杏鮑菇超氧化物歧化酶部分酶學性質研究

陳國忠,程仕偉,祝 玲,劉艷玲,程顯好,劉進杰,*

(1.魯東大學生命科學學院,山東煙臺 264025;2.魯東大學農學院,山東煙臺 264025)

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杏鮑菇超氧化物歧化酶部分酶學性質研究

陳國忠1,程仕偉1,祝 玲1,劉艷玲1,程顯好2,劉進杰1,*

(1.魯東大學生命科學學院,山東煙臺 264025;2.魯東大學農學院,山東煙臺 264025)

研究了杏鮑菇不同部位超氧化物歧化酶(SOD)活力的差異,以及pH、溫度、金屬離子和有機試劑對SOD酶活性的影響。結果表明:菌蓋和菌褶SOD酶活力顯著高于菌柄,外皮高于心部;杏鮑菇SOD在pH5～8范圍內活性穩定,具有良好的耐熱性;Cu2+、Zn2+、Fe2+和Mn2+對SOD酶活力具有不同程度的激活作用,其中Cu2+的激活作用最突出;甲醇、乙醇和正丁醇對SOD活性的影響均為低濃度激活、高濃度抑制,而丙酮則表現出抑制作用。可見杏鮑菇SOD酶活力受到pH、溫度、金屬離子和有機溶劑等多種因素的影響。

杏鮑菇,超氧化物歧化酶,酶活力,影響因素

超氧化物歧化酶(SOD)是廣泛存在于生物體中的一類金屬酶,它能有效清除體內的氧自由基,增強機體抗輻射損傷能力,防御氧毒性,抗衰老,在一些腫瘤、炎癥、自身免疫疾病等治療中有良好的療效[1]。SOD存在分子量大、半衰期短、易失活等缺點,在提取、儲存和使用過程中受到pH、溫度、金屬離子和有機溶劑等多種外界因素的影響[2]。楊學山等發現金屬離子在體外對羊血SOD酶活產生激活或抑制作用[3],海藻糖對羊血SOD活性有明顯的激活和保護作用[4]。謝曉蘭等發現甲醇、乙醇、正丙醇等有機溶劑的存在均引起酶構象的改變,對豬血SOD酶活力表現出激活或抑制作用[5]。目前相關研究大多集中在動物來源SOD上,是因為長期以來動物血液一直是提取SOD的主要原料[6]。然而由于各種病源及外源污染,國際社會已禁止從動物血液中提取SOD用于人體,于是近年來研究者將目光投向了植物[7-8]和微生物[9-10]。

杏鮑菇、雙孢蘑菇等食用菌SOD的提取分離和部分性質已有文獻報道[11-13]。研究者發現,杏鮑菇SOD熱穩定性突出[14],且4 ℃貯藏18 d SOD活性基本保持不變[15],具有良好的開發應用前景。本文比較了不同部位杏鮑菇SOD酶活力的差異,考察了pH、溫度、金屬離子和有機溶劑對杏鮑菇SOD活性的影響,對于杏鮑菇SOD的生產加工和貯藏使用等具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏鮑菇 超市；Tris、NBT、鄰苯三酚、甲硫氨酸等試劑 均為分析純；核黃素 惠興生化試劑有限公司。

CP214電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;KQ-500DB數控超聲波破碎儀 昆山市超聲儀器有限公司;PhilipsHR2004/70攪拌機 飛利浦電子香港有限公司;5810R離心機 上海艾本德生物技術國際貿易有限公司;4000Lx熒光燈 深圳市諾銳軟管有限公司;XMTD-2MA電熱恒溫水浴鍋 龍口市先科儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏鮑菇SOD的提取 取新鮮杏鮑菇10.00 g,切成2 mm左右的小塊,放入攪拌機中,加入0.05 mol/L pH7.6磷酸緩沖液30 mL,粉碎至糊狀,全部轉移至250 mL燒杯中,置于超聲波破碎儀中120 W處理5 min,4 ℃ 10000 r/min離心10 min,取上清液,加入0.25體積的氯仿-乙醇(3∶5,v/v)混合液攪拌15 min,5000 r/min離心15 min,上清液加入等體積的冷丙酮,攪拌15 min,5000 r/min離心15 min,沉淀溶于0.05 mol/L pH7.6磷酸緩沖液中,得SOD粗酶液。

