尼古丁上調星形膠質細胞內源性Cryab抑制Aβ聚集的研究

任真奎， 楊 梅， 官志忠,2， 禹文峰

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尼古丁上調星形膠質細胞內源性Cryab抑制Aβ聚集的研究

任真奎1， 楊 梅1， 官志忠1,2， 禹文峰1

目的 研究尼古丁激活星形膠質細胞α7膽堿能受體(α7 nicotinic receptors,7 nAChRs)上調內源性B-晶狀體蛋白(αB-crystallin,Cryab)并抑制β淀粉樣蛋白(Amyloid,Aβ)集聚的現象及其機制。方法 分離24 h內新生乳鼠大腦皮質培養原代星形膠質細胞并鑒定；體外制備Aβ1-42寡聚體；將細胞分為對照組、尼古丁組、α7 nAChRs阻斷劑(methyllycaconitine，MLA)組、Aβ1-42組、尼古丁+Aβ1-42組、PI3K信號通路阻斷劑LY294002+尼古丁+Aβ1-42組。用蛋白印跡法(Western blotting)檢測細胞內Cryab、P-Akt(ser473)、Aβ寡聚體的表達水平。結果 尼古丁可以顯著上調星形膠質細胞內源性Cryab蛋白(P<0.05)；尼古丁能夠顯著上調磷酸化Akt蛋白水平(P<0.05)；在細胞裂解液及培養基中，尼古丁顯著增強星形膠質細胞對Aβ聚集的抑制作用(P<0.01)。結論 尼古丁通過激活星形膠質細胞α7 nAChRs上調內源性Cryab從而抑制Aβ集聚；PI3K/Akt信號通路可能參與尼古丁激活星形膠質細胞α7 nAChRs上調內源性Cryab蛋白抑制Aβ集聚的過程。為進一步研究尼古丁抑制Aβ集聚的可能機制提供了實驗基礎。

星形膠質細胞; 阿爾茨海默氏??； α7膽堿能受體； 尼古丁； B-晶狀體蛋白； β淀粉樣蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以進行性記憶和認知功能障礙為特征的中樞神經系統退行性疾病。由于缺乏早期預防意識，AD對老年人群的危害將日趨嚴重。Aβ聚集是AD核心發病機制，Aβ的聚集不僅可以導致神經細胞凋亡，也可以破壞突觸結構和功能，從而導致記憶和認知功能障礙[1～3]。此外，Aβ的聚集能夠激活星形膠質細胞釋放細胞因子、炎性因子從而導致腦內的神經炎癥[4]。因此，阻止Aβ的聚集及其發生和發展，對防治AD有重要意義。α7 nAChRs廣泛分布于大腦皮質和海馬的神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞[5]。在AD的發病機制中，α7 nAChRs 通過與Aβ的相互作用而扮演了重要的病理角色[6]。近年來的研究表明，α7 nAChRs可能是拮抗Aβ神經毒性的一個重要靶點[7]。B-晶狀體蛋白(αB-crystallin,Cryab)在大腦內具有許多重要的生理功能：抗炎、抗凋亡和神經保護等[8,9]。

我們前期研究結果證實，用尼古丁激活星形膠質細胞a7 nAChRs能夠顯著增強星形膠質細胞對 Aβ聚集的抑制，但具體調控機制不清楚。基于Cryab蛋白的特性，我們推測星形膠質細胞內源Cryab蛋白可能是尼古丁介導Aβ聚集的中間環節。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 胎牛血清及DMEM培養基購于Gibco公司(美國)；Aβ1-42肽、六氟異丙醇、DMSO、尼古丁、methyllycaconitine (MLA)購于Sigma公司(美國)；青-鏈鏈霉素及胰蛋白酶購于Hyclone公司(美國)；6E10抗體購自BioLegend公司(美國)；鼠抗Cryab(αB-crystallin)單克隆抗體購自Abcam公司(美國)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔、抗鼠二抗；鼠抗-肌動蛋白(-actin)單克隆抗體；PI3K/Akt信號通路的抑制劑LY294002及相關位點的抗體購于CST公司(美國)； 抗體稀釋液、封閉液、聚丙烯酰胺凝膠購自碧云天公司；高效顯影膠片、顯影液、定影液購自柯達公司；ECL-Plus試劑及聚乙烯二氟(PVDF)膜購于Millipore公司(美國)；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司(美國)；倒置顯微鏡(Olympus)；-80 ℃冰箱(美國Thermo公司)；高速離心機(德國eppendorf公司)；ELX 800酶標儀(美國 Bio-tec公司)； CO2培養箱(日本SANYO公司) 。

