8606例中孕期婦女血清學三聯篩查及產前診斷結果分析

朱 翔，許 芳，王玉萍，付 夏，李書勤，李 莉，浦 春，武其文

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 1.檢驗科；2.婦產科；3.產前診斷中心，安徽 蕪湖 241001)

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·臨床醫學·

8606例中孕期婦女血清學三聯篩查及產前診斷結果分析

朱 翔1，許 芳1，王玉萍1，付 夏1，李書勤2，李 莉3，浦 春1，武其文1

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 1.檢驗科；2.婦產科；3.產前診斷中心，安徽 蕪湖 241001)

目的：探討血清學三聯指標聯合產前篩查及產前診斷在臨床上的應用價值。方法：應用時間分辨免疫熒光法對8606例孕中期婦女進行血清甲胎蛋白(AFP)、游離β-人絨毛膜促性腺激素(free-βHCG)和非耦聯雌三醇(uE3)三聯指標檢測。將檢測結果結合孕婦的年齡、孕周、體質量等因素輸入中國南方人群數據庫為基礎的產前篩查風險評估軟件計算出風險值。對染色體非整倍體病高風險者建議進行羊水穿刺細胞培養或熒光原位雜交試驗進行產前診斷。低風險及拒絕進行羊水穿刺的高風險孕婦進行電話隨訪。結果：①8606例孕婦21-三體綜合征(DS)、18-三體綜合征(ES)和開放性神經管缺陷(ONTD)的篩查高風險陽性率分別為6.47%(557/8606)、0.17%(15/8606)和0.56%(48/8606)。②羊水細胞培養產前診斷共檢出21-三體綜合征8例，18-三體綜合征2例。此外羊水細胞染色體核型分析還檢出特納綜合征3例，克氏征1例以及染色體結構變異2例。③隨訪結果表明血清學三聯法對21-三體綜合征的檢出率為84.62%，假陽性率為6.34%，假陰性率為0.02%。結論：孕中期婦女血清學三聯指標聯合產前篩查和羊水穿刺進行產前診斷對預防常見染色體綜合征具有重要作用。

產前篩查；產前診斷；21-三體綜合征；熒光原位雜交

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.017

出生缺陷是指胚胎或胎兒發育過程中由于遺傳或環境等多種因素所導致的形態結構、生理功能以及代謝等方面的異常。我國是出生缺陷高發國家，據統計我國每年大約新增80萬～120萬例出生缺陷患兒，不僅給患者家庭和社會帶來巨大壓力，也嚴重影響我國的出生人口素質。因此，對孕期婦女進行產前篩查及診斷，以此來預防出生缺陷兒的出生便顯得尤為重要。本研究對2012年6月～2014年10月于弋磯山醫院產前診斷門診就診的8606例中孕期孕婦進行血清學三聯指標(AFP、free-βHCG和uE3)產前篩查，并對染色體非整倍體高風險的孕婦進行產前診斷，現對結果作一回顧性分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2012年6月～2014年10月于弋磯山醫院產前診斷門診就診且孕周在14～21+6周的孕婦8606例，年齡17～42歲，均來自安徽地區。月經周期規律者按末次月經時間計算孕周，月經周期不規律者按B超檢查結果來確定孕周。

1.2 儀器和試劑 泰萊-Ⅱ型時間分辨熒光免疫分析儀為廣州豐華生物公司產品，血清AFP、free-βHCG和uE3時間分辨檢測試劑盒及其質控品來自廣州豐華生物公司。產前篩查風險評估軟件為廣州豐華生物公司的PRsoft 2.0。羊水細胞培養基為美國歐文產品。Anuvysion熒光原位雜交檢測試劑盒為美國生命科技有限公司產品。BX 51型熒光顯微鏡為日本Olympus產品，染色體核型分析系統為以色列ASI公司產品。

