硫化氫對高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪代謝的調控作用

王 智 孫計萍 周 繼 朱依純△

(1復旦大學基礎醫學院生理與病理生理學系 上海 200032; 2上海市小分子活性物質重點實驗室 上海 200032)

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硫化氫對高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪代謝的調控作用

王 智1,2孫計萍1,2周 繼1,2朱依純1,2△

(1復旦大學基礎醫學院生理與病理生理學系 上海 200032;2上海市小分子活性物質重點實驗室 上海 200032)

目的 探討給予外源性硫化氫(H2S)對肥胖小鼠脂肪代謝的調控作用。方法 將小鼠分為正常對照組、模型組和治療組。正常對照組(n=10):給予正常小鼠飼料喂養;模型組(n=10):給予高脂飼料喂養12周建立飲食致胖(diet-induced obesity,DIO)模型;治療組(n=15):同樣建立成DIO小鼠并隨機分3小組,分別給予25、50和100 μmol·kg-1·d-1NaHS治療6周,期間繼續給予高脂飼料。給藥期間動態監測各組小鼠的體質量變化。治療期滿處死小鼠,檢測附睪脂肪以及腎周脂肪重量,用自動生化儀和ELISA法分別檢測小鼠血清中的游離脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)和抵抗素(resistin)脂肪因子水平。結果 與正常對照組比較,DIO模型組小鼠造模成功,體質量、附睪脂肪重量與腎周脂肪重量均有明顯升高,但小鼠血清中的NEFA和resistin含量沒有明顯變化;與模型組相比,治療各組小鼠附睪脂肪重量與腎周脂肪重量均有明顯的回落(P<0.05),血清中的NEFA水平也明顯降低(P<0.05),resistin含量沒有顯著變化。結論 H2S可以顯著緩解DIO小鼠脂肪的堆積,降低治療組血清中NEFA的水平,但對resistin脂肪因子無明顯調控作用。

硫化氫; 飲食致胖; 游離脂肪酸; 抵抗素; 小鼠

近年來越來越多研究顯示,脂肪代謝通過分解脂肪細胞中貯存的三酰甘油來產生大量的脂肪酸,參與β-氧化進而生成ATP為機體提供更多的熱量;而脂肪組織不僅作為體內重要的脂質儲存器官,同時也是體內最大的內分泌器官[1]。脂肪組織通過分泌多種脂肪因子,在各類代謝綜合征、炎癥、免疫反應以及腫瘤發生發展中都存在重要的調控作用[2]。因此,脂肪代謝與脂肪因子之間有著密不可分的關系。2014年,Zak等[3]發現游離脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)水平與代謝綜合征疾病有密切的相關性;Wolfing等[4]對代謝綜合征中脂肪因子分泌的水平進行了研究。Mancuso[5]的研究表明,肥胖的發生主要由脂肪細胞因子分泌紊亂、脂肪細胞異常增多以及細胞內脂質過度沉積產生。在能量代謝方面,脂肪因子能通過增加能量消耗,改善脂代謝水平,從而調節內分泌水平[6],有效預防肥胖以及代謝綜合征的發生發展。根據報道,調控NEFA以及脂代謝相關因子抵抗素(resistin)水平,對肥胖相關性代謝綜合征的預防與緩解,改善脂代謝水平,調節胰島素抵抗方面有重要的作用[7]。NEFA可通過降低胰島素受體數量,促進胰島β細胞凋亡等介導糖尿病的發生,同時NEFA還可降低內皮依賴性血管舒張并影響平滑肌細胞功能,誘導高血壓的發生[8-10]。研究還發現,NEFA在腎病等疾病的發生過程中也扮演了重要角色[11]。resistin是近年新發現的一種由脂肪細胞特異性分泌的多肽[12],它是脂肪形成的一種反饋調節因子,與機體肥胖、胰島素抵抗等密切相關[13]。研究發現,它參與免疫反應、炎癥等方面的作用,但resistin的作用機制尚不明確,需深入研究。近年來,人們發現控制NEFA和resistin水平的穩定,對防治2型糖尿病也起到一定作用[14]。

