結直腸癌、癌前病變中KLF6 mRNA與蛋白表達的研究

吳 鑫，張義勝，趙海遠，劉銀華，彭俊璐

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 1.胃腸外科三；2.病理科，安徽 蕪湖 241001)

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·臨床醫學·

結直腸癌、癌前病變中KLF6 mRNA與蛋白表達的研究

吳 鑫1，張義勝1，趙海遠1，劉銀華2，彭俊璐1

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 1.胃腸外科三；2.病理科，安徽 蕪湖 241001)

目的：檢測抑癌基因KLF6(kruppel-like factor 6)在結直腸癌、癌前病變(均結直腸高級別上皮內瘤變)及癌旁正常黏膜組織細胞中的表達水平，探討KLF6表達水平在各類型組織中的相互關系及在結直腸癌病程中的作用。方法：采集弋磯山醫院2014年1月～2015年1月間結直腸手術切除后標本共88例，其中癌組織46例、癌前病變(結直腸高級別上皮內瘤變)組織21例及正常腸管黏膜組織21例。以SP法進行免疫組化和Q-PCR方法檢測結直腸癌(結直腸癌組)、結直腸癌癌前病變(癌前病變實驗組)及癌旁組織(對照組)中KLF6表達水平；并探討KLF6的表達與臨床病理參數之間的關系。結果：①KLF6在結直腸癌組織、結直腸癌癌前病變組織中的表達水平低于癌旁正常組織(P<0.05)，差異有統計學意義；且KLF6表達與浸潤情況、分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有一定相關性(P<0.05)；KLF6表達與患者的年齡、性別、腫瘤組織學類型、癌灶大小無明顯相關性(P>0.05)。②Q-PCR實驗結果正常組織中KLF6基因相對表達量高于結直腸癌癌前組織和結直腸癌組織，差異有統計學意義(P<0.05)。結論：KLF6基因在結直腸癌及癌前病變中起到了一定的作用，并與腫瘤浸潤情況、分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有一定相關性。

結直腸癌；癌前病變；KLF6基因

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.013

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，具有發病率高、致死率高及預后不良等特點，嚴重威脅人類的生命和健康[1]。 因此，不斷探索與結直腸癌的發生、發展及預后相關的機制，并從中發現與之相對應的分子標志物對結直腸癌早期診斷、不同的治療方案制定及判斷其預后具有重要臨床意義[2]。

隨著腫瘤因子機制的深入研究，相關因子的定位及識別已成為結直腸癌研究的熱點。 Gloor描述一只蒼蠅因為KLFS突變造成了嚴重的身體畸形，并將之命名為Krüppel，意思是“殘廢”[3]。KLF6(kruppel-like factor 6)是其中一員，同時也是新近發現的抑癌基因，KLF6的缺失、突變極其容易導致許多腫瘤的發生、發展[4]。 國內外對KLF6基因的研究多集中在前列腺癌[5]、肝癌[6]及胃癌[7]中，鮮有結直腸癌研究的相關報道。研究KLF6基因與結直腸癌的發生、發展及預后的關系具有深刻的意義[8]。本研究應用Q-PCR及免疫組化方法檢測結直腸癌及癌前病變中KLF6基因與蛋白的表達情況，探討KLF6基因對于結直腸癌發生、發展及腫瘤浸潤的影響及其相互關系。

1 資料與方法

1.1 標本采集 收集弋磯山醫院普外科2014年1月～2015年1月間結直腸手術后切除的離體標本88例，其中結直腸癌組46例，結直腸癌前病變組(均結直腸高級別上皮內瘤變)21例及正常癌旁腸管黏膜組織(距癌灶邊緣5 cm以上)21例為對照組。結直腸癌組患者平均年齡(55±4.96)歲，其中>55歲20例，≤55歲26例。男性24例，女性22例。離體后標本分為兩部分，其中約0.5 g離體后1 h內放入-80℃冰箱中保存，余下手術切除標本大部送至病理科，4%甲醛固定，石蠟常規包埋備用，HE染色以確定結直腸癌組織學類型、TNM分期等。其中中高分化腺癌14例、低分化腺癌32例；30例標本有多處淋巴結轉移，16例無淋巴結轉移；TNM分期Ⅰ期3例、Ⅱ期共18例，Ⅲ期16例、Ⅳ期共9例；所有取材的標本均來自手術切除治療后，且患者術前均未接受放療和化療。

1.2 材料與方法

1.2.1 材料 Triozol細胞裂解液購自Life Technologies公司，逆轉錄試劑盒購自 Invitrogen公司，引物由上海生工生物技術公司合成，鼠抗人KLF6多克隆抗體來自武漢博士德生物技術有限公司，免疫組化試劑盒來自北京中衫生物技術公司；KLF6上游引物序列5′-CCTGTAAGAAGCGGCATAGC-3′，下游引物序列5′-TCAACCCAACCATTAGCATTC-3′，擴增片段137 bp，內參β-actin上游引物序列5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游序列5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，擴增片段207 bp。

