鮑魚內臟內源蛋白酶特性的研究

李梅娟,劉 丹,賈 真,陳小藝,方 婷,陳錦權

(福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

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鮑魚內臟內源蛋白酶特性的研究

李梅娟,劉 丹,賈 真,陳小藝,方 婷,陳錦權*

(福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

本文研究了鮑魚內臟內源蛋白酶(內源酶)的性質。分別探討了pH、溫度、金屬離子和特異性蛋白酶抑制劑對內源酶活性的影響。結果表明內源酶蛋白質含量為125.10 mg/mL。鈉離子在濃度(0～1.36 mol/L)范圍明顯促進內源酶活性,鈣離子有穩定酶活作用,對酶活無顯著影響,而高濃度的鈉離子,銅離子和鋅離子會抑制酶活。內源酶在最適pH4左右和pH7左右,有較高的酶活和很好的熱穩定性,且能被胃蛋白酶抑制劑(Pepstain)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)、胰蛋白酶抑制劑(SBTI)和胰凝乳蛋白酶抑制劑(TPCK)抑制。本研究可為縮短傳統制作鮑魚醬油發酵時間提供理論依據。

鮑魚內臟,內源性蛋白酶,酶活性,相對分子量

鮑魚(Abalone),屬于軟體動物,鮑螺科鮑屬,由于其較高的商業價值,在全世界范圍內有大量養殖[1-2]。中國傳統的珍貴海味有“鮑、參、翅、肚”,然而鮑位于榜首,其肉質柔嫩細滑、鮮而不膩、滋味濃郁,深受全世界人們的喜愛。鮑魚不單是一種名貴的食材,還有著豐富的藥用價值[3]。鮑魚內臟內源蛋白酶主要指內臟消化系統中的酶,大部分為蛋白酶(催化蛋白質水解的酶類的總稱,包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、組織蛋白酶等)。現階段蛋白酶酶學性質的研究內容主要是:酶的活力與溫度、pH、酶濃度、底物濃度、酶激活劑和激活方法、酶抑制劑的關系;蛋白酶的相對分子大小[4]等。研究發現,影響內源酶活性的因素主要有pH、溫度、金屬離子,其中常見的金屬離子激活劑有Na+、Zn2+、Ca2+、Cu2+。目前,常用特異性抑制劑確定蛋白酶的種類,最為常見的抑制劑有胰蛋白酶抑制劑(TLCK、SBTI等),胰凝乳蛋白酶抑制劑(TPCK等),胃蛋白酶抑制劑(Pepstain等),金屬蛋白酶抑制劑(EDTA等)[5]。國內對鮑魚內臟內源蛋白酶特性的研究目前甚少,主要集中在研究鮑魚內臟消化系統中酶的種類[6-8]。

自溶[9]是指當機體受到物理因素(如熱、輻射)、化學因素(如強酸、強堿、有毒物質)和生物因素(如病原體)等環境因素的刺激后,誘發自身酶系將自身的組織結構破壞、降解從而引起自身死亡的現象。在進行自溶水解工藝條件優化時,要根據原料內源酶的特點,合理地利用促進內源酶活力的因素[10]。因此,研究并合理利用內源酶的特性,選擇鮑魚內臟最佳的自溶水解條件,不僅能夠縮短傳統醬油發酵過程中自溶時間,而且可以減少發酵成本。同時,該研究充分利用了鮑魚內臟的資源,提高了其產品附加值,對擴大我國居民相對缺乏的動物蛋白來源具有重大意義。因此,筆者探究了pH、溫度和不同濃度的Na+,Cu2+,Ca2+,Zn2+對內源酶活性的影響,使用 PMSF,Pepstain,SBTI,TPCK 和 EDTA 來探究內源酶的特性,為加速鮑魚內臟自溶水解和縮短傳統鮑魚醬油發酵時間提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮑魚內臟 由福建省漳州市詔安海聯食品食品有限公司提供;三羥甲基氨基甲烷(Tris),牛血清白蛋白(BSA)蛋白質標準液,裂解液(Urea,Thiaurea,DTT,CHAPS,carrier amphoLytes),考馬斯亮藍 G-250,血紅蛋白,偶氮酪蛋白(Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽BApNA),絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)、胰蛋白酶抑制劑(SBTI)、胰凝乳蛋白酶抑制劑(TPCK),丙烯酰胺,十二烷基硫酸鈉(SDS),高氯酸銨(AP),四甲基乙二胺(TEMED) 均購自上海國藥集團化學試劑有限公司；胃蛋白酶抑制劑 Sigma公司；其他試劑均為分析純及以上級別。

