機械力刺激對人肺泡上皮A549細胞JNK蛋白表達的影響*

胡曉波，張優儀，程德云

(1.四川省成都市第一人民醫院呼吸內科 610041；2.四川省人民醫院放射科，成都 610041；3.四川大學華西醫院呼吸內科，成都 610041)

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論著·基礎研究

機械力刺激對人肺泡上皮A549細胞JNK蛋白表達的影響*

胡曉波1，張優儀2，程德云3△

(1.四川省成都市第一人民醫院呼吸內科 610041；2.四川省人民醫院放射科，成都 610041；3.四川大學華西醫院呼吸內科，成都 610041)

目的 探討機械力刺激對人肺泡上皮A549細胞c-Jun氨基末端激酶/促分裂原活化蛋白激酶 (JNK/MAPK)表達的影響。方法 建立離體的A549細胞機械刺激模型：分別以大小為1 000μstrain的張應力或壓應力刺激細胞，在刺激前和刺激后0、5、15、30、60min時間點進行觀察，共10組，每組3皿細胞。采用Westernblot檢測機械刺激后細胞內磷酸化JNK/MAPK蛋白、總JNK/MAPK蛋白的表達變化。結果A549細胞經機械力刺激后，磷酸化JNK/MAPK蛋白水平增加。張應力組在30min時間點增加最明顯，壓應力組在15min時間點最明顯。之后隨著機械刺激時間延長，張應力和壓應力刺激組的磷酸化JNK蛋白水平均出現下降，在60min時下降至基線水平。結論 1 000μstrain張應力或壓應力刺激，均激活A549細胞JNK/MAPK，提示JNK通路可能參與了機械力誘導的A549細胞信號轉導。

肺泡；蛋白質類；機械力；A549；JNK/MAPK；張應力；壓應力

呼吸機誘導的肺損傷是機械通氣最直接的危害。為了提高機械通氣救治率，減少患者死亡，眾多研究試圖闡明呼吸機誘導肺損傷的相關機制[1-5]。國外研究發現機械力可引起肺上皮細胞釋放炎癥介質，產生活性氧簇，引起細胞增殖，導致細胞骨架蛋白改變等[6-9]，而國內鮮有這方面的報道。c-Jun氨基末端激酶/促分裂原活化蛋白激酶 (JNK/MAPK)是有絲分裂原活化蛋白酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中重要的信號傳導因子，是否參與了肺細胞力信號的轉導并不清楚。因此，本課題組在前期研究基礎上[10-11]，觀察機械力刺激人肺泡上皮A549細胞JNK/MAPK蛋白的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料 A549細胞株(美國標準生物品收藏中心)；DMEM細胞培養基和10%的小牛血清(美國GIBCO公司)；聚氟乙烯膜(PVDF膜，美國Millipore公司)；兔抗人JNK多克隆抗體、兔抗人磷酸化JNK抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體(美國Cell signaling公司)；蛋白定量試劑盒、發光底物試劑盒(美國Pierce公司)；4點彎曲細胞力學加載儀(成都電子科技大學研制)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將A549細胞培養于含10%小牛血清的DMEM培養液中，置于CO2孵箱(37 ℃，5%CO2，95%空氣)。當細胞生長密度約80%時，用胰酶消化傳代。按2×105/L的細胞密度接種于加力板上，然后放入培養皿，于孵箱中繼續培養24～48 h。加力前用無血清培養基孵育細胞過夜，使細胞同步化。

1.2.2 試驗分組 根據機械力的不同，試驗分張應力試驗和壓應力試驗。張應力試驗設0、5、15、30、60 min刺激共5組。壓應力試驗設0、5、15、30、60 min 刺激也是5組。每組3皿細胞。

1.2.3 建立離體細胞刺激力學模型 分別以大小為1 000 μstrain 的張應力和壓應力刺激A549細胞，在刺激后5、15、30、60 min時間點進行觀察；0 min刺激組行偽暴露。

1.2.4 Western blot法檢測蛋白表達 按文獻[10-11]方法提取細胞總蛋白、蛋白定量，Western blot法檢測蛋白表達。棄上清液，加入細胞裂解液后再用超聲裂解儀破碎，4 ℃低溫離心分裝樣本，然后蛋白濃度測定。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，上樣前加變性劑。電泳完畢后切膠，蛋白電泳轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，過夜。以三羥甲基氨基甲烷(TBST)緩沖液漂洗，加一抗1∶1 000，37 ℃孵育1 h，如前漂洗。再加入辣根過氧化酶標記的二抗(抗兔1∶5 000)，再孵育60 min，再TBST漂洗3次。加入顯色劑，暗室曝光，見到顯色后終止反應，清水沖洗。用Bio-Image分析系統對條帶灰度值測定。

