高原低氧環境氣虛小鼠腎、骨和腦組織反應性變化的分子機制研究

安方玉，駱亞莉，劉永琦，2，李應東，2，劉雪松，史旭鋒，高卓越，2

1.甘肅中醫藥大學，甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫藥大學臨床學院，甘肅 蘭州 730000

高原低氧環境氣虛小鼠腎、骨和腦組織反應性變化的分子機制研究

安方玉1，駱亞莉1，劉永琦1，2，李應東1，2，劉雪松1，史旭鋒3，高卓越1，2

1.甘肅中醫藥大學，甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫藥大學臨床學院，甘肅 蘭州 730000

目的 觀察高原低壓低氧環境中小鼠腎、骨、腦組織的適應性反應分子機制，探討腎與腦髓的陰陽上下升降互濟的統一性。方法 將SPF級小鼠采用隨機數字表法分為正常對照組、模型組。模型組小鼠于低氧艙中模擬高海拔環境進行低氧暴露，連續21 d。第22日出艙稱重后眼球采血處死小鼠。比色分析法檢測各組小鼠腦組織乳酸脫氫酶（LDH）及Na+-K+-ATP酶活性。ELISA檢測各組小鼠腦、骨骼肌組織磷酸果糖激酶（PFK）活性及腎組織促紅細胞生成素（EPO）及其受體（EPOR）的含量。RT-PCR檢測各組小鼠腦組織缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和水通道蛋白（AQP）-4 mRNA表達，Western blot檢測腦組織HIF-1α、AQP-1及骨骼肌組織肌紅蛋白（Mb）蛋白表達。結果 與正常對照組比較，模型組小鼠腎組織EPO含量升高，腦組織LDH、PFK活性增強(P＜0.05)、HIF-1α和AQP-4的mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；模型組小鼠骨骼肌組織PFK活性增強和Mb蛋白表達水平升高（P＜0.05），腦組織Na+-K+-ATP酶活性和腎組織EPOR含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。結論 高原低壓低氧環境小鼠腎、骨和腦組織均發生了陰陽上下升降互濟的適應性反應。

高原低氧；分子機制；腎；骨；腦；小鼠

高原地區低壓、低氧、低溫、強輻射等因素對人體生理和免疫系統均有明顯的影響，其中，低氧是主要影響因素[1]。中醫認為高原清氣不足（缺氧）、燥寒二氣為主（干燥多風、寒冷低溫）。高原低氧多可誘發機體出現氣虛、寒凝、血瘀等證，成為高原反應及高原病發生發展的重要機制。中醫認為腎主骨生髓，通于腦。腎屬五臟，位于下焦，藏精、主骨生髓；腦屬奇恒之腑，位置最高，為諸陽之會，主認識。一屬陰，一屬陽，上下升降互濟，腎精腎水上滋腦髓，腦固攝升提腎氣，相互作用，互生互長，腎、骨、腦的升降互濟對維持機體平衡健康發揮關鍵作用[2]。基于此，本研究觀察了高原低氧環境中小鼠腎組織、骨骼肌組織、腦組織的反應分子機制，以期為腎與腦髓的上下升降互濟統一性及中西醫結合防治高原反應提供細胞與分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

KM種小鼠30只，SPF級，6～8周齡，體質量（20±2）g，甘肅中醫藥大學科研實驗中心，合格證號SCXK（甘）2011-0001，并在甘肅中醫藥大學科研實驗中心SPF級動物實驗室飼養。

1.2 主要試劑與儀器

乳酸脫氫酶（LDH）和Na+-K+-ATP酶檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號分別為20131026、20131108；小鼠磷酸果糖激酶（PFK）、促紅細胞生成素（EPO）及其受體（EPOR）precocated ELISA kit檢測試劑盒，源葉公司，批號均為20131101A；Trizol Reagent試劑（美國），批號47115；GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒和GoTaq qPCR Master Mix試劑盒，Promega，批號分別為0000079524和0000114742；山羊抗小鼠抗體和山羊抗兔多克隆抗體，ABCAM公司；山羊抗小鼠缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）抗體、水通道蛋白（AQP）-1抗體、肌紅蛋白（Mb）抗體，IMMNUWAY公司。723N型分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；FLYDWC50-IIA低壓氧艙，貴州風雷航空軍械有限責任公司；Bcnchnark Plus連續波長酶標儀，上海閃譜生物科技有限公司；美國Quawell Q5000超微量紫外可見分光光度計，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；S1000TMThermal Cycler、Molecular Imager ChemiDocTMXRS+With Image LabTMSoftware，BIO-RAD；7500 Real Time PCR System，英濰捷基（上海）貿易有限公司。