高速臺式冷凍離心機(TGL-16M) 長沙湘儀離心機儀器有限公司;組織搗碎勻漿機、磁力攪拌器 上海精密儀器設備有限公司;Sartorius BS110S Max 110 g電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;精密酸度計 上海精密儀器設備有限公司;分光光度計 上海圣科儀器設備有限公司;恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;電泳儀 深圳賽泰克生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 內源酶液的制備及蛋白質含量的測定 經冷凍的鮑魚內臟,以1∶1(w/w)加入pH為8.0的50 mmol/L Tris-HCL 緩沖液;高速勻漿后,低溫浸提過夜;10500 r/min 離心10 min 后取上清液,并于-30 ℃保存;所有操作未經特殊說明,均在4 ℃下進行。采用Bradford法[10]測定鮑魚內臟內源酶液(以下簡稱:內源酶液)中蛋白質的含量。

1.2.2 酶活力測定方法 酶活力(enzyme activity)也稱為酶活性,是指酶催化一定化學反應的能力。酶活力的大小可用在一定條件下,酶催化某一化學反應的速度來表示,酶催化反應速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。蛋白酶活性是指在一定pH(pH3.6或pH7.0)和40 ℃溫度條件下,每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸定義為一個蛋白酶活力單位。采用福林酚法測定各組酶活[10]。

1.2.2.1 pH對內源酶活力的影響 先將 2% 酪蛋白溶液與內源酶液分別于40 ℃下保溫3 min,確保內源酶液有高酶活;在1～11號試管中分別加入緩沖液1 mL(pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12),再依次加入保溫好的2%酪蛋白溶液與內源酶液各1 mL;震蕩搖勻,置于40 ℃ 水浴中處理1 h后,快速加入2 mL三氯乙酸(0.4 mol/L),終止內源酶水解反應。并將各酶解液置于4000 r/min條件下,離心10 min,各取1 mL上清液,分別加入5 mL碳酸鈉(0.4 mol/L)和1 mL福林-酚試劑,搖勻;靜置20 min后,于360 nm下分別測定其吸光度。重復操作三次。

1.2.2.2 溫度對內源酶活力的影響 測定方法同1.2.2.1 pH對內源酶活力的影響,其中不同之處為:加入內源酶液的緩沖液 pH分別為4、7.5、8,在每個pH下,水浴處理分別為4、30、40、50、60、65、70 ℃,以研究最適pH下內源酶的熱穩定性。結果用百分數表示,以各相應pH下50 ℃的酶活力為100%。相對酶活的公式(1)如下:

式(1)

1.2.2.3 金屬離子對內源酶活力的影響 在正常的緩沖體系中加入一定量的金屬離子,使Na+終濃度為0.000、0.680、1.360、2.040 mol/L,Cu2+的終濃度為0.000、0.006、0.008、0.012 mol/L,Ca2+的終濃度為0.000、0.020、0.040、0.060 mol/L 和Zn2+的終濃度為0.000、0.005、0.010、0.01 mol/L[11];將以上四種金屬離子配成不同濃度的鹽酸鹽溶液,在40 ℃時將鹽酸鹽溶液加入到內源酶液中,以未添加金屬離子的內源酶液為對照組,采用福林酚法測定各組酶活[10],并以相對酶活力來考察各金屬離子對內源酶活性的影響,其中相對酶活力的計算公式(2)如下:

式(2)

1.2.3 胃蛋白酶活性的測定 取5 μL內源酶液加入到含有0.5%血紅蛋白的0.1 mol/L Gly-HCl(pH2.0)緩沖液中,置于25 ℃水浴中孵育30 min后,加入濃度為12% 的三氯醋酸溶液 0.5 mL,震蕩搖勻后,3000 r/min 離心15 min,取1 mL上清液,于280 nm下測定其吸光度值。重復測定三次,取平均值。通過公式(3)計算內源酶液中胃蛋白酶活力[12]:

活力(units/mg)=(Abs280/min)×反應混合體積(mL)/0.051×反應時間(min)×蛋白質含量(mg)

式(3)

1.2.4 胰蛋白酶活性的測定 取25 μL內源酶液加入到1.25 mL 新鮮配制的1 mmol/L BApNA(在含有20 mmol/L的CaCl2的50 mmol/L Tris-HCL緩沖液(pH7.5)中溶解),置于37 ℃水浴中孵育10 min后,加入30%醋酸1 mL終止反應,置于3000 r/min條件下離心15 min,取上清液并于410 nm條件下測定其吸光值。重復操作三次,取平均值,并根據公式(1～4)計算內源酶液中胰蛋白酶的活力[12]。