1.2.2 杏鮑菇SOD的純化 將杏鮑菇SOD粗酶液上DEAE-FF柱(1.5 cm×50 cm),用0.05 mol/L Tris-HCl洗脫液(pH7.6)洗脫,流速60 mL/h,每管收集5 mL,測定酶活,合并酶活力吸收峰,超濾濃縮,10000 r/min離心10 min,棄去沉淀取上清液上Sephadex G-100柱(1.0 cm×50 cm),用0～100 mmol/L Tris-HCl洗脫液進行梯度洗脫,流速為20 mL/h,每管收集3 mL,合并酶活力吸收峰得SOD純化酶液,置于-20 ℃冷凍備用。

1.2.3 杏鮑菇SOD酶活影響因素的研究 杏鮑菇不同部位SOD酶活的比較:分別取杏鮑菇的菌蓋、菌褶、菌柄、外皮(表層以下2～3 mm)和心部10.00 g,按1.2.1步驟提取SOD得粗酶液,測定酶活力。

pH對杏鮑菇SOD酶活的影響:分別配制pH3、4、5、6、7、8、9、10、11的Tris-HCl緩沖液,加入等體積SOD純化酶液,于25 ℃水浴保持2 h,測定酶活力。

溫度對SOD活性的影響:取1.0 mL SOD純化酶液于試管中,分別置于20、40、60、80、100 ℃水浴鍋中,每隔10 min取出1管測定SOD酶活力。

金屬離子對SOD活性的影響:在SOD純化酶液中分別加入CuSO4、ZnSO4、FeSO4和MnSO4溶液,使得酶液中金屬離子的終濃度梯度為0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、3.0 mmol/L,充分混勻后靜置1 h,分別測定酶活力。

有機溶劑對杏鮑菇SOD活性的影響:在SOD酶液中分別加入不同比例的甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮,酶液與有機溶劑的比例分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2,最終反應體系中有機溶劑濃度分別為25%、33%、50%、67%,充分混勻后靜置1 h,分別測定酶活力。

1.2.4 SOD酶活力的測定 采用氮藍四唑光還原法[16]測定SOD酶活力。一個酶活力單位定義為將NBT的還原抑制到對照一半(50%)時所用的酶量。取25 mL試管4支,2支為對照管,依次加入0.05 mol/L pH7.8 磷酸緩沖液3 mL、130 mmol/L Met溶液0.6 mL、750 μmol/L NBT溶液0.6 mL、100 μmol/L EDTA-Na2溶液0.6 mL、20 μmol/L 核黃素0.6 mL、酶液0.2 mL(對照以磷酸緩沖液代替)、蒸餾水1.0 mL,混勻后將1支對照管放置暗處,其他各管于4000 Lx熒光燈下反應20 min,要求各管受光情況一致,反應溫度控制在25～35 ℃之間,視酶活性高低適當調整反應時間。反應結束后,以不照光的對照管做空白,分別測定其他各管的吸光度,按下式計算SOD活性:

式中:A0為照光對照管的吸光度;As為樣品管的吸光度;VT為樣液總體積(ml);V1為測定時樣品用量(ml);mf為樣品鮮重(g)。

1.2.5 數據分析 實驗數據以3個平行組數據的平均值表示,并計算標準偏差。用Origin8.0作圖,SPSS(19.0)對數據進行統計分析,采用ANOVA進行Duncan’s差異分析,以p<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 杏鮑菇不同部位SOD酶活力的比較

