NLRP3與NOD2受體激活對下游炎癥因子表達的影響*

韓浩賢,王虹艷,曲 鵬,田云朋

(1.天津醫科大學護理學院，天津 300070;2.大連醫科大學附屬第二醫院心內科，大連 116027;3.天津市第一中心醫院心內科，天津 300070)

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NLRP3與NOD2受體激活對下游炎癥因子表達的影響*

韓浩賢1,王虹艷2△,曲 鵬2,田云朋3

(1.天津醫科大學護理學院，天津 300070;2.大連醫科大學附屬第二醫院心內科，大連 116027;3.天津市第一中心醫院心內科，天津 300070)

目的 核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)與核苷酸結合寡聚化結構域2(NOD2)受體被其特異性配體激活后對下游炎癥因子表達的影響。方法 實驗分為4組：空白對照組、TATP組、TMDP、TMDP+ATP組。用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定白細胞介素(IL)-1β及IL-18的表達， 逆轉錄PCR測定NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)的表達情況。結果TMDP組、TATP組、TMDP+ATP組的IL-1β和IL-18水平均高于空白對照組(P<0.05)，且TMDP+ATP組水平增高更顯著。TMDP組、TATP組、TMDP+ATP組的NLRP3和Caspase-1表達均高于空白對照組(P<0.05)，且TMDP+ATP組水平增高更顯著(P<0.05)。結論NOD2的特異性配體胞壁酰二肽，NLRP3的特異性配體腺苷三磷酸單獨刺激THP-1后NLRP3及下游炎癥因子的表達很弱或無表達，聯合刺激后可顯著增強NLRP3及下游炎癥因子的表達，二者之間存在相互促進及協同作用。

白細胞介素-18；白細胞介素-1β；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1；NLRP3

隨著經濟水平的提高，我國冠心病的發病率和病死率也逐年升高,并呈年輕化趨勢，造成冠狀動脈狹窄或阻塞的最常見原因是動脈粥樣硬化。近年研究表明，細胞膜表面的Toll樣受體和細胞質內的核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NIRP3)樣受體是介導先天免疫系統和動脈粥樣硬化的橋梁[1]，目前核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)參與形成動脈粥樣硬化的研究逐漸受到重視。Duewell等[2]研究證實NLRP3炎癥小體可能參與了動脈粥樣硬化的發生和發展 。白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素18(IL-18)等炎癥因子介導的免疫機制參與了冠心病動脈粥樣硬化形成的早期階段，促進了微血栓的形成及不穩定斑塊的破裂。胞質受體NLRP3和NOD2恰是以此形式來啟動機體的免疫和炎癥反應，從而在動脈粥樣硬化的形成及發展過程中發揮了重要作用[3]。NOD2和NLRP3是先天免疫模式識別受體最具有代表性的2個成員，目前關于二者的特異性配體胞壁酰二肽(MDP) 、腺苷三磷酸(ATP)聯合刺激細胞后是否可以引起NLRP3及下游炎癥因子表達顯著增加的報道較少。本實驗旨在探討NLRP3與NOD2這兩個胞內受體的激活對其下游炎癥因子表達的影響，以期為動脈粥樣硬化的治療提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞株 單核細胞株(THP-1)購自中科院上海生命科學研究院。

1.1.2 主要試劑、實驗設備和儀器 MDP(Sigma公司)；ATP(Sigma公司)；IL-1β、IL-18酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Bioscience 公司)；NLRP3抗體(100 μL，Sigma公司)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)抗體(100 μL，Sigma公司)；CO2孵箱(Thermo Forma,美國)；電泳儀(六一儀器廠，北京)；逆轉錄PCR(RT-PCR)儀(Bio-Rad iQ5,美國)；倒置顯微鏡CK40-F200型(Olympus公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 空白對照組：加入磷酸鹽緩沖液(PBS)100 μL后放入孵箱恒溫孵育24 h；TMDP組：加入25 μL MDP，使其濃度至10 μmol/L，放入孵箱恒溫孵育24 h[5]；TATP組：加入256 μL ATP，使其濃度至100 μmol/L，放入孵箱恒溫孵育24 h[6]；TMDP+ATP組：加入25 μL MDP，使其濃度至10 μmol/L，放入孵箱恒溫孵育2 h進行MDP的預處理，再加入256 μL ATP，使其濃度至100 μmol/L，最后再置孵箱恒溫孵育24 h。

1.2.2 用ELISA測定細胞培養物IL-1β及IL-18的水平 嚴格按照試劑盒說明書步驟進行顯色，用酶標儀在450 nm測定光密度(OD)值，繪制標準曲線，根據標準曲線，求得樣本水平濃度。