活力(units/mg)=(Abs410/min)×1000×反應混合體積(mL)/8800×蛋白質含量(mg)

式(4)

1.2.5 胰凝乳蛋白酶活性的測定 取10 μL內源酶液加入到750 μL新鮮配制的0.1 mmol/L SAPNA(以含有20 mmol/L CaCl2,pH為7.5的Tris-HCL為緩沖液)中[12];在30 ℃,410 nm下記錄3 min內的吸光值,計算公式同1.2.4。

1.2.6 抑制劑對內源酶活性的影響 參考Serviere-Zaragoza[13]選用蛋白酶特異性抑制劑確定內源酶液中所含酶的種類。本實驗所選用的抑制劑有:0.5 mmol/L PMSF(絲氨酸蛋白酶抑制劑)、0.001 mmol/L Pepstain(胃蛋白酶抑制劑)、0.1 g/L SBTI(胰蛋白酶抑制劑)、5 mmol/L TPCK(胰凝乳蛋白酶抑制劑)及10 mmol/L EDTA(金屬蛋白酶抑制劑)。具體操作步驟如下:內源酶液分別與各特異性抑制劑以1∶1(v∶v)混合,以 2% 的酪蛋白溶液為底物,分別將10 mL混合液加入到選擇性緩沖液(pH為2～12)中進行,并均置于26 ℃條件下水浴1 h,而后均加入12%的三氯醋酸終止各反應,隨后將各反應液在4000 r/min條件下,離心10 min,各取1 mL上清液,分別加入5 mL碳酸鈉(0.4 mol/L)和1 mL福林-酚試劑,搖勻;靜置20 min后,于360 nm下分別測定其吸光度。并通過式(1)～式(5)計算各抑制劑對酶活性的抑制效果:

抑制率(%)=不含抑制劑的酶活-含抑制劑的酶活/不含抑制劑的酶活×100

式(5)

2 結果與討論

2.1 內源酶中蛋白質的含量

繪制標準曲線如圖1所示,并可得到標準蛋白質曲線:y=29.3x-0.0053,相關系數為0.9947,式中y:吸光值(OD值);x:蛋白質標準含量(mg/mL)。采用Bradford法,將實驗實際測定的稀釋后內源酶液的吸光值,并將吸光度值帶入標準曲線進行換算,可得內源酶液中蛋白質的含量為:125.10 mg/mL。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve

2.2 pH對內源酶活性的影響

不同pH條件下對內源酶活性的影響,如圖2所示。內源酶顯示了兩個活性高峰,分別在pH4左右和pH7左右。E. Serviere-Zaragoza[13]等人在墨西哥藍色鮑魚的肝胰腺中發現,在pH為2～5的范圍內蛋白酶活力很強;而且pH7.5時,雌性鮑魚腸中的胰凝乳蛋白酶活力增加到238%。同時,以1%偶氮酪蛋白和2%酸性血紅蛋白為底物測定pH對墨西哥綠色鮑魚蛋白酶活力的影響,結果表明在酸性pH范圍(pH為2～4)有蛋白酶活力高峰。這與本實驗的pH4左右以及pH7左右出現蛋白酶活力高峰是相似的。

圖2 pH對內源酶活性的影響Fig.2 Effect of pH on the endogenous protease activity

2.3 溫度對內源酶活性的影響

圖3表明:當pH為4時,溫度在4～50 ℃范圍內,相對酶活力隨著溫度的增大而增大,50 ℃的蛋白酶活力最高(100%);在50～60 ℃蛋白酶活力仍較強,而當溫度超過60 ℃后,相對酶活力急速下降,在70 ℃時相對酶活力降至1.5%。由此可知,在pH為4時內源酶的熱穩定性較好。當pH為7.5時,溫度在4～40 ℃范圍內,相對酶活力隨著溫度的增大而增大,當溫度為40 ℃時,相對酶活力達到最大(118.6%);在40～50 ℃蛋白酶活力仍較強,然而當溫度超過50 ℃,其相對酶活力急速下降,在70 ℃時相對酶活力降至3.4%。因此,在pH為7.5時內源酶的熱穩定性較好。當pH為8時,溫度在4～60 ℃范圍內,相對酶活力隨著溫度的增大而增大;最大相對酶活力為121.0%(60 ℃),當溫度超過65 ℃后,其相對酶活力急速下降,70 ℃時相對酶活力降至最低(37.6%)。綜上所述,在pH為8時,內源酶的熱穩定性很好;而pH為4和7.5時內源酶的熱穩定性較好。