1.3 分組與造模

小鼠適應性飼養1周，常規飲食，自由飲水。采用隨機數字表法將小鼠分為正常對照組、模型組各30只。參考文獻[3-4]方法建立高原低氧小鼠模型，模型組小鼠置低壓氧艙內進行減壓低氧暴露：以10 m/s速度上升至3000 m 停留5 min，再以同樣速度上升至4500 m停留3 min，再以10 m/s 速度上升至6000 m，低氧暴露22 h 后，以15 m/s速度降至海平面高度。正常對照組小鼠常氧環境中飼養。連續21 d。

1.4 標本制備

末次低氧暴露后，眼球采血處死小鼠，分別摘取腦、腎及骨骼肌組織，用生理鹽水沖洗數遍后備用。其中，實驗過程中模型組死亡2只。

1.5 指標檢測

1.5.1 腎促紅細胞生成素及其受體水平測定 腎組織勻漿按質量（g）∶體積（mL）＝1∶9加入9倍生理鹽水，冰浴條件下2500 r/min離心10 min，取上清液用生理鹽水按1∶4稀釋成2%組織勻漿備用。ELISA檢測腎組織EPO和EPOR含量。操作方法按試劑盒說明進行，于酶標儀450 nm處測定各孔A值。以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求出EPO和EPOR線性方程。分別為Y＝0.042 3X＋0.102 7，r2＝0.990 8；Y＝0.024 3X＋0.158 9，r2=0.991 1。將各樣品A值代入方程求出對應的濃度。

1.5.2 腦組織乳酸脫氫酶、Na+-K+-ATP酶及磷酸果糖激酶活性測定 腦組織勻漿制備方法同“1.5.1”項。2,4-二硝基苯肼比色法檢測腦組織LDH活性，無機磷比色法檢測腦組織Na+-K+-ATP酶活性，ELISA檢測腦組織PFK活性，操作方法按試劑盒說明進行。其線性方程為：Y＝0.001 3X＋0.160 6，r2＝0.996 3。將各樣品A值代入方程求出對應的濃度。

1.5.3 腦組織缺氧誘導因子-1α和水通道蛋白-4基因表達檢測 冰浴條件下用Trizol Reagent試劑抽提腦組織總RNA，用超微量核酸測定儀檢測RNA濃度和純度。用GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒合成cDNA第一鏈，按熒光定量 PCR操作說明書進行PCR反應，反應條件：預變性95 ℃、2 min，變性95 ℃、15 s，退火58 ℃、45 s，延伸60 ℃、1 min。共45個循環。每個樣品各平行3次，數據經2-ΔΔCt處理后進行相對表達量分析。其中，β-actin、HIF-1α和AQP-4引物由TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司設計并合成。基因序列為：HIF-1α上游引物5'-GGACGATGAACATCAAGCA-3'，下游引物5'-AGGAAT GGGTTCACAAATCAGCA-3'，擴增產物長度146 bp；AQP-4上游引物5'-TGGAGCCAG CATGAATCCAG-3'，下游引物5'-ACGTTTGAGCTC CACATCAGGAC-3'，擴增產物長度157 bp；β-actin上游引物5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAC-3'，下游引物5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'，擴增產物長度172 bp。

1.5.4 腦組織缺氧誘導因子-1α和水通道蛋白-1蛋白表達檢測 用預冷的組織蛋白裂解液（RPMI∶PMSF＝1∶100）腦組織，提取腦組織總蛋白。用4×上樣緩沖液調整蛋白濃度為40 μg/20 μL。每孔點樣20 μL，進行SDS-PAGE（分離膠12%，濃縮膠5%）電泳后、電轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h。加一抗（山羊抗小鼠HIF-1α抗體、AQP-1抗體和GAPDH抗體），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜4次，將膜置于山羊抗兔辣根酶標記的二抗中，室溫孵育2 h后，TBST洗膜4次。用ECL化學發光顯影后，Bio-Rad凝膠成像儀采集信號并攝取凝膠圖像。