1.2 Aβ1-42寡聚體的制備 參照Klein等[10,11]體外制備Aβ1-42寡聚體的方法，將預冷的HFIP加入Aβ1-42粉末中，使其充分溶解后常溫孵育60 min。隨后為使HFIP揮發完全，將其放在常溫下通風櫥過夜。將干燥的肽膜于-80 ℃保存，使用時取出用DMSO溶解，再用含SDS的PBS稀釋后，4 ℃存放2 w，冰凍高速離心機(10 min、14000 g)上清液即為寡聚體。

1.3 星形膠質細胞培養傳代及鑒定 參照Mc Carthy[12]等的方法并改進，取24～48 h內新生SD(Sprague-Dawley)乳鼠的大腦皮質(由貴州醫科大學動物實驗中心提供)，動物合格證號為SCXK(黔)2012-0001，將其大腦皮質剪成泥狀，消化漂洗后，加入含1%雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)、10%FBS的高糖DMEM培養基，吹打成細胞懸液，接種至培養瓶，5% CO2、37 ℃恒溫培養。24 h后換液，之后每3 d換一次液直至細胞鋪滿瓶底。培養8～9 d，純化并傳3～4代。膠質纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)細胞免疫熒光的方法對星形膠質細胞進行染色鑒定細胞純度。

1.4 分組及細胞處理 將培養好的星形膠質細胞純化、傳代并鑒定后，以5×105的密度種入六孔板內。將細胞分為對照組、尼古丁組、尼古丁+MLA組、Aβ1-42組、尼古丁+Aβ1-42組、尼古丁+LY294002組、尼古丁+LY294002+Aβ1-42組。尼古丁+MLA組，預先加入MLA處理2 h，隨后加入尼古丁；尼古丁+LY294002+Aβ1-42組，預先加入LY294002處理2 h，隨后加入尼古丁孵育18 h，換液后，用DMEM培養基吹洗3次，加入終濃度為1 μmol/L的Aβ1-42寡聚體繼續在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。

1.5 蛋白印跡法 從六孔版中收集細胞，加入細胞裂解液裂解(100 μl/孔)，在4 ℃、12000轉離心20 min后取上清，將提取的蛋白質用BCA蛋白定量試劑盒定量后分裝保存(-80 ℃)，用Western blotting方法檢測Cryab、P-Akt(ser473)及Aβ蛋白表達水平。12%的梯度膠電泳，蛋白樣品分離后轉移至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h，TBS-T漂洗(3次×10 min)，加入相應一抗，4 ℃孵育過夜，TBS-T漂洗(3次×10 min)后加入辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1 h，TBS-T漂洗(3次×10 min)后曝光。用ImageJ軟件分析曝光結果，以β-肌動蛋白(β-actin)為內對照。

1.6 統計學分析 所有結果應用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間采用one-way ANOVA分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 尼古丁顯著增強星形膠質細胞對Aβ聚集的抑制作用 在原代星形膠質細胞培養模型上，用α7 nAChRs激動劑尼古丁處理細胞，能夠顯著增加星形膠質細胞對細胞內和細胞培養液內Aβ聚集的抑制作用(見圖1)。

2.2 尼古丁通過激活α7膽堿能受體而上調Cryab蛋白水平 尼古丁刺激星形膠質細胞后α7膽堿能受體(α7 nAChRs)的表達上調，為了探索尼古丁是否通過激活α7膽堿能受體而上調Cryab蛋白。本研究選取α7膽堿能受體的特異性阻斷劑MLA，以100 nmol/L MLA預先處理星形膠質細胞2 h后，再加入尼古丁5 μmol/L共同孵育18 h。MLA刺激星形膠質細胞后尼古丁上調內源性Cryab的效應受到抑制(見圖2)。