1.2.2 免疫組織化學SP 法 切片常規脫蠟，梯度酒精脫水后，3%過氧化氫滅活內源性生物素酶，滴加一抗，4℃冰箱內過夜孵育，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精襯染，脫水，透明、中性樹膠封固。以PBS代替一抗作陰性對照。用已知陽性片作陽性對照。KLF6以細胞核、質、膜出現棕黃色細顆粒為陽性表達。根據腫瘤細胞染色強度并結合陽性細胞數來綜合判讀陽性，通過用免疫組化半定量積分法來計數陽性細胞，其中每張切片隨機選擇3個倍數×400的高倍視野計數，每個視野以50個細胞為計數標準。先按染色強度打分：不著色為0分，顏色淡黃色為1分，棕色為2分，深棕色為3分；陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；兩種評分相乘得分：0分為陰性(-)，1分為弱陽性(弱+)，2分以上為陽性(+)，同時以弱陽性和陽性表達同為陽性表達。

1.2.3 Q-PCR 取21例結直腸癌組織以及21例癌前病變組為實驗組，21例癌旁正常組織為對照組，分別檢測KLF6基因及內參β-actin的表達量。采用Triozol試劑盒分別提取結直腸癌及癌旁正常組織中總RNA檢測其完整性、純度及濃度，后逆轉錄，Q-PCR。KLF6及β-actin的循環條件為95℃預變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，40個循環。基因的相對表達量用比較CT值計算，計算公式：F=2-ΔΔCT，ΔΔCT值=(胃癌組目的基因CT值 - 胃癌組內參基因CT值) - (癌旁組目的基因CT值 - 癌旁組內參基因CT值)。

1.3 統計方法 實驗數據采用SPSS 18.0統計分析軟件處理。KLF6表達與臨床病理參數之間的關系采用卡方檢驗。Q-PCR數據采用ΔΔCt方法計算基因的相對表達量，數據經GraphPad軟件處理后以柱狀圖表示。

2 結果

2.1 免疫組化實驗結果

2.1.1 KLF6蛋白在結直腸癌細胞、癌前病變細胞和癌旁正常細胞中的表達 KLF6蛋白表達定位于細胞核、細胞質、細胞膜中，結直腸癌組織中 KLF6表達呈陰性，如圖1所示，結直腸癌癌旁正常腸管組織中KLF6表達呈強陽性，如圖2所示；結直腸癌癌前病變組織中KLF6表達呈弱陽性，如圖3所示。結果顯示：KLF6蛋白在癌旁組織組、癌前病變組和結直腸癌組3組總體間表達的差異具有統計學意義(χ2=11.799,P=0.003)。見表1。

定位于細胞核、質、膜，×400。

圖1 KLF6在結直腸癌細胞中表達呈陰性

定位于細胞核、質、膜，×400。

圖2 KLF6在癌旁細胞中表達呈強陽性

定位于細胞核、質、膜，×400。

圖3 KLF6在癌前病變細胞中表達呈弱陽性

表1 KLF6蛋白在3組中的表達水平

組別KLF6表達+-χ2P結直腸癌組(n=46)a1927癌前病變組(n=21)b101111.7990.003癌旁對照組(n=21)c183

注：結直腸癌組與癌旁對照組比較：χ2=11.5，aP<0.05；癌前病變組與癌旁對照組比較：χ2= 6.857，bP< 0.05；結直腸癌組與癌前病變組比較：χ2=0.234，cP=0.628。

2.1.2 KLF6蛋白表達水平與結直腸癌臨床病理參數之間的關系 KLF6表達與浸潤情況、分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有一定相關性(P<0.05)；KLF6表達與患者的年齡、性別、腫瘤組織學類型、癌灶大小無明顯相關性(P>0.05)。見表2。

表2 KLF6表達水平與結直腸癌臨床病理參數之間的關系

臨床病理參數nKLF6表達+-χ2P年齡 ≤552611150.025>0.05 >5520812性別 男2410140.003>0.05 女22913浸潤情況 肌層內205153.880<0.05 肌層外261412分化程度 高中分化142126.060<0.05 低分化321715淋巴結轉移 有3017138.396<0.05 無16214TNM分期 A、B211293.998<0.05 C、D25718癌灶大小 癌灶≥3cm17890.368>0.05 癌灶<3cm291118腫瘤組織學類型 管狀、乳頭狀腺癌2810180.922>0.05 黏液癌、未分化癌1899

