小鼠骨髓間充質干細胞體外擴增和分化為神經元樣細胞的實驗研究

朱曉瓞， 余資江， 孫寶飛， 余 彥， 李玉美， 羅時鵬， 肖朝倫， 賀菊芳

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小鼠骨髓間充質干細胞體外擴增和分化為神經元樣細胞的實驗研究

朱曉瓞1， 余資江1， 孫寶飛1， 余 彥1， 李玉美1， 羅時鵬1， 肖朝倫2， 賀菊芳1

目的 體外分離和擴增小鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，并觀察不同方法誘導BMSCs向神經元樣細胞分化的差異，以尋找一種效果理想的BMSCs體外誘導方法。方法 取昆明小鼠雙股骨骨髓，采用全骨髓貼壁法體外純化擴增BMSCs，流式細胞術檢測其表面標志物，并對其進行成脂、成骨誘導鑒定。分別用化學誘導法和共培養法誘導BMSCs分化為神經元樣細胞，比較兩種方法所獲得的神經元樣細胞的細胞形態。結果 采用全骨髓貼壁法能有效分離小鼠BMSCs，隨著傳代次數的增加能得到逐漸純化的BMSCs，而過多的傳代次數則出現細胞生長速度緩慢、核固縮、脫離等衰老征象。流式細胞術檢測結果顯示P4代BMSCs陽性表達CD29和Sca-1，而陰性表達CD11b。具有成脂、成骨誘導分化的能力。共培養法誘導第5天可見神經細胞樣形態且細胞突起數量較多并有分支；化學誘導法培養第7天細胞出現較長突起，形成神經樣結構。結論 采用全骨髓貼壁法能有效分離純化小鼠BMSCs，通過共培養法誘導BMSCs分化為神經元樣細胞效果優于化學誘導法。

小鼠； 骨髓間充質干細胞； 擴增； 分化； 神經元樣細胞

長期以來，由于神經元再生能力差，細胞受損后很難重建樹突和軸突之間的聯系，神經系統疾病的治療是臨床上棘手的問題[1]。因此，尋找神經元細胞的有效移植物對于神經科學領域的發展具有重要意義。近年來， BMSCs作為理想的生物工程種子細胞因其具有多向分化潛能而備受關注，多項研究證實BMSCs在體外特定的誘導條件下，可分化為神經元樣細胞，并且具有取材方便、連續傳代培養或冷凍保存后依然保留生物學特征、組織修復能力強、抗原性小等特征，為腦組織損傷等神經系統疾病的治療提供一種新思路[2]。目前，誘導BMSCs向神經元樣細胞分化的方法較多，主要包括抗氧化劑等化學誘導法，生長因子和改變BMSCs所處微環境共培養法和分步誘導、慢病毒轉染的方法[3～5]。本研究通過體外分離純化擴增小鼠骨髓間充質干細胞，并采用兩種誘導法對小鼠BMSCs分化為神經元樣細胞進行實驗研究，旨在為臨床神經再生應用提供一種高效、安全的誘導方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性昆明種小鼠10只，4周齡，體重(20±2)g，購自貴州醫科大學實驗動物中心[合格證號：SCXK(黔)(2012-0004)]。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F12培養基、D-Hanks緩沖液購自HyClone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自GIBCO公司，谷氨酰胺(L-Glutamine)、胰島素、3-異丁基-1甲基黃嘌呤(IBMX)、羅格列酮、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、油紅O染液、茜素紅染液購自Cyagen公司，FITC anti-mouse/rat CD29、PE anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)、APC/Cy7 anti-mouse/human CD11b抗體購自Biolegend公司，PBS干粉、β-巰基乙醇、丁羥基茴香醚(BHA)購自Sigma公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA購自HyClone公司，37 ℃恒溫培養箱購自LEAD-Tech公司；37×B倒置相差顯微鏡購于上海光學儀器六廠。