2 結 果

0 min時經機械應力偽刺激有低水平的JNK磷酸化陽性反應，張應力組0 min時為0.56±0.12，壓應力組0 min時0.62±0.22。隨著應力刺激開始，JNK/MAPK蛋白磷酸化出現變化趨勢。張應力刺激5 min時為0.71±0.17，JNK/MAPK蛋白磷酸化表達增多，但和0 min時間點相比較差異無統計學意義(P>0.05)。隨著時間的延長，JNK/MAPK蛋白磷酸化表達呈上升趨勢。張應力組15 min時為1.03±0.21，磷酸化JNK和0 min時(0.56±0.12)比較差異有統計學意義(P<0.05)。張應力組30 min時間點磷酸化JNK條帶灰度值最高，至60 min磷酸化水平又明顯減少，接近刺激前水平。壓應力組刺激5 min時為0.98±0.30，JNK/MAPK蛋白磷酸化表達增多和0 min時(0.62±0.22)比較差異有統計學意義(P<0.05)。壓應力組15 min時為1.47±0.52，磷酸化JNK水平表達最高，和0 min時比較差異有統計學意義(P<0.05)。壓應力組30 min時磷酸化JNK水平開始下降，在壓應力組60 min時磷酸化JNK水平接近機械刺激前水平，見圖1。

圖1 機械張應力和壓應力刺激A549細胞后不同時間點磷酸化JNK、總JNK、內參β-actin的表達

3 討 論

體外培養細胞然后施加機械應力刺激的力學模型是目前較為新穎的研究方式，已經應用于呼吸領域[12]。肺泡上皮細胞在受到機械力刺激后，胞內鈣離子濃度出現變化，肌動蛋白絲聚合等，并引發了后續細胞內一系列信號轉導[13]。JNK廣泛存在于真核細胞中，介導機體細胞的生長、分化、分裂、死亡等多種生物學行為，是細胞信息傳遞的樞紐。JNK位于細胞質,相對分子質量為46×103和54×103，通過蘇氨酸和酪氨酸殘基羥基側鏈的雙重磷酸化而被激活。JNK蛋白激酶有3個基因編碼：JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和JNK2基因在全身廣泛表達，主要在生物學和病理過程中發揮作用。多種細胞外信號如熱損傷、紫外線、滲透壓改變、放射線、炎性信號因子、氧自由基、休克等均可激活JNK/MAPK信號通路[14]。研究發現機械牽拉刺激可活化JNK/MAPK信號通路，促進心肌細胞增生[15]。而關于機械牽拉刺激肺上皮細胞是否能激活其JNK MAPK信號通路目前尚未見詳細研究。

本課題組應用4點加力裝置，通過免疫印跡法觀察機械應力刺激肺上皮A549細胞內JNK信號通路的活化情況。該4點加力裝置，可以分別提供張應力和壓應力。本研究觀察到0 min時經機械應力偽刺激仍然有低水平的JNK磷酸化陽性反應，說明正常情況下的A549細胞有一定量的JNK磷酸化本底。通過不同類型的應力刺激，觀察細胞內的信號因子的變化情況。本研究發現，不論哪種應力刺激，A549細胞受到機械應力作用后，細胞內的磷酸化JNK水平均有增高，并有一定的時間變化規律，提示JNK可能參與了A549細胞內的機械應力信號轉導。研究觀察到，隨時間進一步推移，JNK磷酸化程度反而有所下降。推測產生上述變化的原因可能是由于刺激時間過長以后，力傳導因子如離子通道或細胞骨架產生耐受，在一定不應期內對持續的應力不再起反應，使得細胞內后續生物化學反應停止，中斷了機械力信號向胞內傳導，而原本激活的JNK已被磷酸酯酶去磷酸化失活所致。

總之，本試驗對機械力刺激肺A549細胞的JNK蛋白表達變化進行了初步研究，探討了不同種類的應力對A549細胞內重要信號因子表達的影響，提示機械應力對A549細胞JNK蛋白的磷酸化有著重要作用。這為后續研究肺細胞機械力信號轉導機制打下了基礎。

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Expression of JNK/MAPK in A549 cells induced by mechanical force*

HuXiaobo1，ZhangYouyi2，ChengDeyun3△

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstPeople′sHospitalofChengduCity,Chengdu,Sichuan610041,China；2.DepartmentofRadiology,SichuanProvincialPeople′sHospital，Chengdu，Sichuan610041,China；3.DepartmentofRespiratoryMedicine,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610041,China)

Objective To explore whether the JNK/MAPK is involved in the mechanotransduction of the A549 cells induced by mechanical force.Methods Cells were divided into ten groups:tensile stress groups(0，5，15，30，60 min),and compressive stress groups(0，5，15，30，60 min)，3 replicate wells in each group.Cells were stimulated by tensile stress or compressive stress respectively at the magnitude of 1 000 μstrain for 5，15，30，60 min.Then the protein level of JNK and phosphorylated JNK were tested by Western blot.Results After mechanical stimulation,the protein level of phosphorylated JNK/MAPK increased.These were most obviously at the 30 min time point in both tensile stress group and the 15 min time point in compressive stress group.However,the protein level of phosphorylated JNK/MAPK returned to the original level at the 60 min time point in tensile stress group and the compressive stress group.Conclusion Mechanical force activated the expression of JNK in A549 cells.JNK pathway might be involved in signal transduction in A549 cells induced by mechanical force.

pulmonary alveoli；proteins；mechanical force;A549;JNK/MAPK;tensile stress；compressive stress

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.007

四川省衛生廳科學研究基金項目(100051)；成都市科技計劃項目(12PPYB042SF-002)。 作者簡介：胡曉波(1976-)，副主任醫師，博士，主要從事呼吸系統的生物力學方面研究。△

E-mail：chengdeyun@sohu.com。

R563.8；R

A

1671-8348(2016)23-3188-02

2016-04-23

2016-06-23)