不同形態硒、維生素E、紫蘿卜提取物體外抗氧化協同作用研究

鄭時蓮,潘 瑤,張云龍,鄧澤元,李紅艷

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

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不同形態硒、維生素E、紫蘿卜提取物體外抗氧化協同作用研究

鄭時蓮,潘 瑤,張云龍,鄧澤元,李紅艷*

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

本文比較了不同形態硒(包括亞硒酸鈉,SS;L-硒甲基半胱氨酸,L-Se-MSC;富硒酵母,SEY)、維生素E(VE)和紫胡蘿卜提取物(Ant)之間的抗氧化協同作用。分別建立DPPH、Fe3+和ABTS+·三種體外抗氧化模型,繪制清除率曲線,計算各物質的半抑制濃度(IC50)。采用等輻射分析法,根據等效公式計算復配后的理論值(IC50add),將其與實際測量值(IC50 mix)進行比較。結果顯示,SS和L-Se-MSC的體外抗氧化性較弱,而SEY在體外具有較強抗氧化能力。同一模型中,不同復配比例的抗氧化協同效應不同。協同效應最佳的組合比例在DPPH模型中為:VEmix∶Antmix∶SEYmix=4∶1∶1,在Fe3+模型中為:VEmix∶Antmix∶SEYmix=1∶4∶1,在ABTS+·模型中為:VEmix∶Antmix∶SEYmix=1∶1∶1。因此,同一物質在不同模型中的抗氧化效應不同,SEY、VE與Ant聯用具有抗氧化協同作用,但同一組合在不同抗氧化模型中表現出的效應有所不同。

硒,維生素E,紫蘿卜提取物,抗氧化,協同作用

硒(Se)是人和動物體內一種重要的微量元素,在人體內發揮著重要的生物學作用,其存在形式主要有有機硒和無機硒兩種。其中,無機硒亞硒酸鈉(Sodium selenite,SS)中的硒元素在體內作為多種抗氧化酶的活性中心發揮抗氧化作用[1]。有機硒L-硒甲基硒代半胱氨酸(L-Se-methylselenocysteine,L-Se-MSC)是甲基化的硒代半胱氨酸,是一種新型的硒強化劑,外觀為粉末狀或顆粒狀物質[2]。有機硒富硒酵母(Se-enriched yeast,SEY)是在培養酵母的過程中加入無機硒,酵母生長時硒與酵母體內的蛋白質和多糖有機結合轉化為生物硒,從而消除了化學硒對人體的毒副反應和腸胃刺激,使硒能夠更高效、更安全地被人體吸收利用[3]。有機硒、無機硒和VE都有一定的抗氧化能力[4]。維生素E(Vitamin E,VE)又稱生育酚,是一種脂溶性維生素[5]。紫色作物中存在著大量的花色苷,具有強抗氧化作用。據美國《健康》雜志報道[6],紫蘿卜含有高濃度的花色苷,天然的紫蘿卜花青素是有效的抗氧化劑。研究發現兩種或多種有抗氧化功效的因子聯用存在抗氧化協同作用[7]。

等輻射分析法評價抗氧化相互作用的優點在于判斷準確,直觀方便[8]。研究表明,該方法適用于不同藥物之間相互作用的評價,近年來也逐漸用于評價天然產物的抗氧化相互作用。本實驗在Luszczki 等[9]的等輻射法的基礎上略加改進,運用等效公式對復配藥物的相互作用進行定性分析,協同率對復配藥物的協同強弱進行定量分析,研究五種抗氧化物質(SS、L-Se-MSC、SEY、VE和Ant)之間的協同作用。分別建立三種體外抗氧化模型(DPPH法、Fe3+還原法及ABTS+·法),探討不同抗氧化模型之間的差異,研究不同形態硒的抗氧化作用,另外,參照孫玥等[10]的復配方法,研究以不同比例(1∶1∶0、1∶1∶1、1∶1∶4、4∶1∶1、1∶4∶1)與VE、Ant復配后的抗氧化協同能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-硒甲基硒代半胱氨酸(L-Se-MSC) 由江西川奇制藥有限公司提供;亞硒酸鈉(SS) 由國藥集團化學試劑有限公司提供;富硒酵母(SEY) 由安琪酵母股份公司提供;水溶性維生素E(VE) 1,1-二苯基-1-苦味肼基自由基(DPPH) 由美國Sigma公司提供;紫蘿卜提取物(Ant) 由江西國億生物有限公司提供;2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),過硫化鉀 來自廣東西隴化工廠。其他試劑均為分析純。