圖3 溫度對內源酶活性的影響Fig.3 Effects of temperature on the endogenous protease activity

2.4 金屬離子對內源酶活性的影響

不同的金屬離子對蛋白酶活性有促進作用或者抑制作用,且同一種金屬離子在不同的離子濃度下對蛋白酶活力的作用(促進或抑制作用)也不同。從圖4A中可以看出,鈉離子在濃度(0～1.36 mol/L)范圍內對內源酶活性有顯著促進作用(p<0.05),即內源酶活性隨著鈉離子濃度的增加而增加,且當鈉離子濃度為1.36 mol/L時,酶活力最高,為135.1%;而2.04 mol/L鈉離子對內源酶活力有抑制作用。出現該現象的原因可能是由于高濃度的鈉離子形成的高滲透壓作用及離子間的靜電作用破壞了混合內源酶中某些酶的結構,從而導致部分蛋白酶失活,進而使整體內源酶活性降低。圖4B表明鈣離子對內源酶活力具有促進作用但效果不顯著(p>0.05),當鈣離子濃度為0.06 mol/L時,有最大的相對蛋白酶活力108.8%,其原因可能是適當濃度的鈣離子能增加胰蛋白酶等蛋白酶螺旋結構的穩定性,使得蛋白質不易被水解[6]。由圖4C可知,Cu2+和Zn2+對蛋白酶活力均有顯著抑制作用(p<0.05), 并且隨著其濃度的增加,抑制作用增強,其中Cu2+最大濃度(0.012 mol/L)對應的相對蛋白酶活力為83.5%。Zn2+最大濃度(0.015 mol/l)對應的相對蛋白酶活力為68.5%,這是由于鋅離子對混合內源酶中的羧肽酶有抑制作用[13,15]。

表2 抑制劑在不同pH下對內源酶活性的影響(%)

Table 2 Effect of inhibitors on the activity of endogenous proteases(%)

抑制劑內源酶在不同pH下的抑制率pH2pH3pH4pH5pH6pH7pH8pH9pH10pH11pH12PMSF208025303154566587290582651434318Pepstain768827831669581488401322252217SBTI2127323435688786793656614345262TPCK1826328404755846856635263421EDTA00024215320612153240

圖4 屬離子對內源酶活性的影響對內源酶活性的影響(n=3)Fig.4 Metal ions on the endogenous protease activity(n=3)

綜上所述可知,1.36 mol/L的鈉離子對內源酶活力的促進作用較強且低于或高于該濃度酶活性均降低;鈣離子對內源酶活性具有穩定作用,即不同濃度的鈣離子對酶活性影響不顯著;而銅離子和鋅離子對內源酶活力有顯著抑制作用。

2.5 胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活性的比較

表1為內源酶中類胃蛋白酶、類胰蛋白酶、類胰凝乳蛋白酶活力大小,結果表明混合蛋白酶中有類胃蛋白酶、類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶的酶。內源酶中各蛋白酶活力從大到小順序為:胃蛋白酶>胰蛋白酶>胰凝乳蛋白酶,其中胃蛋白酶酶活力最大,從而驗證和解釋了內源酶酶活力最適pH環境為酸性(pH為3～4),且胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶活也相對較高,因而在pH為7～8的中堿性環境中混合內源蛋白酶也具有相對較高的活力。這與E. Serviere-Zaragoza[13]對鮑魚蛋白酶的研究是相似的。

表1 內源酶中特異性蛋白酶的酶活力

Table 1 ProteoLytic activity of specific proteases fromol/Lendogenous protease

底物蛋白酶活力(units/mg)血紅蛋白內源酶中類胃蛋白酶722±001BApNA內源酶中類胰蛋白酶590±003SAPNA內源酶中類胰凝乳蛋白酶527±002