1.5.5 骨骼肌組織磷酸果糖激酶活性檢測 骨骼肌組織勻漿制備方法同“1.5.1”項。ELISA檢測骨骼肌組織PFK活性，按試劑盒說明進行。其線性方程為：Y＝0.001 2X＋0.188 2，r2＝0.996 4。將各樣品A值代入方程求出對應的濃度。

1.5.6 骨骼肌組織肌紅蛋白表達檢測 蛋白裂解、定量、SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、一抗及二抗孵育、ECL顯影及圖像采集等方法均同“1.5.4”項。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 高原低壓低氧環境對小鼠促紅細胞生成素及其受體含量的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腎臟中EPO含量升高（P＜0.05），EPOR含量降低（P＜0.01）。結果見表1。

表12 組小鼠腎組織EPO和EPOR含量比較s）

表12 組小鼠腎組織EPO和EPOR含量比較s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01（下同）

組別 只數 EPO/（IU/L） EPOR/（ng/mL）正常對照組 15 3.20±0.35 9.86±0.45模型組 13 3.63±0.31*7.00±0.81**

2.2 高原低壓低氧環境對小鼠腦組織乳酸脫氫酶、Na+-K+-ATP酶及磷酸果糖激酶活性的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腦組織LDH活性增強（P＜0.05），Na+-K+-ATP酶活性降低（P＜0.01），PFK活性增強（P＜0.05）。結果見表2。

表22 組小鼠腦組織LDH、Na+-K+-ATP酶和PFK活性比較（±s，U/L）

表22 組小鼠腦組織LDH、Na+-K+-ATP酶和PFK活性比較（±s，U/L）

?

2.3 高原低壓低氧環境對小鼠腦組織缺氧誘導因子-1α和水通道蛋白-4基因表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腦組織HIF-1α、AQP-4基因表達量均增加（P＜0.05，P＜0.01）。結果見圖1。

圖12 組小鼠腦組織HIF-1α和AQP-4基因表達

2.4 高原低壓低氧環境對小鼠腦組織缺氧誘導因子-1α和水通道蛋白-1蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腦組織HIF-1α和AQP-1蛋白表達量均增加（P＜0.01）。結果見圖2。

2.5 高原低壓低氧環境對小鼠骨骼肌組織磷酸果糖激酶活性的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠骨骼肌組織PFK活性增強（P＜0.05）。結果見表3。

2.6 高原低壓低氧環境對小鼠骨骼肌組織肌紅蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠骨骼肌組織Mb蛋白表達增強（P＜0.05）。結果見圖3。

圖22 組小鼠腦組織HIF-1α、AQP-1蛋白表達

表32 組小鼠骨骼肌組織PFK活性比較（±s，U/L）

表32 組小鼠骨骼肌組織PFK活性比較（±s，U/L）

組別 只數 PFK正常對照組 15 3.20±0.35模型組 13 3.63±0.31*

圖32 組小鼠骨骼肌組織Mb蛋白表達

3 討論

中醫學認為，主骨生髓，通于腦，腎主藏精，而能生髓，髓居于骨中，骨賴髓以充養。所以，《素問?宣明五氣篇》有“腎主骨”，《素問?陰陽應象大論篇》有“腎生骨髓”。腎精充足，則骨髓的生化有源，骨骼得到髓的充足滋養而堅固有力。如果腎精虛少，骨髓的化源不足，不能營養骨骼，便會出現骨骼脆弱無力，甚至發育不良。EPO在胚胎早期由肝臟產生，并逐漸轉移至腎臟，出生后主要由腎皮質近曲小管管周細胞分泌，是一種激素樣的糖蛋白。EPO可與腎組織及骨髓中紅系干細胞表面的紅細胞生成素受體結合，刺激紅系干細胞，促進紅系干細胞增殖、分化和成熟，使紅細胞數增多，血紅蛋白含量增加。并能穩定紅細胞膜，增強紅細胞抗氧能力。紅細胞是脊椎動物體內通過血液運送氧氣的最主要的媒介，紅細胞把氧氣運輸給人身體組織的各部位，再從各部位運送出代謝產物二氧化碳，所以紅細胞是我們人體內不可缺少的“運輸隊”，保證組織能量代謝的正常運行。EPO系統的研究發現，不僅為臨床防治血液系統臨床疾病提供了新途徑，也進一步為中醫的腎藏精，精血互生，腎主骨，精生髓理論提供了細胞生物學科學依據。本研究中發現，與正常對照組比較，模型組小鼠腎組織EPO含量升高，提示高原低氧環境可能通過刺激腎臟分泌EPO促進紅細胞適應性增多，從而增強攜氧能力；但模型組小鼠EPOR含量明顯降低，影響了EPO與靶細胞的有效結合及其活性的發揮。

