牛筋草對百草枯抗性水平初探

沈雪峰，胡 芳，陳 勇，李穎慧，韓承疇

(華南農業大學雜草研究室，廣東 廣州 510642)

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牛筋草對百草枯抗性水平初探

沈雪峰，胡 芳，陳 勇*，李穎慧，韓承疇

(華南農業大學雜草研究室，廣東 廣州 510642)

為探討牛筋草Eleusineindica(L.) Gaertn對百草枯的抗性水平，測定了百草枯對抗性和敏感生物型牛筋草的抗性水平、葉綠素熒光參數和抗性基因的擴增。結果表明，百草枯對抗性和敏感生物型牛筋草地上部鮮重抑制中濃度(ED50)分別為0.1029和6.1120 kg/hm2，抗性和敏感生物型ED50的比值為59.48；經1 kg/hm2百草枯處理牛筋草3 h后，抗性生物型葉綠素熒光參數逐漸恢復，敏感生物型逐漸降低，而0.1 μmol/L硝酸鹽+1 kg/hm2百草枯處理的抗性生物型未出現恢復現象。推測轉運體參與了百草枯在抗性生物型牛筋草體內的轉運。經特異性引物，抗性生物型獲得擴增片段1021 bp，而敏感生物型未能獲得。經BLAST比對，該EST片段的核苷酸序列與高粱假設蛋白的同源性為96 %，該蛋白序列來源于氨基酸陽離子轉運體，與玉米的氨基酸陽離子轉運體基因高度相似片段為96 %。

牛筋草；百草枯；抗性水平；轉運體；葉綠素熒光

牛筋草(EleusineindicaL.)屬禾本科屬1年生草本植物，多生于較濕潤的農田、果園或路旁，廣布世界各地，已被列為世界十大惡性雜草之一，危害非常嚴重[1-2]。百草枯(1,1-二甲基-4,4-二氯聯吡啶化合物，paraquat)屬于典型的光合系統I抑制劑類除草劑[3]，已被廣泛用于防除田間、果園和荒地等一年生或多年生雜草，目前我國已成為全球百草枯生產和使用的第一大國[4]。自1980年在臺灣省發現第一例抗百草枯的蘇門白酒草(Conyzasumatrensis)以來[5]，世界范圍內抗百草枯的雜草生物型不斷出現[6]。經調查發現[2]，我國華南地區許多長期使用百草枯的果園，百草枯對牛筋草的防除效果已經很差，給當地的果園管理帶來極大不便。2010年，在馬來西亞連續使用多年的百草枯對果園牛筋草的防除效果很不理想，進一步的研究發現其GR50是敏感性的3.6倍[1]。百草枯的抗性機制十分復雜，包括抑制轉運、隔離到液胞、增強氧自由基清除酶的活性等。Szigeti[7]在擬南芥基因組中分離到一個類似大腸桿菌PotE轉運體的同源基因AtPotE，能被百草枯誘導，其表達豐度在抗性植株中較敏感植物中的高，可能定位在液泡中。Jori et al.[8]等通過比較百草枯處理后抗性和敏感生物型加拿大飛蓬(ConyzacanadensisL. Cronq)mRNA表達的差異，發現兩條僅在抗性生物型中表達的EST片段，分別與EmrE，氨基端陽離子轉運體(CAT4)的氨基酸同源性在98 %，表明轉運體可能參與了細胞內百草枯的運輸。目前國內尚未見有關百草枯抗性生物型牛筋草的研究報道。本研究旨在探索牛筋草對百草枯的抗藥性水平，明確抗藥性生物型和敏感生物型牛筋草受百草枯和轉運體抑制劑處理后，植株內部葉綠素熒光參數的變化，通過轉運體特異性引物擴增，研究抗性和敏感牛筋草中轉運體的基因表達，從而為延緩抗藥性雜草的發展、治理抗性雜草提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 藥劑 42 %的百草枯(paraquat)母液，湖北仙隆化工股份有限公司。