2.3 PI3K/Akt信號通路參與尼古丁激活α7 nAChRs上調星形膠質細胞內源性Cryab蛋白 以10 μmol/L LY294002或100 nmol/L MLA預先處理星形膠質細胞2 h后，再加入尼古丁5 μmol共同孵育20 min。尼古丁上調P-Akt(ser473)蛋白的效應受到抑制(見圖3)。為進一步探索PI3K/Akt信號通路的抑制劑LY294002能否抑制星形膠質細胞內源性Cryab蛋白的上調。用LY294002預先處理星形膠質細胞2 h，再加入尼古丁共同孵育18 h。星形膠質細胞內源性Cryab的表達受到抑制(見圖4)。

2.4 尼古丁顯著增強星形膠質細胞對Aβ聚集的抑制作用與PI3K/Akt信號通路的激活相關 用LY294002預先處理星形膠質細胞2 h，再加入尼古丁孵育18 h,最后加入Aβ共同孵育24 h。分別收集細胞裂解液及培養基，對照組Aβ蛋白不表達。與Aβ1-42組相比，(尼古丁+Aβ1-42)組的Aβ蛋白顯著下調(P<0.01)；與(尼古丁+Aβ1-42)組相比，(尼古丁+Aβ1-42+LY294002)組的Aβ蛋白顯著上調(P<0.01)(見圖5)。說明尼古丁激活α7 nAChRs之后，通過PI3K/Akt信號通路上調Cryab，從而抑制Aβ的集聚。

與Aβ組相比*P<0.01

與對照組相比*P<0.05；與尼古丁組相比#P<0.05

與對照組相比*P<0.05；與尼古丁組相比#P<0.01

與對照組相比*P<0.05；與尼古丁組相比#P<0.01

與Aβ1-42組相比*P<0.01；與(尼古丁+Aβ1-42)組相比#P<0.01

圖5 尼古丁通過激活PI3K/Akt信號通路而抑制β-淀粉樣蛋白的集聚

3 討 論

Aβ的聚集是一個多因素參與的復雜過程，星形膠質細胞在Aβ的聚集和沉積過程中扮演重要病理角色。在中樞神經系統中星形膠質細胞數量最多而且參與重要的生理功能：防止神經元損傷、提供代謝、營養支持和調節突觸活動[13]。星形膠質細胞在Aβ聚集和沉積過程中具有雙重病理角色。一方面，激活的星形膠質細胞能夠通過大量分泌細胞因子、炎性因子和一氧化氮等神經毒性物質而導致AD腦內的神經炎癥發生[14]；另一方面，活化的星形膠質細胞也能夠表達與Aβ降解有關的酶，對Aβ進行有效的吞噬和降解[15,16]。基于以上事實，促進星形膠質細胞對Aβ聚集和沉積的抑制功能可能成為治療AD的一個重要方向。α7膽堿能受體是配體門控離子通道家族中的成員。它由5個跨膜亞基組成,有一個大的胞外氨基端，4個跨膜結構域和一個胞漿域[17,18]。α7 nAChRs廣泛分布于大腦皮質和海馬的神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞[5]。在 AD 的發病機制中，α7 nAChRs通過與Aβ的相互作用而扮演了重要的病理角色[6]。近年來的研究表明，α7 nAChRs可能是拮抗Aβ神經毒性的一個重要靶點。在神經元細胞中，α7 nAChRs能夠通過激活多條細胞內信號通路而拮抗Aβ導致的神經細胞凋亡[19]。在我們的前期結果中，用尼古丁處理星形膠質細胞后發現α7 nAChRs的表達上調，并且能顯著抑制Aβ聚集。本研究發現尼古丁通過激活α7膽堿能受體而上調Cryab蛋白水平，由此可推測尼古丁是通過激活星形膠質細胞的α7 nAChRs后上調內源性Cryab從而抑制Aβ的聚集。