Mb是一種主要分布于心肌和骨骼肌組織的氧結合血紅素蛋白，是機體內的細胞儲氧器。在氧分壓相同的情況下，Mb結合氧的能力比Hb高6倍，其中低氧誘導因子可活化控制Mb合成的基因。因此，Mb在心肌和骨骼肌組織的含量多少，直接影響肌細胞的攝氧能力，從而影響機體在缺氧條件下的適應能力。研究發現，世居高原的動物和人骨骼肌組織中Mb的含量比平原水平高，原居民與平原動物（如大鼠、囊鼠和豚鼠）等在經過3100～5000 m海拔高度馴化后，其骨骼肌組織中Mb則會顯著增加[5]。本研究結果也表明，高原低氧環境小鼠骨骼肌組織Mb的蛋白表達水平明顯增強（P＜0.05）。因此可以推測，機體對高原低氧環境的適應機制可能是通過提高Mb在體內的含量，減慢其轉變為高鐵肌紅蛋白的速度，從而進一步促進Mb與氧的結合來保證滿足機體在低氧條件下對氧氣的需求而實現的。

高原低氧環境使機體面臨的最大挑戰是缺氧。在缺氧條件下，機體要維持正常的生命活動，必須需要ATP來為其提供能量。在這種特殊的環境下，機體只能通過糖酵解來產生ATP。在糖酵解反應中，LDH是進入第二反應階段的很重要的酶，PFK則是糖酵解反應中最為關鍵的一個酶。而LDH活性大小與細胞內氧分壓的高低密切相關。PFK是糖酵解第一反應階段最主要的限速酶。在高原低氧環境下，機體相對的ATP不足，ADP過剩，ADP是PFK的變構激活劑，能夠增強PFK的活性，從而加速糖酵解。王氏[6]研究發現，在高原低氧環境下，與平原組對照，世居高原者LDH活性增強；王氏等[7]研究也發現，無氧組PFK活性隨運動時間的延長均逐步增強。本研究結果顯示，與正常對照組比較，高原低壓低氧小鼠PFK和LDH活性增強。因此，可以推測出，在高原低氧環境下，機體主要通過增強糖酵解途徑來維持機體的正常生命活動。

腦髓是腦功能活動的物質基礎，而能量維持腦功能的實現是首要條件。ATP是機體內主要能量的直接供給者，其主要功能是維持細胞膜電位、維持細胞膜的完整性、參與細胞的各種代謝，而Na+-K+-ATP酶是一種大分子蛋白，具有ATP酶的活性，當胞內高Na+或胞外高K+增加時被激活，它在維持細胞內外離子交換的過程中具有不可替代的作用，并且它可作為判定代謝紊亂及組織損傷恢復能力的可靠指標之一。馬氏等[8]研究發現，與正常對照組比較，模擬海拔5000 m減壓缺氧6 h后，隨著心肌細胞和腦細胞內ATP含量的大幅度下降，存在于心肌和腦細胞膜上的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性也顯著下降。本研究結果表明，與正常對照組比較，高原低壓低氧小鼠腦組織Na+-K+-ATP酶顯著下降（P＜0.01）。因此，在高原低氧環境下，機體處于相對ATP不足的狀態，導致機體組織發生損傷，從而嚴重影響Na+-K+-ATP酶的活性。

HIF-1是在缺血低氧的刺激下，廣泛分布于機體組織的一種核轉錄因子。HIF-1主要由α亞基和β亞基構成的二聚體蛋白質，其中，HIF-1α的激活是缺氧反應的重要標志，也是腦組織缺氧反應的重要信號，無論是在全身缺氧或腦局灶性缺血時，腦組織中都發現有HIF-1α的激活。AQP是一組與水通透有關的細胞膜轉運蛋白，在腦水腫的病理生理中發揮著重要作用。AQP-4主要分布在腦組織，具有選擇性轉運水的功能。AQP-1是Aquaporin家族的另一成員，主要分布在血管、腎臟遠曲小管、眼、耳及腦，其作用是選擇性通透水分子。本實驗結果表明，與正常對照組比較，高原低壓低氧模型小鼠腦組織HIF-1α mRNA和蛋白表達均增強，AQP-4 mRNA表達和AQP-1蛋白表達均增強。由此推測，機體對高原低氧環境的適應是通過增強HIF-1α來實現的，同時高原低氧環境可能使機體啟動了內源性保護機制。