1.3 方法

1.3.1 三聯指標血清學產前篩查 中孕期婦女簽署產前篩查知情同意書后，空腹采集靜脈血2～3 mL，4000 r/min離心10 min，吸取血清置于-20℃保存。采用時間分辨免疫熒光法檢測孕婦血清中AFP、free-βHCG和uE3的濃度。檢測步驟嚴格按照試劑盒操作說明書進行。檢測結果結合孕婦年齡、體質量、孕周等因素，通過PRsoft 2.0產前篩查風險評估軟件計算疾病發病風險。設定唐氏綜合征高風險的cut-off值為1/270，>1/270 為高風險；18-三體綜合征高風險的cut-off值為1/350，>1/350為高風險；根據AFP檢測值中位數倍數(MOM值)判斷神經管畸形風險，>2.5倍MOM值設為高風險。對21-三體和18-三體篩查結果為高風險的孕婦，在告知孕婦相應風險后，根據自愿原則行胎兒羊水細胞染色體核型分析或熒光原位雜交實驗，以此來確診。對低風險孕婦及未接受羊水穿刺的孕婦進行電話隨訪。

1.3.2 羊水穿刺產前診斷 在B超引導下行羊膜腔穿刺，棄去最初抽出的 2 mL羊水，然后抽取羊水20 mL進行細胞培養。將羊水注入2只15 mL無菌離心管中，每只10 mL，1000 r/min離心10 min，棄去上清，留0.5 mL，混勻后接種于2個細胞培養瓶中，每瓶加入4 mL 羊水培養基，輕輕混勻，靜置于5%CO2培養箱中，溫度37℃，培養6～7 d后更換培養液，繼續培養1～2 d，此時鏡下可見較多大而亮圓的分裂期細胞，可終止培養。每瓶加入秋水仙素4滴，37℃繼續培養1 h。用吸管將培養瓶中的細胞轉移到離心管中，1000 r/min離心10 min，棄去上清，保留細胞沉淀，經低滲、預固定、固定、再固定、次固定、滴片、烤片及顯帶等一系列處理后，在顯微鏡下觀察結果。正常核型計數20個，分析5個，存取照片兩張，異常核型計數40個。

1.3.3 間期羊水細胞熒光原位雜交實驗 對于部分21-三體或18-三體高風險要求進行快速產前診斷的孕婦，利用Anuvysion熒光原位雜交試劑盒進行13、18、21號染色體的非整倍體檢測。具體方法：①羊水標本的處理：標本離心，膠原酶消化28 min，老化(50℃ 4 h或室溫過夜),RNA酶消化15 min，2×SSC漂洗，胃蛋白酶消化5 min，2×SSC漂洗，梯度脫水(70%、85%、100%乙醇，-20℃),室溫干燥。②變性及雜交：70%甲酰胺73℃變性5 min，-20℃乙醇梯度脫水，加入已變性的探針雜交，封片，42℃濕盒內避光孵育10～12 h。雜交后洗片,DAPI染色15 min，鏡檢。③FISH信號觀察：每個雜交區隨機計數至少50個雜交細胞。

1.4 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件對本研究的數據進行統計學分析，計數資料的比較采用卡方檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清學產前篩查結果 8606例孕婦血清學篩查結果見表1。

表1 8606例孕中期婦女血清學三聯篩查結果

疾病類別陽性切割值陽性例數陽性率%唐氏綜合征1/2705576.4718-三體綜合征1/350150.17開放性神經管缺陷2.5480.56合計/6207.20

2.2 羊水細胞培養染色核型分析 共284例高風險孕婦接受羊水穿刺進行產前診斷，其中260例進行了羊水細胞培養染色體核型分析。結果見表2、圖1a～c。

a.21-三體綜合征，核型分析結果：47，XY，+21，10×100；b.特納綜合征，核型分析結果：45，X，10×100；c.4號和15號染色體易位，核型分析結果：46，XX，t(4,15)，10×100。

圖1 異常染色體核型分析圖

表2 異常羊水細胞培養染色體核型分析結果

異常類型異常核型例數21-三體綜合征47,XY,+21618-三體綜合征47,XX,+182特納綜合征45,X2克氏征47,XXY1其他染色體結構畸變46,XX,t(4,15)146,X,t(X,17)1