1.2.3 單核細胞RNA提取及RT-PCR Trizol法提取細胞RNA，并進行RNA水平的測定。PCR引物由天津賽爾生物技術有限公司合成(表1)。逆轉錄反應體系嚴格按照試劑盒說明書操作。運用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)進行RT-PCR反應。反應條件：SYBR Green Mix(2x)10.0 μL；ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL；Primer 1(5 pmol/μL)1.0 μL；Primer 1(5 pmol/μL)1.0 μL；Primer 1(5 pmol/μL)1.0 μL；Primer 2(5 pmol/μL)1.0 μL；Template 0.5 μL；雙蒸水ddH2O 7.1 μL；每孔20.0 μL。熱循環：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 60 s；72 ℃ 40 s；40個循環。

表1 目的基因和內參β-actin的引物序列

2 結 果

2.1MDP、ATP單獨刺激及聯合刺激THP-1后對IL-1β和IL-18表達的影響MDP、ATP及MDP+ATP對單核細胞株分泌IL-1β、IL-18的影響：MDP、ATP及MDP+ATP作用于單核細胞株24h后，上清液中IL-1β、IL-18的水平升高(P<0.05)，而TMDP+ATP組所致的IL-1β、IL-18水平與TMDP組、TATP組比較顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 MDP、ATP及MDP+ATP對單核細胞株分泌IL-1β、IL-18的影響

2.2RNA總電泳圖RNA提取濃度0.5～2.0μg/μL， OD260/OD2801.8～2.0，RNA提取純度可滿足本實驗要求；所有標本在凝膠電泳圖上均可見清晰28、18、5s3條帶，其中28s條帶的亮度達到18s亮度的兩倍以上，符合本實驗要求，見圖1。

圖1 RNA總電泳圖

2.3MDP、ATP單獨刺激及聯合刺激THP-1后對NLRP3、Caspase-1mRNA表達的影響 所有標本均重復檢測3次取均值，MDP、ATP及MDP+ATP均可增加單核細胞株NLRP3、Caspase-1mRNA的表達(P<0.05)，但TMDP+ATP組可以明顯增加上述炎癥因子的表達(P<0.05)，見表3、4。

表3 各組對單核細胞株NLRP3 mRNA的表達

表4 各組對單核細胞株Caspase-1 mRNA的表達的影響

3 討 論

研究表明ATP是NLRP3的特異性配體，無活性的NLRP3必須通過ATP聚合最終產生有活性的NLRP3來切割Caspase-1前體(Pro-caspase-1)并使其活化，活化后的Caspase-1再次切割IL-1β、IL-18等底物，誘發少量IL-1β和IL-18的成熟和泌出[4]。本實驗ELISA結果與既往的研究結果相符[5-6]。特異性配體MDP與NOD2結合后可啟動核因子κB(NF-κB)經典信號通路，活化的NF-κB可增強NOD2的基因表達，彼此形成一個正反饋環路，增強了IL-1β、IL-18前體的轉錄，最終加快了促炎癥因子的產生和泌出，從而參與炎癥反應，并具有調控炎癥反應的功能[7-8]。有研究證實NOD2可通過激活NALP1最終致使Caspase-1活化，并分泌少量炎癥因子[9]。至此可知活化的NOD2和NLRP3均可以激活Caspase-1。由此猜想NOD2和NLRP3在產生IL-1β和IL-18的過程中也有一定的交互關系。本研究單獨MDP、ATP刺激單核細胞后，IL-1β、IL-18的水平比較微弱表達，但與空白對照組相比較差異有統計學意義。MDP預處理后的單核細胞中加入ATP，ELISA測試后發現IL-1β、IL-18的水平顯著高于空白對照組，較二者單獨刺激后有明顯差異。但IL-1β差異較顯著，這可能與它自身特性有關，胞外的IL-1β與胞內的核因子κB(NF-κB)、胞內的NF-κB與細胞質內的NOD2構成兩對正反饋環路，從而放大最初的炎癥信號，導致機體損傷及微循環障礙加重[10]。

由Real-timePCR結果猜想可能與以下因素有關：(1)采納的MDP預處理時間與NF-κB達到峰值的時間相符；(2)MDP所致NF-κB信號通路的活化，為大量炎癥前體基因的轉錄提供了前提條件。Caspase-1的活化不僅是ATP激活NLRP3的結果，而且是MDP激活NLRP1的結果，Caspase-1是二者聯合刺激后產生效應的關鍵點[11]；(3)MDP的預刺激既提供了大量無活性的NLRP3蛋白寡聚體又加強了NLRP3對ATP的敏感性，從而導致更多Caspase-1的自身激活[12];(4)MDP激活NOD2后促使正反饋環路形成，大量的NOD2憑借NLRP1這條途徑切割Pro-Caspase-1，誘發大量IL-1β、IL-18分泌到細胞外，而細胞外IL-1β的增多又促進了其上游因子間正反饋環路的構成。

綜上，MDP、ATP單獨刺激單核細胞后NLRP3及下游炎癥因子的表達很微弱，MDP聯合ATP刺激細胞后可促進NLRP3及下游炎癥因子的表達顯著增加，二者之間存在促進及協同作用，但產生協同效應的具體機制及信號途徑的具體位點尚不清楚，有待于進一步研究去證實。NLRP3及炎癥因子參與了動脈粥樣硬化的形成與發展，干預其下游因子及調控其信號通路將為治療動脈粥樣硬化的形成提供新的方向。

[1]FukataM,VamadevanAS,AbreuMT.Toll-likereceptors(TLRs)andNod-likereceptors(NLRs)ininflammatorydisorders[J].SeminImmunol,2009,21(4):242-253.