綜上所述，模擬高原低壓低氧環境復制氣虛小鼠模型，腎組織、骨骼肌組織、腦組織均發生了陰陽上下升降互濟的適應性反應，其適應高原低氧環境的可能機制是：在低氧狀態下，機體可以促進HIF-1α表達增加，后者又進一步調控糖酵解酶、其他酶類、EPO及Mb等諸多參與氧代謝的下游靶基因轉錄，進一步增強機體對缺氧的耐受力，以保持機體內的氧平衡狀態。

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[2] 竇娟娟,駱文郁,劉永琦.補腎益髓中藥血清孵育骨髓間充質干細胞移植防治缺血性腦血管病的理論探討[J].時珍國醫國藥,2011,22(3)：562-563.

[3] 安方玉,劉永琦,駱亞莉,等.當歸不同有效部位對高原低氧模型小鼠免疫功能的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2015,22(2)：51-54.

[4] 徐瑜,柳君澤,夏琛.棕櫚酸對模擬高原低氧大鼠離體腦線粒體解耦聯蛋白活性及質子漏的影響[J].生理學報,2008,60(1)：59-64.

[5] 李慶芬.人與動物呼吸系統對高海拔低氧的適應[J].生物學通報, 1991,26(10)：19.

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Study on Molecular Mechanism of Reactive Changes in Kidney, Skeleton and Brain of Mice Models in High Altitude Hypoxia Environment

AN Fang-yu1, LUO Ya-li1, LIU Yong-qi1,2, LI Ying-dong1,2,

LIU Xue-song1, SHI Xu-feng3, GAO Zhuo-yue1,2(1. Provincial-Level Key Laboratory for Molecular Medicine of Major Diseases and Study on Prevention and Treatment of Traditional Chinese Medicine, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory of Dunhuang Medicine and Transformation of Ministry of Education and Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 3. Clinical College of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Objective To observe the molecular mechanism of adaptive response of the kidney and skeleton and brain issues in the high altitude hypoxia; To discuss the unity of yin and yang oscillation relationship of kidney and brain marrow. Methods SPF KM mice were randomly divided into control group and model group according to random number table method. Mice in the model group were exposed to high altitude hypoxia cabin for successive 21 d. On the 22nd day, mice got out of the cabin and their body weight was measured, and then they were put to death through eyeball blood sampling. The activities of lactic LDH and Na+-K+-ATPase in brain tissue were detected by spectrophotometric colorimetry. The PFK activities of brain and skeletal muscle were detected by ELISA. Meanwhile the contents of EPO and EPOR in the kidney were measured by ELISA. The mRNA expressions of HIF-1α and AQP-4 in brain were assessed by RT-PCR. At the same time, the protein expressions of HIF-1α and AQP-1 in brain and the protein expression of Mb in skeletal muscle were detected by Western blot. Results Compared with the normal group, the LDH and PFK in brain tissue and the content of EPO in kidney tissue were all raised in the modelgroup(P<0.05). Meanwhile the mRNA expressions of HIF-1α and AQP-4 and the protein expressions of HIF-1α and AQP-1 in brain were all increased in the mice from the model group; the activities of PFK and the protein expression of Mb in skeletal muscle were also raised in the model group. But the activity of Na+-K+-ATPase in brain tissue and the content of EPOR in kidney tissue both decreased in the model group (P<0.05, P<0.01). Conclusion Adaptive response and the unity of yin and yang oscillation relationship between kidney, skeleton and brain tissue happen in high altitude hypoxia.

high altitude hypoxia; molecular mechanism; kidney; skeleton; brain; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.014

R228

A

1005-5304(2016)01-0060-05

2015-05-27）

（

2015-10-19；編輯：華強）

甘肅省科技支撐計劃（1204FKCA169）；國家科技支撐計劃（2011BAI05B02）

劉永琦，E-mail：liuyongqi73@163.com