有研究表明，PI3K/AKT信號通路參與了α7 nAChRs的神經保護功能，在阿爾茨海默病研究中發現，Akt在海馬神經元中表達減少，繼而導致神經元凋亡[19]。我們的實驗結果發現，用尼古丁處理星形膠質細胞能顯著上調Akt的磷酸化，該上調作用被PI3K/Akt信號通路的抑制劑LY294002或α7 nAChRs的阻斷劑(MLA)所抑制。這說明尼古丁通過激活α7 nAChRs后，使PI3K/Akt信號通路激活引起細胞內相應的效應。進一步的研究發現LY294002能抑制尼古丁上調內源性Cryab蛋白表達。這些結果表明，尼古丁通過α7 nAChRs上調星形膠質細胞內源性Cryab蛋白與PI3K/Akt信號通路的激活相關。上調Akt能對抗Aβ誘導的神經元凋亡和tau蛋白磷酸化[20]。尼古丁處理星形膠質細胞后，能明顯抑制Aβ的聚集，并且該作用能被LY294002阻斷，說明尼古丁通過α7 nAChRs抑制Aβ的聚集與PI3K/Akt信號通路的激活相關，而且該過程可能有內源性Cryab蛋白的參與。因為在AD大腦中，星形膠質細胞表達的Cryab蛋白明顯上調，并且這些上調的Cryab蛋白緊密地分布在Aβ蛋白沉積周圍[21,22]。Cryab蛋白能夠通過與Aβ蛋白直接結合等方式有效地阻止Aβ蛋白的聚集及其細胞毒性作用[23,24]。

綜上所述，尼古丁通過激活星形膠質細胞α7 nAChRs上調內源性Cryab從而抑制Aβ集聚；PI3K/Akt信號通路很可能是尼古丁通過星形膠質細胞α7 nAChRs上調內源性Cryab蛋白從而抑制Aβ集聚過程的重要參與因素。為進一步研究Cryab蛋白可能是治療AD的一個潛在靶點提供了一定的基礎。

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Nicotine inhibit Aβ aggregation via upregulation endogenous Cryab in astrocytes

REN Zhenkui,YANG Mei,GUAN Zhizhong,et al.

(Key Lab of Medical Molecular Biology,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China)

Objective To investigate the possible mechanism of nicotine on amyloid β(Aβ) aggregation via activation α7 nAChRs as well as upregulation endogenous Cryab.Methods Primary astrocytes culture were separated from neonatal SD rat cerebral cortex;Aβ1-42oligomers were prepared in vitro.The astrocytes were divided into control group,nicotine group,MLA group,Aβ1-42group,nicotine+Aβ1-42group,nicotine+LY294002+Aβ1-42group.The protein levels of Cryab,phosphorylated-Akt (ser473) and Aβ oligomers in the cells was detected by Western blot.Results Nicotine significantly increased endogenous Cryab in astrocytes (P<0.05).Nicotine significantly increased phosphorylated-Akt in astrocytes.In cell lysis solution and medium,Nicotine significantly enhanced astrocyte to inhibit Aβ aggregation (P<0.01).Conclusions Nicotine can significantly inhibit Aβ aggregation via activated α7 nAChRs as well as upregulation endogenous Cryab in astrocytes.PI3K/Akt signaling pathway is likely to be involved in this process.This study provided experimental data on the possible mechanism of nicotine inhibit Aβ aggregation.

Astrocytes; Alzheimer’s disease; α7nAChRs; Nicotine; αB-crystallin; Amyloid

1003-2754(2016)10-0897-04

2016-06-13；

2016-09-28

國家自然科學基金(批準號：81360199)，教育部科學技術研究項目(批準號：213032A)，貴州省國際 科技合作計劃項目[批準號：黔科合外G字(2013)7026 號],貴州省創新計劃項目[黔教合協同創新中心(2014)06]

(1.貴州醫科大學醫學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學病理學教研室，貴州 貴陽 550004)

禹文峰，E-mail:wenfengyu2013@126.com

R749.1

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