SP-1900UV紫外可見分光光度計 來自上海光譜儀器有限公司;QL-861渦流混合器 來自太倉科教器材廠;HH-S11電熱恒溫水浴鍋 來自廣州戶瑞明儀器有限公司;AR1140電子分析天平來自奧豪斯儀器有限公司。

1.2 抗氧化模型的建立

根據周瑋婧[11]等方法,加以改善,建立DPPH、Fe3+、ABTS+·三種體外抗氧化模型。

1.2.1 試劑配制 取L-Se-MSC、SS、SEY、VE和Ant所需用量,用蒸餾水溶解成濃度適合(5、10、20、40、60、100、150 μg/mL)的樣品儲備液,冷藏待用。注:VE為脂溶性維生素,先用少量乙醇溶解,再進行后續實驗。

1.2.2 DPPH自由基清除法 DPPH配制成1×10-4mol/L,取2 mL DPPH與等體積不同濃度的受試物混合,充分搖勻。室溫暗光下反應30 min,在517 nm處測定其吸光值,平行三次。

清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)/A0]×100

(式中:A0為對照實驗(蒸餾水水代替樣品溶液)的吸光度;Ai為樣品實驗組的吸光度;Aj為樣品干擾實驗(無水乙醇代替DPPH溶液)的吸光度)。

1.2.3 Fe3+還原法 取2 mL不同溶度的受試物與1 mL PBS(pH6.6)緩沖溶液混合后,加1 mL l%的鐵氰化鉀溶液于50 ℃水浴20 min后迅速冷卻,然后加入1 mL 三氟乙酸(10%),混勻靜置10 min。取2 mL上清液,加入3 mL水后加0.2 mL三氯化鐵(0.1%)溶液,完全顯色后以試劑空白做參比,于700 nm處測定吸光值,吸光值越強,還原能力越強。

1.2.4 ABTS自由基清除法 ABTS儲備液的配制:取5 mL ABTS陽離子,80 μL K2S2O8儲備液用PBS溶液稀釋成工作液,在734 nm處將吸光值調整至0.7±0.02。取4 mL ABTS+·工作液與10 μL不同濃度受試物混合,常溫避光靜置6 min,在734 nm波長處測定吸光度。

清除率(%)=[A0-Ai/A0]×100

(式中:A0為對照實驗(蒸餾水水代替樣品溶液)的吸光度;Ai為樣品實驗吸光度。)

1.2.5 數據處理 本實驗采用IC50值作為評價抗氧化能力大小的指標。協同效果的評價采用等輻射分析法[12]。具體步驟如下:

(1)選擇合適的IC50值。運用Probit回歸分析做各樣品(SS、L-Se-MSC、SEY、Ant和VE)的劑量-效應曲線,求得各物質單獨的IC50值。

(2)采用(1)中相同的方法,求得復配后各組合的IC50 mix。

(3)根據等效公式計算IC50add。

IC50add=IC50A/[P1A+R×(P2B+P3C)]

注:式中:R為A、B、C三種抗氧化劑單獨應用時的效價比,P1為抗氧化劑A在復配組中所占的比例;P2為抗氧化劑B在復配組中所占的比例,P3為抗氧化劑C在復配組中所占的比例。

(4)采用獨立樣本t檢驗來檢驗理論值與實驗值之間的顯著性。

(5)將三種藥物的IC50 mix及95%置信區間分別繪制在三維坐標軸上,兩兩相連成等效相加面,將VEmix∶Antmix∶SEYmix分別為1∶1∶0、1∶1∶1、1∶1∶4、4∶1∶1、1∶4∶1比例測得的IC50 mix標在坐標軸上,點的位置由以下公式決定:

Z=SEYC/SEYS+VEC/VES+AntC/AntS

設SEYC/SEYS,VEC/VES,AntC/AntS是配方中富硒酵母、維生素E和紫蘿卜提取物占各自IC50的分數,當SEYC/SEYS+VEC/VES+AntC/AntS=1時,為加和作用。當SEYC/SEYS+VEC/VES+AntC/AntS>1時為拮抗作用。若當SEYC/SEYS+VEC/VES+AntC/AntS<1時,為協同作用。