[2]DuewellP,KonoH,RaynerKJ,etal.NLRP3inflammasomesarerequiredforatherogenesisandactivatedbycholesterolcrystals[J].Nature,2010,464(7293):1357-1361.

[3]WangL,QuP,ZhaoJ,etal.NLRP3anddownstreamcytokineexpressionelevatedinthemonocytesofpatientswithcoronaryarterydisease[J].ArchMedSci,2014,10(4):791-800.

[4]MayorA,MartinonF,DeSmedtT,etal.AcrucialfunctionofSGT1andHSP90ininflammasomeactivitylinksmammalianandplantinnateimmuneresponses[J].NatImmunol,2007,8(5):497-503.

[5]WangL，QuP，ZhaoJ，etal.NLRP3anddown-streamcytokineexpressionelevatedinthemonocyofpatientswithcoronaryarterydisease[J].ArchMedSci,2014(10):791-800.

[6]HoegenT,TremelN,KleinM,etal.TheNLRP3inflammasomecontributestobraininjuryinpneumococcalmeningitisandisactivatedthroughATP-dependentlysosomalcathepsinBrelease[J].JImmunol,2011,187(10):5440-5451.

[7]ParkJH,KimYG,McdonaldC,etal.RICK/RIP2mediatesinnateimmuneresponsesinducedthroughNod1andNod2butnotTLRs[J].JImmunol,2007,178(4):2380-2386.

[8]StroberW,MurrayPJ,KitaniA,etal.SignallingpathwaysandmolecularinteractionsofNOD1andNOD2[J].NatRevImmunol,2006,6(1):9-20.

[9]FranchiL,EigenbrodT,NúezG.Cuttingedge:TNF-alphamediatessensitizationtoATPandsilicaviatheNLRP3inflammasomeintheabsenceofmicrobialstimulation[J].JImmunol,2009,183(2):792-796.

[10]DinarelloCA.AclinicalperspectiveofIL-1βasthegatekeeperofinflammation[J].EurJImmunol,2011,41(5):1203-1217.

[11]HsuLC,AliSR,McgillivrayS,etal.ANOD2-NALP1complexmediatescaspase-1-dependentIL-1betasecretioninresponsetoBacillusanthracisinfectionandmuramyldipeptide[J].ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(22):7803-7808.

[12]JarryA,ValletteG,CassagnauE,etal.Interleukin1andinterleukin1betaconvertingenzyme(caspase1)expressioninthehumancolonicepithelialbarrier.Caspase1downregulationincoloncancer[J].Gut,1999,45(2):246-251.

Affect of NLRP3 and NOD2 activated on the downstream inflammatory cytokines*

HanHaoxian1,WangHongyan2△,QuPeng2,TianYunPeng3

(1.theSchoolofNursing,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China;2.CardiovascularInternalMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian，Liaoning116027,China;3.CardiovascularInternalMedicine,theFirstCentralHospitalofTianjin，Tianjin300070,China)

Objective To explore the affect of NLRP3 and NOD2 activated on the downstream inflammatory cytokines.Methods The cases were divided into 4 groups:blank control group,TMDPgroup,TATPgroup and TMDP+ATPgroup.The expression of IL-1β and IL-18 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),and the expression of NLRP3 and Caspase-1 were tested by real-time PCR.Results The levels of IL-1β and IL-18 in TMDPgroup，TATPgroup and TMDP+ATPgroup were higher than that of blank control group(P<0.05),and the group of TMDP+ATPlevels increased more significantly(P<0.05).The expression of NLRP3 and Caspase-1 in TMDPgroup,TATPgroup and TMDP+ATPgroup were higher than that of blank control group(P<0.05)，and the levels of TMDP+ATPgroup increased more significantly(P<0.05).Conclusion The expression of NLRP3 and downstream inflammatory factors are weak or no expressions occur when MDP (specific ligand of NOD2) and ATP (specific ligand of NOD2) independently stimulate THP-1.However,the expression is enhanced significantly after the joint stimulation,which means that MDP and ATP have synergistic and promoting relationship.

IL-18；IL-1β;Caspase-1；NLRP3

遼寧省自然科學基金(2013023025) 。 作者簡介：韓浩賢(1983-)，實驗師，碩士，主要從事心血管病方面研究。△

E-mail：hongyanwang1967@aliyun.com。

論著·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.005

R

A

1671-8348(2016)23-3182-03

2016-04-01

2016-06-23)