分別取杏鮑菇的菌蓋、菌褶、菌柄、外皮(表層以下2～3 mm)和心部,提取SOD檢測酶活力。由圖1可知,杏鮑菇不同部位SOD酶活力不同。菌蓋部分的SOD酶活力最高,菌柄則最低,外皮SOD酶活力高于心部。這可能與杏鮑菇的形態特征和SOD的生物學功能有關。SOD的主要功能是清除細胞內由于線粒體氧化呼吸作用產生的一些超氧化物。菌蓋和外皮位于杏鮑菇的最外層,與空氣接觸面積最大,含有較多的SOD以清除產生的自由基,而菌柄部分埋在土里,與空氣接觸較少,呼吸作用沒有菌蓋旺盛,相應的含SOD也較少[17]。

圖1 杏鮑菇不同部位SOD酶活力Fig.1 SOD activity from various parts of Pleurotus eryngii注:不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05)。

圖2 pH對SOD酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on SOD activity

2.2 pH對杏鮑菇SOD活性的影響

考察了不同pH條件下杏鮑菇SOD活性。由圖2可知,在pH3～8范圍內,SOD酶活力隨pH升高而增大,在pH8時酶活力達到最高,此后隨著pH升高SOD酶活力迅速下降。在pH5～8范圍內酶活力較高,穩定性較好,表明杏鮑菇SOD對pH的適應范圍較廣。這與文獻報道其它來源SOD的酸堿穩定性相似[18-19]。

2.3 溫度對SOD活性的影響

研究了杏鮑菇SOD酶活力在不同溫度下隨時間的變化規律。由圖3可以看出,杏鮑菇SOD酶活力在20 ℃條件下可保持較長時間無顯著降低,但隨著溫度升高和時間延長酶活力呈下降趨勢。不過與其它類型SOD[15]相比,杏鮑菇SOD屬于耐溫型,其熱穩定性高,在100 ℃條件下處理50 min后SOD酶活力仍能保留48.30%。除了杏鮑菇SOD本身的熱穩定性之外,杏鮑菇含有較高含量的海藻糖[20],可能對SOD產生激活和保護作用[4]。由此可見,低溫貯存有利于SOD酶活力的保持[21]。

圖3 溫度對SOD酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on SOD activity

2.4 金屬離子對SOD活性的影響

SOD是一種金屬酶,金屬離子對維持酶的分子結構及催化活性有重要作用[22-24]。根據金屬輔基的不同,可將SOD分為3 類:Cu·Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。根據文獻報道,杏鮑菇SOD主要類型為Mn-SOD[25],兼有Cu·Zn-SOD[11]。本文考察了外源添加Cu2+、Zn2+、Mn2+和Fe2+對杏鮑菇SOD酶活力的影響,結果見圖4。Mn2+對杏鮑菇SOD有激活作用,但是并非最佳的金屬離子激活劑,Cu2+和Fe2+表現出更加顯著的激活作用,特別是當Cu2+濃度為1 mmol/L時SOD酶活力比對照提高了43.70%,此時繼續增大Cu2+濃度則變化不大。Zn2+濃度在0.01～1 mmol/L之間對SOD活力具有明顯的激活作用,但是當濃度繼續增大時激活作用明顯減弱,表明只有適宜的Zn2+濃度才能發揮最佳的激活作用。由此可見SOD酶活力與其金屬輔基的離子濃度并不成正比例關系,類似的研究已有報道,比如楊學山等[3]發現Cu2+、Zn2+對羊血Cu·Zn-SOD有抑制作用。原因可能是某些金屬離子能和SOD活性中心的金屬輔基發生誘導、置換等反應形成新的配位化合物,或者發生拮抗作用,從而激活或抑制酶活性[3]。