協同率:組合的協同率(%)=(抗氧化理論值-抗氧化實驗值)×100/抗氧化理論值。

2 結果與討論

2.1 不同形態硒、維生素E、紫蘿卜提取物在三種模型中抗氧化能力的測定

實驗測定了不同形態硒(L-Se-MSC、SS、SEY)、VE、Ant在三種抗氧化體系(DPPH,Fe3+還原,ABTS+·)中單獨的抗氧化活性。由圖1可知,L-Se-MSC和SS表現出的清除DPPH·、ABTS+·和還原Fe3+的能力都較弱,說明其體外抗氧化活性較低。這可能是由于L-Se-MSC和SS的抗氧化活性主要依賴于細胞膜上的酶,當Se作為體內抗氧化酶活性中心時能夠產生抗氧化效應,在體外不能表現出來[13]。而SEY在生物體內能轉化成大量的生物硒,故能表現出較強的抗氧化效應。因此實驗選用SEY、VE和紫蘿卜提取物作為組合,探究其抗氧化協同作用。

圖1 不同抗氧化劑在三種模型中的抗氧化能力Fig.1 The effects of antioxidants on DPPH,Fe3+,ABTS+· models注:A:清除DPPH自由基能力；B:還原 Fe3+能力；C:清除ABTS+能力。

2.2 富硒酵母、維生素E和紫蘿卜提取物在三種模型中抗氧化能力的測定

由表1可知,不同的模型中,抗氧化物的抗氧化能力是不一樣的,IC50值越大,表示抗氧化能力越弱,IC50值越小,則抗氧化能力越強。在DPPH模型中,VE的IC50值最低,具有最強的抗氧化能力。在Fe3+中,Ant的抗氧化能力最強,在ABTS模型中,SEY的抗氧化能力最強。這可能是由于三種模型的抗氧化方法作用機理不一樣而得到不同的結果。DPPH模型機理是在有機相中自由基接受抗氧化劑的活潑氫或電子而褪色,其抗氧化活性大小與酚羥基官能團的數目、溶劑的極性以及物質在溶劑中的溶解度有關[14]。在DPPH模型中,活性順序為VE>Ant>SEY。這可能是因為VE和Ant都有酚羥基結構,但是Ant為粗提物,花色苷主要成分含量不高,同時花色苷也是水溶性物質,在有機相中的溶解度可能會使得Ant清除DPPH自由基的能力受到一定的限制。在Fe3+模型中,Fe3+在水相中獲得由抗氧化劑提供的電子,進而被還原成Fe2+,測定抗氧化物質基于電子轉移的抗氧化能力。在此實驗中VE和Ant擁有高度電子離域的苯環結構,但是SEY 沒有。因此它們的供電子能力為Ant>VE>SEY。ABTS模型機理是ABTS在適當的氧化劑作用下氧化成ABTS+·,在抗氧化物存在時ABTS+·的產生會被抑制。本實驗結果顯示,抗氧化能力順序為SEY>Ant>VE。研究表明,ABTS法更適用于水溶性抗氧化混合物的測定[15]。有機硒富硒酵母的抗氧化活性可能來自其中的硒蛋白和硒多糖[16],為混合物,而Ant也為混合物只有VE是純物質。綜上所述,抗氧化機理不同,得到不同的實驗結果。因此,要通過不同的實驗模型共同評價抗氧化物的體外抗氧化能力。

表1 富硒酵母、維生素E和紫蘿卜提取物在三種模型中抗氧化效果分析

Table 1 Effects of Se-enriched yeast,Vitamin E and extract from purple carrots on three anti-oxidant models

抗氧化物DPPH·IC50(μg/mL)Fe3+IC50(μg/mL)ABTS+·IC50(μg/mL)SEY4698±076a5128±056a1502±053cVE1035±041c3667±102b9712±090aAnt2275±097b3008±091c3360±068b