1.1.2 雜草種子 牛筋草(EleusineindicaL.)抗藥性生物型(R)和敏感生物型(S)，分別于2006年5月采自廣州市番禺區大崗鎮柑橘園(該區百草枯已連續使用20年)和華南農業大學農場荒地(從未使用過除草劑)。

1.1.3 主要儀器 3WP-2000型行走式噴霧塔，農業部南京農業機械化研究所研制生產；PAM-2500葉綠素熒光儀，德國WALZ公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同牛筋草種群對百草枯敏感性水平測定 采用溫室盆栽法培養。將去殼的種子播種于盛有營養土的花盆(d=9 cm)中，每盆10粒，10次重復，置于30±2 ℃，光照強度為800 μE·m-2s-1，相對濕度為80 %的溫室中培養，定期澆水。4次重復。

待幼苗長至6～7葉期，采用生測噴霧塔進行莖葉噴霧，測定R和S型牛筋草對百草枯的敏感性。噴頭孔徑0.3 mm，噴霧壓力0.3 MPa，霧滴直徑100 μm，噴頭流量90 mL·min-1。噴施劑量依次為0、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8 kg a.i. hm-2。以清水為對照，4次重復。噴藥7 d后，統計死亡率并稱取地上部鮮重。數據采用SPSS 18.0軟件進行處理，以植株抑制率的幾率值(Y)和百草枯濃度的對數值(x)建立回歸方程，計算ED50。

1.2.2 抗性和敏感牛筋草葉綠素熒光參數的測定 幼苗培養方式同1.2.1節。待植株長至分蘗期隨機分成2組，其中一組噴藥濃度為1 kg a.i. hm-2；另一組經轉運體抑制劑(0.1 μmol·L-1KNO3)處理1 h后，也同樣噴施1 kg a.i. hm-2的百草枯，之后每隔1 h使用0.1 μmol·L-1的KNO3處理1次。分別于噴施百草枯后0、1、2、3、4、5、6、12、24和48 h分別測定R和S型牛筋草葉片葉綠素熒光參數[9]。各測定10株，每植株測10個葉片，每隔1 h記錄PSII原初光能轉化效率(Fv/Fm)值，重復5次。

1.2.3 抗性和敏感牛筋草抗性基因擴增 利用Multalin軟件，對水稻、小麥、大麥、玉米等多種植物品系的20條CAT4核苷酸序列進行比對，根據保守區域進行兼并引物設計引物為F(5’-AAGGKRTTGCCTGGTTGA-3’)，R(5’-GGAGGKACATATCTRAG TA-3’)。PCR總反應體系為50 μl，其中，包括DNA模板2 μl，5×PCR Buffer 5 μl，下游特異性PCR引物2 μl，上游特異性PCR引物2 μl，TaKaRa ExTaq?0.5 μl，Mg2+3 μl，ddH2O 35.5 μl。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1.5 min，33個循環；72 ℃后延伸7 min。利用含有EB的1 %的瓊脂糖凝膠檢測擴增結果，Gel Doc 2000凝膠成像系統觀察。

2 結果分析

2.1 抗性和敏感生物型牛筋草對百草枯的敏感性差異

由表1可知，百草枯對牛筋草R、S生物型存活率的抑制中濃度ED50值分別為6.1120和0.1029 kg/hm2，抗性與敏感生物型的ED50比值為59.48。該結果表明牛筋草抗性生物型對百草枯的敏感性明顯降低，抗藥程度高。

2.2 抗性和敏感生物型牛筋草葉片熒光參數變化

由圖1 a可知，經1 kg/hm2百草枯莖葉處理后，R生物型牛筋草的Fv/Fm值呈單峰曲線，峰谷出現在藥后3 h，隨后呈現上升，趨于平穩；而S生物型牛筋草的Fv/Fm值呈下降趨勢，且在百草枯處理48 h后，Fv/Fm值急劇下降至0。經硝酸鹽+百草枯處理后，R和S生物型牛筋的Fv/Fm值表現相似，均呈現下降趨勢(圖1 b)，說明硝酸鹽抑制了R生物型牛筋草活性。