圖4 金屬離子對SOD酶活力的影響Fig.4 Effect of metal ions on SOD activity

2.5 有機溶劑對SOD活性的影響

如圖5所示,甲醇、乙醇和正丁醇均表現為在低濃度時對SOD酶活力有激活作用,隨著濃度增加激活作用逐漸增大,達到最大值后激活作用下降,并最終轉變為抑制作用。究其原因,可能是因為在低濃度下這3種醇有利于酶與底物的接觸,促進底物和產物的分配和擴散,從而間接提高酶的催化活性;而隨著有機溶劑濃度增加,醇溶解大量的水,破壞酶表面必需的水化層,醇直接與酶作用,破壞酶蛋白活性構型的氫鍵、疏水作用等而導致酶活性降低[26]。丙酮在低濃度時對SOD酶活力的影響并不顯著,但在其濃度高于25%之后表現出抑制作用。關于丙酮影響SOD酶活力的研究未見報道,推測其作用原理可能是丙酮破壞酶分子表面的水化層導致酶失活。

圖5 有機溶劑對SOD酶活力的影響Fig.5 Effect of organic solvent on SOD activity

3 結論

SOD酶是一類重要的抗氧化金屬酶,其活性分布在杏鮑菇中表現出不均一性,外皮>心部,菌蓋>菌褶>菌柄,盡管如此生產過程中產生的邊角料仍有較高的利用價值。杏鮑菇SOD在pH5～8之間酶活力較高,pH小于5或大于8活性顯著降低。高溫環境不利于SOD酶活力的保存,但相比文獻報道中其他動植物來源的SOD,杏鮑菇SOD表現出良好的溫度耐受性,在貯存和加工過程中有利于延長SOD產品的有效期。Cu2+、Fe2+和Zn2+對杏鮑菇SOD的激活作用明顯高于Mn2+,表明添加適量濃度的外源金屬離子能夠提高SOD酶活力,其類型與金屬輔基并不一致,如何選擇合適的金屬離子作為SOD激活劑需要進一步的理論和實驗研究。低濃度甲醇、乙醇和正丁醇對SOD活性有激活作用,表明適宜濃度的有機溶劑比水更適合作為SOD的催化反應體系。

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Study on properties of superoxide dismutase activity fromPleurotuseryngii

CHEN Guo-zhong1,CHENG Shi-wei1,ZHU Ling1,LIU Yan-ling1,CHENG Xian-hao2,LIU Jin-jie1,*

(1.College of Life Science,Ludong University,Yantai 264025,China; 2.College of Agriculture,Ludong University,Yantai 264025,China)

Superoxidedismutase(SOD)activityindifferentpartsofPleurotus eryngiiwascompared.SeveralfactorsaffectingthestabilityofSODincludingpH,temperature,metalionsandorganicreagents,werestudied.TheresultsshowedthatSODenzymeactivitiesinpileusandgillwerehigherthanthatinstipe,theskinhigherthancoresection.ThisenzymedisplayedgoodstabilityatthepHrangefrom5to8andgoodthermalstability.Cu2+,Zn2+,Fe2+andMn2+showeddifferentdegreesofactivationonSODenzymeactivity,inwhichtheactivationofCu2+wasthemostprominent.Methanol,ethanolandn-butylalcoholshowedactivationinlowconcentrationbutinhibitoryeffectinhighconcentration,whileacetoneshowedinhibitoryeffect.ThereforeSODactivityofPleurotus eryngiiwereinfluencedbymanyfactorsincludingpH,temperature,metalionsandorganicsolvents.

Pleurotus eryngii;superoxidedismutase(SOD);enzymeactivity;influencefactors

2016-04-25

陳國忠(1980-)，男，博士，講師，研究方向：生物化學工程，E-mail：guozhongch@126.com。

*通訊作者:劉進杰(1978-)，女，碩士，講師，研究方向：食品工程，E-mail：jinjie78@126.com。

魯東大學科研基金項目(27710301);城新創新基金(CXJ-06)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)19-0176-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.026