注:IC50值通過Probit法進行曲線擬合求得。a,b,c表示不同抗氧化物質種類間的成分及抗氧化活性在0.05 水平上的存在顯著性差異。

2.3 富硒酵母、維生素E、紫蘿卜提取物在3種體外化學模型中協同作用分析

表2 3種抗氧化劑復配后在DPPH模型中協同作用效果分析

Table 2 Synergistic DPPH free radical scavenging activity of three antioxidants

FR(VEmix∶Antmix∶SEYmix)IC50mix±sVEaddAntaddSEYaddIC50add±s相互作用協同率(%)1∶1∶01435d±04051811380001655±038?<11331∶1∶12022c±01634575815662669±041??<12421∶1∶43175a±09917337931323684±064?<11384∶1∶11384d±0756903787831852±031??<12531∶4∶12294b±11217315177822472±042<172

表3 3種抗氧化劑復配后在Fe3+還原模型中協同作用效果分析

Table 3 Synergistic Fe3+reducing power of three antioxidants

FR(VEmix∶Antmix∶SEYmix)IC50mix±sVEaddAntaddSEYaddIC50add±s相互作用協同率(%)1∶1∶03393c±045163415040003138±020?>1-811∶1∶13541b±0801089100317093801±015?<1681∶1∶44081a±02654550134194464±028???<1864∶1∶13468bc±02521785018553534±018?<1191∶4∶13337c±02654420058553405±021<130

表4 3種抗氧化劑復配后在ABTS+·模型中協同作用效果分析

Table 4 Synergistic ABTS free radical scavenging activity of three antioxidants

FR(VEmix∶Antmix∶SEYmix)IC50mix±sVEaddAntaddSEYaddIC50add±s相互作用協同率(%)1∶1∶0583a±012486168000656±020??<11721∶1∶1204c±006324112051487±005???<15811∶1∶4330b±017162056100319±008>1﹣344∶1∶1597a±015647056025729±006???<11811∶4∶1312b±013162224025414±021<1246

注:在表2～表4中,IC50值通過 Probit 法進行曲線擬合求得。表中的單位均為μg/mL,采用one-way ANOVA分析,a、b、c表示在0.05 水平上的有顯著性差異;理論值和實際值采用非配對T檢驗,***p<0.001,**p<0.01,*p<0.05;VEadd、Antadd、SEYadd 為復合配方中單一組分抗氧化劑理論上應該產生的效果;IC50 mix、IC50add分別為實驗值和理論值;FR為配方質量比。

由表2～表4可知,不同比例的復配組合在同一抗氧化模型中存在差異。協同效應最佳的組合比例分別為:VEmix∶Antmix∶SEYmix=4∶1∶1(DPPH模型)、1∶4∶1(Fe3+模型)、1∶1∶1(ABTS+·模型)。同一模型中,以不同比例復配后,相同抗氧化因子的抗氧化協同作用也不同。比如:在DPPH實驗中,5種比例配方的實際產生的抗氧化協同效應低于理論上所產生的抗氧化協同效應。不同比例混合的抗氧化因子的抗氧化活性不同,可能與各混合物中的植物化學物含量的不同有關。例如:阿魏酸、根皮素和維生素E以不同比例混合,其抗氧化相互作用也不同[17]。ABTS模型中,VEmix∶Antmix∶SEYmix為1∶1∶4的IC50 mix值(3.30±0.17)μg/mL,Fe3+還原模型中,VEmix∶Antmix∶SEYmix為1∶1∶0的IC50 mix值(33.93±0.45) μg/mL,兩組的IC50 mix值均大于理論值,表現出抗氧化拮抗作用。ABTS模型中,SEY含量高時表現出拮抗作用,原因可能是抗氧化物AOH與另外的抗氧化物BOH反應生成AOH-BOH,使兩種抗氧化劑的抗氧化活性雙雙降低,導致其從協同作用向拮抗作用轉變,從而表現出拮抗作用。Fe3+還原模型中,當樣品中含有還原電位比Fe3+低的抗氧化成分時,會影響它們的抗氧化相互作用,Ant為混合物,有可能會產生這樣的結果。同時,相同的復配組合在不同模型中存在差異。在DPPH模型中,VE的含量越高,Ant含量越低,其復配后的抗氧化效應越強。這可能是因為VE的烷醇環第六位的羥基是活性基團,該羥基上的活潑氫可以捕獲活性氧自由基,進而能切斷自由基的連鎖反應,表現出較強的抗氧化能力,從圖1中也能得到相同的結論。而在ABTS+·模型中,結果有所不同。