1.2 方法

1.2.1 小鼠BMSCs分離培養[6]4周齡小鼠頸椎脫臼處死后，75%酒精全身浸泡消毒10 min，于無菌條件下取出雙側股骨及脛骨，盡量去除骨表面結締組織及表面血污，置于含有D-Hanks緩沖液的培養皿中，于酒精燈火焰周圍移入超凈工作臺。用D-Hanks緩沖液洗滌兩次后，眼科剪小心剪斷雙側股骨頭，用含10% FBS的DMEM/F12完全培養基(含100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素)從股骨一端反復沖洗，另一端收集沖出的骨髓懸液。均勻混合后，用1 ml注射器反復抽吸制成單細胞懸液。以1000 r/min離心5 min，棄上清。加入完全培養基重懸后調整細胞密度為106/ml接種于25 cm2培養瓶中。將培養瓶置于37 ℃、5% CO2培養箱中靜置培養。接種后24 h后，進行首次換液，去掉未貼壁的懸浮細胞，留下貼壁的BMSCs繼續培養。之后每隔 2～3 d換液一次，每日用相差倒置顯微鏡觀察細胞形態和生長狀況。當貼壁細胞超過85%時棄去培養基，D-Hanks緩沖液輕輕沖洗兩次。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化至鏡下觀察到大部分細胞突起回縮變圓、細胞間隙變大時，加入等體積DMEM/F12完全培養基終止消化。用吸管吹打，使細胞從瓶壁上脫落并分散，收集細胞懸液，以1000 r/min的轉速離心5 min。離心結束后，棄上清，D-Hanks重懸細胞沉淀，重復上述離心操作以盡可能洗去殘留的胰蛋白酶。DMEM/F12完全培養基重懸后，按1∶2比例傳代，倒置相差顯微鏡下觀察傳代細胞不同生長時期細胞的生長情況及形態變化。

1.2.2 小鼠不同傳代BMSCs的生長曲線測定 取體外擴增第3、5、7代BMSCs按3×104/ml接種于24孔板內，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每天取2孔細胞進行計數，計算均值，并以細胞生長時間為橫坐標，以細胞數為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.3 流式細胞術鑒定小鼠BMSCs的細胞表面標記物 取體外擴增P4代BMSCs細胞，胰酶-EDTA消化后，PBS洗滌兩次，以1000 r/min離心5 min收集細胞，將細胞濃度調整為1×106/ml，分裝于試管中(200 μl/管)，每管分別加入抗鼠CD29、Sca-1、CD11b抗體(設不加抗體的陰性對照組)，室溫避光孵育20 min，PBS洗滌，離心收集細胞，PBS重懸并上流式細胞儀檢測。

1.2.4 BMSCs成骨誘導 誘導分化：取80%～90%融合的P4代BMSCs細胞，以胰酶-EDTA消化，調整細胞密度為2×104/ml接種于預先包被0.1%明膠的六孔板中，加完全培養基培養至細胞融合達60%～70%時，吸棄完全培養基，每孔加入2 ml成骨誘導分化培養基(每100 ml誘導培養基含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素、L-Glutamine 1 ml、抗壞血酸200 μl、β-甘油磷酸鈉1 ml、地塞米松10 μl)，每隔3 d換液一次，每日以倒置相差顯微鏡觀察誘導細胞生長情況及形態變化。鑒定：誘導21 d后吸棄六孔板內的培養基，PBS沖洗兩次，每孔加入2 ml 4%中性甲醛溶液，固定30 min，PBS沖洗兩次，每孔加入1 ml 茜素紅染液染色3～5 min，PBS沖洗兩次，倒置相差顯微鏡下觀察染色結果。

1.2.5 BMSCs成脂誘導 誘導分化：取80%～90%融合的P4代BMSCs細胞，以胰酶-EDTA消化，調整細胞密度為2×104/ml接種于六孔板中，加完全培養基培養至細胞過融合時，吸棄完全培養基，換用成脂誘導分化培養基A (每100 ml誘導培養基中含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素、谷氨酰胺1 ml、胰島素200 μl、IBMX 100 μl、羅格列酮100 μl、地塞米松100 μl)2 ml/孔誘導3 d后，換用成脂誘導分化培養基B(每100 ml誘導培養基中含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素、谷氨酰胺1 ml、胰島素200 μl)2 ml/孔誘導24 h后，再換回成脂誘導分化培養基A進行誘導，A液和B液交替誘導3次后，繼續用B液維持培養4 d，每2 d換液一次，誘導期間每日以倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化及生長情況。鑒定：成脂誘導結束后，PBS沖洗兩次，每孔加入2 ml 4%中性甲醛溶液，固定30 min，PBS沖洗兩次，每孔加入1 ml油紅O染料工作液染色30 min，PBS沖洗3次，鏡下觀察染色情況。