H2S是一種哺乳動物體內廣泛生成的內源性氣體小分子活性物質[15-16]。目前已知機體內能夠產生H2S的酶主要是胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase,CSE)、胱硫醚-β-合酶(cystathionineβ-synthase,CBS)以及3-巰基丙酮酸硫轉移酶(3-mercap-topyruvate sulfurtransferase,3-MST)[17-18]。H2S在各系統中發揮了廣泛的生理學保護作用,包括神經系統、心血管系統、消化系統、內分泌系統以及炎癥免疫系統等,已成為繼NO、CO之后的第3種氣體信號分子[19]。Xue等[15]研究發現,H2S通過調節胰島素受體(insulin resistance,IR)介導的信號通路,增加胰島素敏感性、減輕胰島素抵抗,改善糖代謝異常。Mani等[20]觀察發現,內源性H2S缺乏可致動脈內皮細胞增殖和黏附分子表達增加,而外源性給予H2S后可縮小動脈硬化斑塊并且改善血脂代謝異常。鑒于目前已知H2S對糖脂代謝有重要調控作用,本課題擬通過NaHS給藥處理,觀察外源性H2S對飲食至胖(diet-induced obesity,DIO)小鼠脂肪代謝的調控作用。

材 料 和 方 法

實驗試劑及設備 NaHS購自美國Sigma公司;超敏小鼠抵抗素ELISA試劑盒購買自美國Millipore(R&D)公司;深低溫冰箱(Heraeus HFU 486 PLUS-U14)購自合肥美菱股份有限公司;全波長酶標儀購自美國TECAN公司;低溫高速離心機購自美國Thermo Scientific公司;微量移液器購自德國 Eppendorf 公司;體質量計購自上海精密科學儀器有限公司。

實驗動物 4周齡SPF級野生型雄性C57BL/6J小鼠70只,購自上海市斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠采取自由覓食及飲水。飼養環境為25 ℃恒溫,60%恒濕,每天10 h人工日照。本文動物實驗均符合復旦大學動物實驗倫理標準要求。

動物飼料 普通飼料(碳水化合物 65%,脂肪 20%,蛋白質15%)購自復旦大學動物房;高脂飼料(60%脂肪能量供比)購自上海斯萊克有限責任公司。

動物分組 適應環境喂養普通飼料(含20%脂肪能量供比)2周后,測其小鼠體質量,從18～23 g小鼠中隨機挑選分為3組。第1組喂養正常普通飼料,作為正常對照組(n=10);第2組喂養高脂飼料(含60%脂肪能量供比),作為DIO模型組(n=10)。第3組同樣喂養高脂飼料,建立成DIO小鼠模型,作為NaHS給藥處理的治療組(n=45)。不同方式喂養12周(小鼠達18周齡)后,治療組隨機分為3組給藥處理,小鼠的體質量在3組間無顯著性差異。

給藥處理 第18周時開始連續6 周給藥處理。正常對照組:腹腔注射生理鹽水(100 μL/d); DIO模型組:腹腔注射生理鹽水(100 μL/d); NaHS治療組:DIO模型小鼠分別腹腔注射同體積的25、50、100 μmol·kg-1·d-1NaHS(NaHS溶液需每天用生理鹽水新鮮配制)。每2周測量1次小鼠體質量。

血清中NEFA的指標檢測 血清中NEFA水平委托上海市龍華醫院檢驗科通用全自動生化儀進行分析檢測。

ELISA法檢測血清resistin水平 按照美國R&D公司ELISA Kit Protocol操作流程對血清中resistin水平進行檢測,用全自動酶標儀在450 nm波長下測得各孔的吸光度(D值),通過標準曲線計算血清中resistin脂肪因子濃度。

結 果

小鼠體質量的變化以及外源性H2S對附睪脂肪重量和內臟脂肪重量的影響 喂養小鼠第18周時,檢測正常對照組和DIO模型組小鼠的體質量,與正常對照組相比,DIO模型組小鼠的體質量均明顯增加(P<0.05,圖1A)。

Data represent means±SE.(1)vs.Normal-control group,P<0.01,(2)vs. DIO-control group,P<0.05.(Normal group,n=10;DIO-control group,n=10; DIO+25,50,100 μmol·kg-1·d-1,n=15 respectively).

圖1 第6周正常對照組小鼠與NaHS處理的小鼠的體質量、附睪脂肪重量以及腎周脂肪重量的測定

Fig 1 The measure of body weight,epididymis adipose weight and perirenal fat weight in normal control and DIO mice with or without chronic NaHS treatment for 6-week

在給藥處理6周后,對所有組小鼠的附睪脂肪以及腎周脂肪重量進行稱量。與正常對照組比較,DIO模型組小鼠的附睪脂肪重量與腎周脂肪重量均有明顯的升高,差異有統計學意義(P<0.05);此實驗數據表明,DIO小鼠造模實驗成功;與DIO模型組小鼠比較,治療組給予50 μmol·kg-1·d-1NaHS處理后,DIO小鼠附睪脂肪重量與腎周脂肪重量均顯著性降低(P<0.05),給予25或100 μmol·kg-1·d-1NaHS處理后附睪脂肪重量與腎周脂肪重量雖有下降趨勢,但與DIO模型組相比沒有統計學意義。表明在50 μmol·kg-1·d-1NaHS給藥條件下,H2S能夠明顯減少附睪脂肪和腎周脂肪的堆積 (圖1 B、C)。