SEY、VE和Ant聯合使用后,具有一定的抗氧化協同作用,且協同作用的強弱受復配比例的影響。抗氧化協同作用機理的主要核心理論為抗氧化功效因子之間的相互再生作用。大多數理論認為,復合抗氧化功效因子之間可以通過相互修復,再生形成氧化還原循環系統,進而使復合抗氧化效果明顯強于單一抗氧化劑[18-19]。紫蘿卜提取物的主要成分是花色苷,花色苷抗氧化能力的強弱與其本身的結構有很大的關系:苷元母核B環上的3′,4′鄰二酚羥基具有強的供氫能力,能夠捕獲自由基,具有較強的抗氧化能力;如果在A環的5,7,8位增加羥基的話可以不同程度的增加花色苷的抗氧化能力[20]。花色苷能與VE自由基發生氫原子轉移反應,使VE再生[21],繼而發揮抗氧化協同作用;SEY中的有效物質可以與VE交換電子從而使VE含量維持正常水平,并不斷發揮抗氧化作用[22]。兩種以上的抗氧化功效因子復合使用時,各種抗氧化劑也可能使體系中產生的游離基相互作用,生成新的酚類化合物繼續發揮抗氧化作用,增強體系整體的抗氧化性能[23]。除此之外,也有報道認為[24]多種抗氧化功效因子之間存在基于氧化還原電位差的偶聯氧化,可以降低直接反應的兩種抗氧化功效因子之間的電位落差,使反應更容易進行。

3 結論

通過以上的實驗數據分析,發現抗氧化物質之間的協同抗氧化作用與抗氧化評價方法的原理、抗氧化物質本身的抗氧化能力、抗氧化物質有效濃度等因素有關。SEY、VE和Ant聯合使用具有一定的抗氧化協同作用,且協同作用的強弱受配方比例的影響,其中協同效應最佳的組合比例分別為:VEmix∶Antmix∶SEYmix=4∶1∶1(DPPH模型)、1∶4∶1(Fe3+模型)、1∶1∶1(ABTS+·模型)。

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Antioxidant synergy effectinvitroamong different forms of selenium,Vitamin E and purple carrot extract

ZHENG Shi-lian,PAN Yao,ZHANG Yun-long,DENG Ze-yuan,LI Hong-yan*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Theantioxidanteffectsofindividualandcombinedthreekindsofseleniumincludingsodiumselenite(SS),L-Se-methylselenocysteine(L-Se-MSC),Se-enrichedyeast(SEY),VitaminE,anthocyaninextractsofpurplecarrotsweredeterminedbyDPPHradicalscavengingactivity,Fe3+reducingpowerandABTSradicalscavengingactivity.IsobolographicanalysiswasusedtocalculatetheactualantioxidantvalueinIC50 mixandevaluatethesynergisticantioxidanteffectofindividualandcombineddifferentformsselenium,VitaminEandpurplecarrotextract.TheresultsindicatedthatL-Se-MSCandSSpossessedlowantioxidantactivityin vitroantioxidantmodel,whileSEYpossessedhighantioxidantactivitywhichexhibitedsynergisticeffectwithVitaminE,anthocyaninextractsofpurplecarrots.Inthesamemodel,differentcombinationshaddifferenteffects.ThebestratioinDPPHmodelwasVEmix∶Antmix∶SEYmix=4∶1∶1,intheFe3+model,thebestonewasVEmix∶Antmix∶SEYmix=1∶4∶1andVEmix∶Antmix∶SEYmix=1∶1∶1wasthebestoneinABTS+·model.Inthesamecombination,differentfactorsshoweddifferenteffects.Thecombinationofseleniumyeast,vitaminE,andanthocyaninextractsofpurplecarrotshadsynergisticantioxidanteffects.

selenium;VitaminE;purplecarrotextract;antioxidants;synergisticeffect

2016-02-26

鄭時蓮(1990-)，女，碩士研究生，主要從事天然產物活性方面研究，E-mail:zhengshilian07@163.com。

*通訊作者:李紅艷(1986-)，女，博士，副教授，主要從事天然產物方面的研究,E-mail:lihongyan61@gmail.com。

國家自然青年科學基金(31301433)；江西省博士后科研項目(2013KY04)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)19-0086-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.008