2.3 未培養羊水細胞直接熒光原位雜交試驗 本研究接受羊水穿刺的284例高風險孕婦有24例接受熒光原位雜交技術進行快速產前診斷，并同時進行了羊水細胞培養染色體核型分析。熒光原位雜交結果共檢出21-三體綜合征2例。隨后核型分析驗證結果符合率達100%。結果見圖2。

細胞紅色信號為21號染色體。

圖2 2例21-三體綜合征羊水細胞熒光原位雜交結果

2.4 隨訪結果 共有7986例產前篩查陰性及288例未接受羊水穿刺的高風險孕婦，共有8191例成功獲得隨訪，隨訪率達99%。隨訪結果表明產前篩查21-三體低風險孕婦有2例出生了21-三體患兒。有3例未接受產前診斷的孕高風險孕婦出生了21-三體患兒。結合隨訪結果，計算本實驗室利用血清學三聯指標產前篩查對21-三體診斷的總檢出率為84.62%，假陽性率6.34%，假陰性率為0.02%。

2.5 孕婦年齡與產前篩查的關系 本研究以35歲為分界點，將8606例孕婦分為兩組,高齡組(≥35歲)共106例，篩查唐氏綜合征陽性者30例，陽性率為28.3%；低齡組(<35歲)共8506例，篩查陽性者527例，陽性率為6.19%。高齡組陽性率明顯高于低齡組，差異有統計學意義(χ2=84.58，P<0.01)。見表3。

表3 高齡組和低齡組孕婦唐氏綜合征高風險率比較

預產年齡/歲n陽性例數陽性率/%<3585065276.2≥351063028.3*

3 討論

唐氏綜合征是新生兒中發病率較高的一種染色體疾病，發病率約為1/800～1/600[1]，是導致孕婦流產、死胎以及新生兒出生缺陷的常見原因之一。患者主要表現為嚴重的智力發育障礙，特殊面容，生長發育遲緩等。有文獻報道，孕中期AFP、free-βHCG二聯法篩查唐氏綜合征的檢出率為68%～86%，假陽性率為5%，而加入了uE3的三聯法篩查可進一步降低假陽性率[2-4]。雌三醇是由胎兒腎上腺皮質和肝臟提供前體物質，最后由胎盤合成的一種甾體激素，以游離形式直接由胎盤分泌進入母體血循環。Muller[5]和Canick[6]均發現uE3在懷有唐氏綜合征胎兒的孕婦血清中的濃度較正常孕婦偏低，所以測定孕婦血清uE3水平對唐氏綜合征的篩查具有一定意義。我院采用AFP、free-βHCG、uE3的三聯法檢測孕中期婦女血清中的AFP、free-βHCG、uE3的濃度，篩查出唐氏綜合征的高風險率為6.47%，與近幾年國內報道的5.67%相比[7-8]，差異無統計學意義。

本研究發現高齡組孕婦(≥35歲)唐氏綜合征高風險率明顯高于低齡組孕婦(<35歲)，因此，年齡因素是引起唐氏綜合征的高危因素之一。雖然唐氏綜合征的高風險率與孕婦年齡的遞增之間存在一定關聯，但不能認為只有高齡孕婦才會孕育唐氏患兒。有關資料顯示，大部分唐氏綜合征患兒還是發生于低齡孕婦，所以不能僅僅對高齡孕婦進行產前篩查，而必須對所有孕婦進行篩查，以防漏篩。同時重點關注高齡孕婦，從而有效預防唐氏患兒的出生。

對篩查結果為高風險的孕婦，在告知孕婦相應風險后，本著自愿的原則進行羊水細胞染色體核型分析及FISH檢測，以進一步確診是否孕育染色體異常的胎兒。雖然羊水細胞染色體核型分析是產前診斷的金標準，但細胞培養周期較長，大約需要5～7 d，加之后續的一系列操作，一般要2～3周才可報告結果，并且操作過程中對操作人員的技術要求和操作環境的無菌要求都較高，稍有不慎，都會造成標本的污染。相比于傳統的羊水細胞染色體核型分析而言，FISH檢測具有診斷快速、結果直觀等優勢，一般24 h甚至更短時間便可報告結果，且可靠性達到99.8%以上，大大縮短了孕婦等待結果的時間，減輕了孕婦的心理壓力。