2.6 抑制劑對內源酶活性的影響

不同抑制劑在不同pH環境中對內源酶活性的影響如表2所示,PMSF抑制劑在中堿性(pH為7～9)范圍內對內源酶活力具有顯著抑制作用(p<0.05),且最大抑制率為 90.5%±1.21%(pH8)E. Serviere-Zaragoza[10]等人報道,用PMSF處理后的鮑魚蛋白酶液進行電泳的結果表明,PMSF導致蛋白酶條帶的減少,說明蛋白酶液中至少有一種絲氨酸蛋白酶。Pepstain抑制劑在酸性(pH為2～6)環境下對內源酶活力有顯著影響(p<0.05),當pH為3～4的時,Pepstain對內源酶活力的抑制率大于82.7%,抑制作用最強。SBTI抑制劑在中堿性(pH為7～9)范圍內對內源酶活力的抑制作用較強,最大抑制率79.3%(pH8)。呂英濤[3]等人研究SBTI對鯷魚胰蛋白酶活的影響,發現SBTI對鯷魚胰蛋白酶的抑制作用強烈,抑制率高達90%。TPCK抑制劑在中性和堿性(pH為7～10)條件下對內源酶活力抑制作用較強,其中在 pH8～9 范圍內,其抑制作用最強,抑制率超過66%。EDTA抑制劑在pH7～9 的范圍內對內源酶有微弱的抑制作用,最大抑制率為 20.6%(pH8)。綜上所述,特異性抑制劑對內源酶的最大抑制率從高到低依次是:

PMSF(90.5%)>Pepstain(83.1%)>SBTI(79.3%)>TPCK(68.5%)>EDTA(20.6%),即絲氨酸蛋白酶抑制劑>胃蛋白酶抑制劑>胰蛋白酶抑制劑>胰凝乳蛋白酶抑制劑>金屬蛋白酶抑制劑。由此可以說明,內源酶中可能存在絲氨酸蛋白酶、類胃蛋白酶、類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶。

3 結論

經測定,本實驗所用的內源酶液中蛋白質含量為125.10 mg/mL。并分別研究了pH、溫度、金屬離子及特異性蛋白酶抑制劑對內源酶活力的影響,結果表明:內源酶中至少有三類蛋白酶即類胃蛋白酶、類胰蛋白酶、類胰凝乳蛋白酶;內源酶最適pH為4左右和7左右;當pH為3～4時,內源酶有很高的酶活力和很好的熱穩定性,且能被Pepstain抑制;當pH為7～8時,內源酶有較高的酶活力,且能被PMSF、SBTI、TPCK抑制,其中在pH為8時,內源酶的熱穩定性很好;而pH為4和7.5時內源酶的熱穩定性較好。不同金屬離子對酶活力的影響各異:鈉離子在低濃度范圍內(0～1.36 mol/L)對內源蛋白酶活性有促進作用,鈣離子對內源酶活力沒有顯著影響,而銅離子和鋅離子對蛋白酶活性有抑制作用。

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Characteristics of endogenous proteases from ablone(HaliotisDiscusHannaiIno)viscera

LI Mei-juan,LIU Dan,JIA Zhen,CHEN Xiao-yi,FANG Ting,CHEN Jin-quan*

(Fujian Agriculture and Forestry University,College of Food Science,Fuzhou 350002,China)

Toresearchthecharacteristicsofendogenousproteasesfromabalone(Haliotis Discus Hannai Ino)viscera.TheeffectsofpH,temperature,metalionsandspecificproteaseinhibitorsonendogenousproteasesactivitywereinvestigated.Theresultsshowedthatthecontentofendogenousproteaseswas125.10mg/mL.Theproteaseactivitycouldbeincreasedatlowconcentrations(0～1.36mol/L)ofNa+,andtheactivityofproteasetendedtobestableunderthepresenceofCa2+,however,highconcentrationsofNa+,Cu2+andZn2+significantlyinhibitedtheactivityofprotease.TheoptimumworkingpHofendogenousproteaseswerelocatedatabout4and7atwhichconditionproteaseshowedhighactivityandgoodthermalstability.EndogenousproteasescouldbeinhibitedbyPepstain,PMSF(phenyl-methyl-sulphonyl-fluoride),SBTI(soybeantrypsininhibitor)andTPCK(tosyl-phenylalaninechloromethyl-ketone).Theresearchcanprovidetheoreticalbasisforshorteningthetraditionalfermentationtimeofabalonesauce.

abaloneviscera;endogenousprotease;proteaseactivity;relativemolecularweight

2016-04-27

李梅娟 (1991-)，女，碩士研究生，研究方向：農產品加工及貯藏,E-mail:15392487183@163.com。

*通訊作者:陳錦權(1954-)，男，博士，教授，研究方向：水產加工，非熱力加工技術,E-mail:chenjq6613@163.com。

國家自然科學基金(3140101191);福建省發改委項目:閩發改投資[2014]168號; 福建省高水平大學建設項目(612014043)。

TS254.9

A

1002-0306(2016)19-0081-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.007