1.2.6 BMSCs誘導分化為神經元樣細胞。

1.2.6.1 共培養誘導分化[7]取小鼠大腦組織，于低糖型DMEM培養液中將皮質剪成小塊，用2 ml注射器芯桿碾壓過40 μm濾網，收集濾液，用培養基洗滌3次，將細胞濃度調整為1×103/ml，并接種于6孔板內，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，進行首次換液，去除未貼壁細胞，之后每隔2～3 d換液一次，第6天可見典型神經細胞結構。取培養好的神經細胞，胰酶消化后收集細胞，將細胞濃度調整為1×106/ml，接種于Transwell培養皿底層。取體外擴增P4代BMSCs細胞，胰酶消化后收集細胞，將細胞濃度調整為1×105/ml，接種于Transwell培養皿的insert內，培養液為低糖型DMEM(含10% FBS，100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，對照組insert內及Transwell培養皿底層均接種BMSCs。

1.2.6.2 化學誘導分化[8]取體外擴增P4代BMSCs細胞，胰酶-EDTA消化后收集細胞，將細胞濃度調整為1×105/ml，接種于24孔板生長達到60%～70%融合時，用含3 mmol/L β-巰基乙醇的DMEM/F12(含10% FBS，100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素)預誘導24 h，PBS洗滌3次，然后用含20 g/L DMSO、 200 μmol/L BHA的無血清DMEM/F12培養誘導6 h。對照組為不加誘導劑培養。

2 結 果

2.1 小鼠BMSCs的培養 接種時BMSCs呈圓形，形態不一，細胞核不清晰，懸浮狀，混有較多血細胞(見圖1中圖A1)。接種后數小時開始有細胞貼壁生長，24 h首次換液，棄去大量漂浮的血細胞后，可觀察到大部分細胞貼壁，36 h即可見到少數細胞出現形態變化(見圖1中圖A2)。起初生長較慢，大小、形態不一，可成卵圓形、三角形、菱形，但以扁平梭形為主，胞核卵圓形，可見一些微克隆。5～7 d細胞生長較快，不斷分裂增殖出現集落樣細胞，隨著時間的增加，細胞突起變長，形態逐漸趨于一致，但仍可見較多非BMSCs的雜細胞混于其中(見圖1中圖A3、A4)。11 ～ 14 d細胞克隆減慢，出現70%～80%融合，在融合部位可見“漂浮團”樣克隆的小圓形細胞。傳代細胞于接種后1 h已見部分細胞貼壁，6 h基本全部貼壁生長，形狀為扁平的長梭形，傳至P4代細胞，細胞純化度較高，可見細胞排列較有序，呈水紋狀分布，具有一定的極性(見圖1中圖B1～B4)。

2.2 小鼠BMSCs生長曲線 生長曲線結果顯示，小鼠BMSCs的生長存在潛伏期、生長對數期和平臺期，前3 d為潛伏期，第3天開始迅速增至，進入生長對數期，第8天開始生長速度減慢進入平臺期，且隨著傳代次數的增加，細胞增殖的速率有所下降(見圖2)。說明小鼠BMSCs具有一定的增生分裂能力。此外，隨著傳代次數的不斷增加，小鼠BMSCs的增殖能力逐漸發生退化。

2.3 小鼠BMSCs的細胞表面標志物表達 流式細胞儀檢測結果顯示，生長良好的P4代BMSCs細胞的粘附分子CD29和干細胞表面標記Sca-1與陰性對照組相比表達明顯增加，為陽性表達(見圖3中圖A1、A2和圖B1、B2)；而血細胞表面標記物CD11b為陰性表達(見圖3中圖C1、C2)。

2.4 小鼠BMSCs成骨、成脂誘導分化結果 成骨誘導：鏡下可見接種于六孔板中的BMSCs迅速增殖，約5 d即達到70%融合，形態以長梭形為主，緊密排列，具有一定的極性。開始成骨誘導后，細胞開始逐漸發生形態上的變化，由梭形變為不規則形，以多角形、類圓形、方形為主，無明顯排列規則，隨著誘導時間的增加逐漸形成群落生長，并出現多層網狀結構(見圖4中圖A1、A2)。誘導分化第21天，以茜素紅染色后可見成片橘紅色，局部顏色加深形成不透光的鈣結節(見圖4中圖A3)。成脂誘導：倒置顯微鏡可見六孔板中BMSCs約6 d達到過融合，以成脂誘導分化培養基A進行誘導后，細胞由原來的長梭形逐漸變形為圓形或類圓形，排列緊密，A液和B液交替作用兩次后即可見少量細胞內出現較多圓形、透光度高的脂滴，隨著誘導時間的延長，脂滴逐漸增多變大(見圖4中圖B1、B2)。于誘導第16天進行油紅O染色，可見胞內脂滴被染為紅色(見圖4中圖B3)。