2.2 Q-PCR檢測結直腸癌、癌前病變及癌旁組織中KLF6的mRNA表達水平 經過核酸蛋白定量儀測定的RNA樣品OD值1.8～2.0，純度符合實驗要求。RNA經逆轉錄為cDNA，然后進行Q-PCR實驗，溶解曲線顯示KLF6及內參β-actin均為單一波峰且無明顯雜峰(圖4)，說明該擴增產物無非特異性擴增，擴增曲線顯示擴增效率較好(圖5)。3組實驗數據兩兩比較用F檢驗，每組比較所得P值均小于0.05，相對表達量用柱狀圖表達如圖6所示。

3 討論

鋅指(ZNF)結構是在大量DNA結合基序中最具代表的真核轉錄因子，并且Cys2His2 ZNF基因序列是最規范類型[9]。Kruppel-like轉錄因子家族為鋅指(ZNF)結構的一種，同樣對腫瘤發生可能也很重要。Kruppel樣因子6(Kruppel like factor 6，KLF6)，是一種參與生長發育、細胞增殖、分化及血管生成等調控過程的核轉錄調控因子[10]。Reeves等[11]使用直接測序法和微衛星分析法確立了KLF6和TP53等位基因的失衡機制，并在結直腸癌衍生中用此方法明確KLF6、TP53、K-RAS和APC基因突變導致的發病率與微衛星不穩定性密切相關。

圖4 Q-PCR檢測結直腸癌、癌前病變及癌旁組織中KLF6表達的溶解曲線

圖5 Q-PCR檢測結直腸癌、癌前病變及癌旁組織中KLF6表達的擴增曲線

圖6 Q-PCR檢測結直腸癌、癌前病變及癌旁組織中KLF6 mRNA的表達(2-ΔΔCT法)

本實驗我們分別采用免疫組化和Q-PCR的方法檢測了結直腸癌和結直腸癌癌前病變中KLF6的表達水平，結果提示了KLF6在結直腸癌組織中的表達水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)，KLF6在結直腸癌癌前病變組織中的表達水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)，可能因為KLF6為抑癌基因，

所以在直腸癌及癌前與正常組織存在明顯表達差異。或許我們將來可以將KLF6因子當作一種腫瘤標記物。KLF6在結直腸癌組織的表達與癌前病變組織中表達尚無明確定論，本實驗的免疫組化和Q-PCR結果存在差異，可能與免疫組化結果為定性的，而Q-PCR數據讀取是定量的有關，因此存在差異，還需要我們進一步的研究。

本研究同時還顯示結直腸癌中KLF6的表達與腫瘤的浸潤情況、分化程度、淋巴結轉移、TNM分期密切相關(P<0.05)；KLF6蛋白表達減弱時，腫瘤浸潤肌層，TNM分期越晚，淋巴結遠處轉移越多，分化程度也越差；以上均提示KLF6可能作為一種新型的KLF6抑癌基因，可能成為結腸癌治療的新靶點，為結直腸癌治療提供分子生物學依據。

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KLF6 mRNA and protein expression levels in colorectal cancer and precancerous lesions

WU Xin,ZHANG Yisheng,ZHAO Haiyuan,LIU Yinhua,PENG Junlu

Department of Gastrointestinal Surgery，The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective： To investigate the association and role of Kruppel-like factor 6(KLF6)gene and protein expression with precancerous lesions and in the development of colorectal cancers via detecting the levels of the gene and protein in the malignant and adjancent tissues.Methods:The samples were collected in 88 patients with colorectal cancer treated in our hospital from 2014 through 2015.Of the 88 samples,46 were from cancer tissues,21 from precancerous lesions and another 21 from adjacent normal colorectal mucosa.KLF6 mRNA and protein expression levels were detected with immunohistochemistry and quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) in the tissues of colorectal cancer(colorectal cancer group),precancerous lesions(precancerous lesions group) and in tumor-adjacent tissues(control group),and the association of KLF6 expression with clinical pathological parameters were also determined.Results:① KLF6 expression was significantly lower in either of the tissues from colorectal cancer or precancerous lesions than that of tumor-adjacent normal tissues(P<0.05),and was somewhat correlated with the extent of tumor infiltration,differentiation,lymph node metastasis and TNM staging(P<0.05),yet was not significantly with the patient′s age,gender,histological type and tumor size(P>0.05);②Q-PCR indicated that KLF6 gene expression was relatively higher than the level in either tissues from precancerous lesions or from colorectal cancers.The difference was significant(P<0.05).Conclusion:KLF6 gene can be important role in colorectal cancer and precancerous lesions,and is associated to a certain extent with tumor infiltration,differentiation,lymph node metastasis and TNM staging.

colorectal cancer;precancerous lesions;KLF6

1002-0217(2016)06-0555-04

皖南醫學院中青年科研基金項目(WK2013F21)

2016-03-16

吳 鑫( 1976-)，男，主治醫師，碩士，(電話)13905535321，(電子信箱)wuxin28577@sohu.com; 張義勝，男，主任醫師，碩士生導師，(電子信箱)huhzhao@163.com，通信作者.

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