羊水細胞染色體核型分析和FISH檢測都屬于侵入性實驗，在對孕婦進行羊膜腔穿刺抽取羊水的過程中存在一定的風險。據報道，羊水穿刺會使流產的風險率提高0.5%～1%[9]，并且絕大多數高危孕婦羊水細胞染色體核型分析結果正常[10]。因此，探尋一種操作安全且結果準確的無創產前檢測技術已成為必然。

1997年，Lo等[11]研究發現在孕婦的血漿中存在胎兒游離DNA(cell free fetal DNA，cff-DNA)，這一重大發現為無創產前檢測技術的研究開辟了新的領域。伴隨著新一代高通量測序技術的迅猛發展，無創DNA產前檢測技術應運而生。無創DNA產前檢測技術是通過對孕婦外周血中胎兒游離DNA進行高通量測序，并將測序結果進行生物信息學分析，從而得出胎兒發生染色體非整倍體的風險率。該技術具有準確率高、周期短等優點，據有關文獻報道，準確率可高達99%[12]。雖然現階段該技術成本較高，尚未得到廣泛應用，但隨著技術的發展，檢測成本的下降，這一技術必將為大眾所接受，從而最大限度地減少侵入式產前診斷給孕婦帶來的風險。

對孕中期婦女進行產前篩查與產前診斷，能夠有效預防出生缺陷兒的出生，提高我國的出生人口素質，具有重要的臨床應用價值。血清三聯法篩查相比于以往的二聯法，具有更高的檢出率，應在臨床上大力推廣。

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Analysis of the serological screening index and prenatal diagnosis findings in 8606 women in the second trimester

ZHU Xiang,XU Fang,WANG Yuping,FU Xia,LI Shuqin,LI Li,PU Chun,WU Qiwen

Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective： To assess the clinical value of prenatal diagnosis and serological screening indicators for accurate predication of trisomy 21 syndrome.Methods:Serological screening tests pertainting to α-fetoprotein(AFP),β-human chorionic gonadotrophin(β-HCG) and free estriol(uE3) were performed with time-resolved fluorescence immunoassay in 8606 women during thier second trimester.The risk values were estimated with the risk assessment software for prenatal screening data based on women in south China by consideration of risk factors associated with age,pregnant weeks and body weight of pregmant women.Karyotype analysis for amniotic fluid and fluorescence in situ hybridization were offered to the women at high risks,and telephone interview was done to the women at low risks and those at high risks refusing prenatal diagnosis.Results:①Screened positive rates for Down′s syndrome(DS),Edward′s syndrome(ES) and opening neural tube defects(ONTD) were 6.47%(557/8606),0.17%(15/8606) and 0.56%(48/8606) in teh 8 606 women;② Prenatal diagnosis by amniotic cell culturing revealed DS in 8 cases and ES in 2.Besides,chromosome karyotype determination of the amniotic cells revealed Turner syndrome in 3 cases,Klinefelter syndrome in 1 and chromosomal abnormalities in 2;③ Telephone interview showed that serological indicators had screened 84.62% of DS in prenatal diagnosis,though false positive rate(6.34%) and false negative rate(0.02%) occurred.Conclusion： Second trimester serological screening plus amniocentesis may be valuable role in prevention of common chromosome syndromes.

prenatal screening;prenatal diagnosis;Down′s syndrome;fluorescence in situ hybridization

1002-0217(2016)06-0568-04

弋磯山醫院人才引進項目(YR200904)；弋磯山醫院三新項目(Y1457)

2016-01-21

朱 翔(1991-),男,2014級碩士研究生,(電話)15905538529,(電子信箱)xiaozhuhanzi@163.com； 武其文,男,副主任醫師,(電子信箱)yjslab@163.com，通信作者.

R 714.5

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