，二者有統計學差異(P<0.05)；NBP組與MPTP組比較中腦黑質中TNF-α蛋白表達降低，二者有統計學差異(P<0.05)；因此，丁基苯酞可能通過降低中腦黑質中TNF-α蛋白表達，減輕其炎癥反應，從而發揮其對帕金森病保護作用。

綜上所述，丁基苯酞可能通過提高中腦黑質中酪氨酸羥化酶含量及抑制小膠質細胞炎性介質的表達發揮對MPTP誘導C57BL/6小鼠帕金森模型的神經元保護作用。因此，丁基苯酞對中樞神經系統變性疾病，如帕金森病等有潛在的應用價值，但對其發病機制的研究有待于進一步探討。

[1]Jiang J，Kim JJ，Kim DY，et al. Acorusgramineus inhibits microglia mediated neuroinflammation and prevents neurotoxicity in 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced mouse model of Parkinson’s disease[J]. Ethnopharmacol，2012，144(3)：506-513.

[2]Gaven F，Marin R，Claeysen S. Primary culture of mouse dopaminergic neurons[J]. Visualized Experiments，2014(91)：e51751-e51751.

[3] Li L，Zhang B，Tao Y，et al. DL-3-n-butylphthalide protects endothelial cells against oxidative/nitrosative stress，mitochondrial damage and subsequent cell death after oxygen glucose deprivation in vitro[J]. Brain Res，2009(1290)：91-101.

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[5]Huang JZ，Chen YZ，Su M，et al. DL-3-n-Butylphthalide prevents oxidative damage and reduces mitochondrial dysfunction in an MPP+-induced cellular model of Parkinson’s[J]. Neurosci Let，2010，475(2)：89-94.

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The Effect of dl-3n-Butylphthalide on the substantia nigra of midbrain dopaminergic neurons and the protein expression of TH and TNF-α in the MPTP model of Parkinson’s disease

GENG Haiwei，MA Lili，YANG yang，et al.

(The Center Hospital of Kaifeng，Kaifeng 475000，China)

Objective To detect the Effect of dl-3n-Butylphthalide on the substantia nigra of midbrain dopaminergic neurons and the protein expression of TH and TNF-α in the MPTP model of Parkinson’s disease in C57BL/6 mice，to investigate the protection mechanism. Methods The twenty-four C57BL/6 mice were randomly divided into normal group(NOR)，MPTP group and NBP group. To prepare Parkinson’s disease model through intraperitoneal injection of MPTP. The TH positive neurons cells in the substantia nigra of midbrain were observed by immunohistochemical method，the protein expression of TH and TNF-α in the substantia nigra of midbrain were observed by Western blot. Results (1)Compared with the normal group，The the TH positive neurons cells in the substantia nigra of midbrain was markedly decreased(P<0.01)；Compared with the MPTP group，The the TH positive neurons cells in the substantia nigra of midbrain was markedly increased(P<0.01)；(2)Compared with the normal group，the protein expression of TH in the substantia nigra of midbrain was markedly decreased(P<0.01)，the protein expression of TNF-α was significantly increased(P<0.05)；Compared with the MPTP group，the protein expression of TH in the substantia nigra of midbrain was markedly increased(P<0.01)，the protein expression of TNF-α was significantly decreased(P<0.05)；Conclusion dl-3n-Butylphthalide might play a neuroprotective role on the MPTP model of Parkinson’s disease in C57BL/6 mice through increase the content of TH in the substantia nigra of midbrain and reduce the TNF-α expression of inflammatory mediators.

Dl-3n-butylphthalide； MPTP； TH； TNF-α

1003-2754(2016)03-0245-03

2015-11-12；

2015-12-28

(1.開封市中心醫院神經內科，河南 開封 475000；2.中國醫科大學第一附屬醫院神經內科，遼寧 沈陽 110001；3.中國醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，遼寧 沈陽 110001；4.中國醫科大學第一附屬醫院神經內科，遼寧 沈陽 110001)

聶瑩雪，E-mail：nieyingsnow@163.com

R742.5

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