表1 牛筋草抗性和敏感生物型對百草枯的敏感性差異

a：1 kg/hm2百草枯處理R和S生物型牛筋草；b：1 kg/hm2百草枯和0.1 μmol/L硝酸鹽處理R和S生物型牛筋草a: Resistant and susceptible biotypes of E. indica treated by 1 kg/hm2 paraquat; b: Resistant and susceptible biotypes of E. indica treated by 0.1 μmol/L nitrates and 1 kg/hm2 paraquat圖1 百草枯和硝酸鹽對R和S生物型牛筋草葉片Fv/Fm值的影響Fig.1 The change trend of Fv/Fm value in resistant/susceptible E. indica after paraquat and nitrates treatment

2.3 抗性和敏感生物型牛筋草總DNA擴增與序列分析

通過保守區域設計兼并引物，分別對R和S生物型牛筋草總DNA進行擴增，結果從R生物型牛筋草中擴增到1條1021 bp的核苷酸片段，在S生物型牛筋草中未得到該片段(圖2)。經BLAST比對，顯示與高粱假設蛋白(Sorghumbicolorhypothetical protein)同源性為96 %，與玉米LOC100285193基因(ZeamaysLOC100285193)，全長cDNA克隆玉米mRNA(Zeamaysfull-length cDNA clone ZM_BFb0068I04 mRNA)同源性均為95 %，與短柄草LOC100846653基因(BrachypodiumdistachyonLOC100846653)同源性為94 %，而上述序列均與轉運體有關。同時，對PCR產物測序結果進行序列分析，結果表明，該序列部分片段與玉米、二穗短柄草、擬南芥酸陽離子轉運體等基因片段同源。

3 結論與討論

百草枯的主要作用部位是植物葉綠體光系統PSⅠ的光合膜系統，其作用機理是與光系統PSⅠ中的電子受體競爭，捕獲電子傳遞鏈中的電子，抑制正常的電子傳遞，同時產生過氧化物和自由基，破壞質膜、蛋白質、核酸等結構而造成植物死亡[3, 10]。本研究結果證實，取自于華南農業大學農場荒地的S生物型及R生物型牛筋草的ED50值分別為0.1029和6.1120 kg/hm2已經遠高于百草枯的推薦劑量0.600 kg/hm2；與S生物型牛筋草相比，R生物型牛筋草的相對抗性水平達到59.48倍。這與Seng et al.[1]對馬來西亞R生物型牛筋草研究的結果相似。

(S1～S4: S生物型牛筋草，M: DL2000 DNA Marker，R1～R4: R生物型牛筋草)S1-S4: Susceptible biotypes, M: DL2000 DNA Marker, R1-R4: Resistant biotypes圖2 抗性和敏感生物型牛筋草DNA擴增產物Fig.2 DNA-blot analysis of paraquat-sensitive and -resistant E.indica individuals

近年來，Fv/Fm反映了PSⅡ反應中心的原初光能轉換效率[9]，被用來研究植物對逆境響應，是光合作用光抑制的顯著特征，作為判斷是否發生光抑制的標準[11]。在脅迫條件下，Fv/Fm值會顯著降低[12]。本研究發現，隨著百草枯處理時間的延長，S生物型牛筋草PSⅡ活性中心受損逐漸加重，Fv/Fm呈快速下降趨勢，說明百草枯對S生物型牛筋草產生了不可逆的脅迫作用，植株受到嚴重的光抑制，光合系統嚴重受損，光合作用受阻，敏感牛筋草最終死亡，而R生物型牛筋草經百草枯處理后，Fv/Fm呈現單峰曲線，表現為先降低后升高，之后趨于平穩，說明其光合系統受到影響較小，對光能的利用效率始終保持穩定，葉片PSⅡ的潛在活性和原初光能轉化效率都很高，進一步說明抗性牛筋草PSⅡ活性中心未受損，植株能夠正常地進行電子傳遞及光合作用，說明葉綠體機能復活，而葉綠體機能活性恢復過程是由于百草枯被轉運到代謝不活躍的細胞區間造成的[10, 13]。