2.5 小鼠BMSCs分化為神經元樣細胞結果 共培養法：培養48 h后即可見BMSCs由長梭形逐漸收縮變小，出現圓形胞體和細長突起，并且發出分支。在培養4～5 d時，細胞形態變成星狀，呈放射狀生長，并且相互之間連接在一起，形成神經細胞樣形態(見圖5A)?；瘜W誘導法：在培養3～4 d時BMSCs由長梭形逐漸收縮變小，變成圓形或多邊形。培養6～7 d細胞形成較長突起，相互延伸，形成神經樣結構(見圖5B)。

圖1 BMSCs原代培養第0天(A1)×250；BMSCs原代培養36 h(A2)×250；BMSCs原代培養第6天(A3)×250；BMSCs原代培養第6天(A4)×400；P4代BMSCs第0天(B1)×250；P4代BMSCs第2天(B2)×250；P4代BMSCs第8天(B3)×250；P4代BMSCs第8天(B4)×400

圖2 小鼠BMSCs P3、P5、P7傳代培養生長曲線

圖3 陰性對照組FITC anti-mouse/rat CD29表達流式結果(A1)；實驗組FITC anti-mouse/rat CD29表達流式結果(A2)；陰性對照組PE anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)表達流式結果(B1)；實驗組PE anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)表達流式結果(B2)；陰性對照組APC/Cy7 anti-mouse/human CD11b表達流式結果(C1)；實驗組APC/Cy7 anti-mouse/human CD11b表達流式結果(C2)

圖4 成骨誘導分化第11天(A1)×250；成骨誘導分化第21天(A2)×400；茜素紅染色(A3)×400；成脂誘導分化第8天(B1)×400；成脂誘導分化第15天(B2)×400；油紅O染色(B3)×400

圖5 共培養法誘導小鼠BMSCs分化為神經元樣細胞的形態觀察(A)；化學誘導法誘導小鼠BMSCs分化為神經元樣細胞的形態觀察(B)×250

3 討 論

隨著神經元細胞的有效移植物-神經干細胞(neural stem cells，NSCs)的發現，神經元細胞不可再生難題的解決開啟了一扇希望之門[9，10]。然而，由于神經干細胞不易獲取，通過胚胎移植又涉及醫學倫理問題，導致神經干細胞很難在臨床中開展應用。BMSCs作為細胞替代治療中理想的種子細胞，具有多向分化潛能，近年來大量學者通過移植BMSCs分化的神經元樣細胞治療缺血性卒中大鼠，取得良好療效。Heo[11]成功將骨髓間充質干細胞誘導成神經干細胞，并將其用于治療缺血性卒中大鼠，結果顯示大鼠的神經功能得到有效恢復。Tsai等[12]學者研究也證實骨髓間充質干細胞通過特定環境分化形成神經元樣細胞，從而具有治療缺血性卒中的潛力。這些研究為BMSCs自體移植治療神經系統疾病提供強有力的理論支持，因此，有效分離BMSCs并將其分化為純度高且穩定的神經元樣細胞是目前研究的重點。

目前，分離BMSCs的方法有多種，本研究中采用全骨髓貼壁法對小鼠BMSCs進行分離的方法是上世紀70年代由美國學者Friedenstein建立的。它利用BMSCs貼壁生長的特性，在培養過程中通過更換培養液除去其他未附壁的混雜細胞，最終獲得純度較高的BMSCs，與其他方法相比更簡單易行[13]。本次實驗中BMSCs貼壁效果良好，經多次換液后有效擺脫了造血干細胞、紅細胞等的干擾，培養全程鏡下視野清晰，利于觀察細胞的形態變化和生長狀況。傳代細胞的增殖能力持續存在，具有較為穩定的持續分化能力。細胞傳至P4代時，培養環境中的雜細胞量低，能看到穩定分裂增殖的BMSCs形態逐漸趨于一致，排列較原代細胞更為緊密有序，且呈現出一定的漩渦形排列，已經具有了一定的極性，細胞純度較理想。此外，生長曲線結果顯示BMSCs體外培養時存在潛伏期、生長對數期和平臺期，且隨著傳代次數的增加出現細胞生長速度緩慢、核固縮、脫離等衰老征象，這種現象與其他學者對BMSCs傳代培養的結局相似[14,15]。同時細胞流式細胞術檢測結果顯示，P4代BMSCs的表面標志物粘附分子CD29和干細胞表面標志物Sca-1陽性表達，而血細胞表面標志物CD11b陰性表達，這一檢測結果說明此法分離提取出的能夠穩定自我增殖的細胞是具備有成體干細胞應該具備的特性的。而經成骨和成脂誘導鑒定均表現出良好的向骨細胞和脂肪細胞分化的能力，說明BMSCs具有一定多向分化的潛能。綜上，全骨髓貼壁法能夠成功分離提取出具有穩定自我增殖能力和多項分化潛能的BMSCs，且在一定范圍內隨著傳代次數的增加，能夠得到純度較高的BMSCs。