前人[14]研究報道：用真核生物蛋白活性抑制劑放線菌酮(Cycloheximide)和百草枯同時處理加拿大萵苣百草枯抗性植株被破壞；而單獨使用放線菌酮并不能使植物致死。表明百草枯能夠進入植株葉綠體中，并進行瞬時的功能抑制，推測存在某類其活性能被放線菌酮抑制的百草枯誘導蛋白，其功能是攜帶百草枯并將其隔離而解毒。本研究發現，經0.1 μmol/L硝酸鹽+1 kg/hm2百草枯處理后，R和S生物型牛筋的Fv/Fm值均呈現下降趨勢，說明硝酸鹽抑制了R生物型牛筋草活性。這表明硝酸鉀抑制了位于質膜上ATPases的作用，使轉運體失去了來自質膜兩側的質子濃度梯度提供的能量，無法完成百草枯的轉運過程，使抗性牛筋草失去功能活性恢復過程，表現出與敏感牛筋草相同的現象。

Su et al.[15]等在百草枯抗性植物中還檢測到一個與氨基端陽離子轉運體CAT4同源的EST片段，它與定位于膜的H+-ATP酶亞基同源。選擇性轉運體抑制/恢復試驗發現，擬南芥氨基酸轉運CAT4，參與百草枯和其它毒性化合物的脅迫應答[16]，使用不同的轉運體抑制劑處理百草枯抗性萵苣也觀察到了同樣的現象[17]。本研究選用特異性引物分別對R和S生物型牛筋草進行目的片段擴增，在R生物型牛筋草中擴增得到氨基端陽離子轉運體同源序列片段，且其EST片段的核苷酸序列與高粱假設蛋白同源性為96 %，該蛋白序列來源于氨基酸陽離子轉運體，與玉米的氨基酸陽離子轉運體基因高度相似片段的相似性為96 %。

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(責任編輯 李山云)

Preliminary Study on Resistance Level ofEleusineindicato Paraquat

SHEN Xue-feng, HU Fang, CHEN Yong*, LI Ying-hui, HAN Cheng-chou

(Weed Research Laboratory, South China Agricultural University, Guangdong Guangzhou 510642, China)

To investigate the resistance level ofEleusineindicato paraquat, the susceptible level ofEleusineindicato paraquat, values ofFv/Fmand amplification of resistance genes was conducted. The results showed that the paraquat concentration causing 50 % inhibition of survival rate (ED50) in resistant (R) and susceptible (S) biotypes ofE.indicawas 0.1029 and 6.1120 kg/hm2, and the relative resistance index [ED50(R) / ED50(S)] was 59.48. The values ofFv/Fmwas recovered in R biotype, but decreased with time in S biotype 3 h after spraying paraquat. However, it wasn’t recovered in R biotype after treating with 0.1 μmol/L nitrate + 1 kg/hm2paraquat. It was speculated that the paraquat was transported in R biotype by transporter. Provided primers specific to the PCR template sequence, the DNA of 1021 bp gets from R biotype, but S biotype was not. The nucleotide sequence of EST fragments was 96 % homologous toSorghumbicolorhypothetical protein with BLAST. Protein sequence alignments was 96 % homologous toZeamaysgene of transporter revealed one amino acid position, where organic cation transporters.

Eleusineindica; Paraquat; Resistance level; Transporter; Chlorophyll fluorescence

1001-4829(2016)08-1875-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.021

2015-10-22

國家自然科學基金資助項目(31272054，31471788)；公益性行業(農業)科研專項(201303031)

沈雪峰(1982-)，男，河南商丘人，講師，主要從事作物栽培與生理研究，E-mail: xuefengshen@126.com，*為通訊作者。

S451.1

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