作為目前研究較為成熟的一類成體干細胞BMSCs來說，其多向分化的潛能已經被用于臨床多鄰域疾病的治療當中。其中也包括了脊髓損傷、腦卒中、外周神經損傷等涉及到神經功能修復與保護的相關疾病。關于BMSCs向神經細胞分化潛能的報導不在少數，方法也多種多樣。

化學誘導法的作用機制可能是由于化學試劑產生細胞毒性使細胞的結構產生變化，最終誘導BMSCs分化為神經元樣細胞，并且化學試劑有助于維持分化后神經細胞的生存狀態[16,17]。本研究中，先采用β-巰基乙醇啟動BMSCs向神經元樣細胞分化，然后加入抗氧化劑-BHA使BMSCs從氧化狀態中釋放出來，加速分化的過程。最終可以利用化學誘導途徑得到在形態結構上與神經元類似的誘導細胞。而共培養法可能是通過共培養細胞特定的空間結構和分泌細胞因子、神經遞質等調控促進BMSCs分化為神經元樣細胞[18,19]。單獨或聯合細胞因子誘導方法的作用機理有部分與之異曲同工。目前已報道的涉及此共培養實驗的細胞主要有嗅鞘細胞[20]和神經細胞。本研究我們在共培養法中使BMSCs置于更貼近體內神經系統的微環境，并盡可能保持細胞間相互聯系，促進BMSCs有效分化為神經元樣細胞。最終實驗結果表明，兩種誘導方法均能成功促進BMSCs分化為神經元樣細胞，且使用共培養法誘導分化的神經元樣細胞所需的時間較化學誘導法更短、神經突樣突起數量多且相互間形成一定連接，提示共培養法誘導BMSCs分化為神經元樣細胞的效果優于化學誘導法。這一實驗結論與徐麗麗等[21]的研究結果相一致。然而誘導細胞是否具有真正的神經細胞活性，還需進行后續實驗，就神經電生理活性、特異性蛋白表達情況、神經功能等方面加以驗證。

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Mouse bone marrow mesenchymal stem cells expansion and differentiate into neuron-like cells in vitro

ZHU Xiaodie,YU Zijiang,SUN Baofei,et al.

(Human Anatomy Department of Basic Medical College,Guizhou Medical University,Guiyang 550025,China)

Objective To observe the mouse bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) expansion in vitro,and to find a suitable and practical method of inducing BMSCs into neuron-like cells in vitro by comparing chemical induction and co-culture.Methods BMSCs which that were isolated from mice by the all bone marrow adherence method were cultured in the optimum culture condition,and light microscopy and flow cytometry were used to study the morphology and biological characteristics of BMSCs.The potential to differentiate into osteoblasts and adipocytes was confirmed also.BMSCs were cultured by chemical induction and co-culture methods,respectively.Cell morphology were compared.Results The all bone marrow adherence method had effective separation of BMSCs,and they lost their differentiation ability gradually during successive generations.The flow cytometry showed that the CD29 and Sca-1 of the P4 BMSCs were positive expression,and CD11b were negative expression.The BMSCs did have the potential to differentiate into osteoblasts and adipocytes in vitro.Neuron-like cells with a larger number of processes were observed on the 5th day in co-culture group while cells with typical nerve cell structure and processes were found on the 7th day in chemical induction group.Conclusions The all bone marrow adherence method has effective separation of BMSCs.The differentiation effect is better in co-culture group compared with chemical induction group.

Mouse; Bone marrow mesenchymal stem cells; Expansion; Differentiate; Neuron-like cells

1003-2754(2016)10-0868-05

2016-04-16；

2016-09-29

國家自然基金(81060108)，貴州省科技廳2012年社會發展攻關項目[黔科合SY字(2012)3153號]

(1.貴州醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室,貴州 貴陽 550025;2.貴州醫科大學基礎醫學院人體解剖學實驗中心，貴州 貴陽 550025)

余資江,E-mail:yzj0112@126.com

R741

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