正常對照組與DIO模型組小鼠脂肪組織重量與體質量的比值 經過高脂飲食誘導喂養后,發現DIO模型組與正常對照組小鼠相比,其附睪脂肪和腎周脂肪組織的總重量與體質量的比值(FW/BW)有明顯的增加,差異有顯著統計學意義(P<0.001)。如果根據總脂與體質量的比值增加做為肥胖判斷標準之一,DIO模型組小鼠早已形成肥胖。治療組給藥50 μmol·kg-1·d-1處理后,與DIO模型組比,總脂與體質量的比值有明顯降低(P< 0.05,表1)。

H2S對小鼠血生化指標的影響 給藥處理6周,小鼠饑餓過夜后,測血清中糖脂代謝相關的生化指標變化。其中治療組25 、50及100 μmol·kg-1·d-1NaHS分別給藥處理后,血清中三酰甘油水平均有顯著降低(P<0.05),而膽固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白水平與DIO模型組相比,未有顯著變化(表2)。

表1 第24周不同組之間小鼠脂肪組織重量(附睪脂肪+腎周脂肪重量)與體質量的比值比較

GroupsFW/BWNormal-control0.98±0.27DIO-control2.45±0.79(1)DIO+25μmol·kg-1·d-11.73±0.64DIO+50μmol·kg-1·d-11.41±0.89(2)DIO+100μmol·kg-1·d-11.61±0.73

(1)vs.Normal-control group,P< 0.001;(2)vs.DIO-control group,P< 0.05.

表2 各組血清中三酰甘油、膽固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白水平的比較

Variable(mmol/L)TGCHOLHDL-CLDL-CNormal-control0.75±0.081.69±0.071.47±0.040.19±0.03DIO-control0.86±0.093.09±0.26(1)2.81±0.23(1)0.56±0.03(1)DIO+25μmol·kg-1·d-10.54±0.08(2)2.49±0.382.23±0.180.54±0.11DIO+50μmol·kg-1·d-10.39±0.14(3)2.53±0.312.44±0.220.41±0.10DIO+100μmol·kg-1·d-10.53±0.02(4)2.86±0.122.62±0.130.61±0.04

Effects of chronic NaHS treatment for 6 weeks on biochemical profiles in DIO mice.Data represent means±SE; TG:Triglyceride;CHOL:cholesterol; HDL-C;High density lipoprotein-cholesterol;LDL-C;Low density lipoprotein-cholesterol.(Normal group,n=10;DIO-control group,n=10; DIO+25,50,100 μmol·kg-1·d-1group,n=15 respectively).(1)vs.Normal-control group,P<0.001;(2)(4)vs.DIO-control group,P<0.05;(3)vs. DIO-control group,P<0.01.

H2S對小鼠血清中游離脂肪酸含量的影響 與正常對照組比較,DIO模型組小鼠的NEFA水平沒有明顯升高(P=0.255 8);與DIO模型組小鼠相比,3個劑量的治療組小鼠血清中NEFA水平均有顯著性降低,差異有統計性意義(P<0.05)。此研究表明,H2S對小鼠血清中NEFA含量具有明顯的下調作用(圖2)。

H2S對小鼠血清中抵抗素水平的影響 與正常對照組相比,DIO模型組小鼠血清中的resistin水平沒有明顯變化;與DIO模型組比較,治療組中給藥各個濃度下的小鼠其血清中resistin 水平沒有發生明顯改善,差異無統計學意義。表明H2S對小鼠血清中resistin水平沒有顯著的調控作用(圖3)。

圖2 給藥不同濃度的硫氫化鈉與血清中游離脂肪酸含量的關系

Fig2TherelationshipofdifferentconcentrationsNaHSandNEFAlevelinserum

圖3 給藥不同濃度的硫氫化鈉與血清中抵抗素含量的關系

Fig3TherelationshipofdifferentconcentrationsNaHS and resistin level in serum

討 論

目前,肥胖動物模型主要包括兩類:基因缺陷型肥胖和飲食誘導型肥胖。常用的基因缺陷型肥胖模型主要包括以下幾種:ob/ob小鼠、db/db小鼠、zucker糖尿病肥胖大鼠(ZDF)、多基因背景KK/Ay小鼠以及OLETF大鼠。其中ob/ob小鼠和db/db小鼠分別是C57BL/6J背景的瘦素基因[21]和瘦素受體基因突變[22-23]的小鼠;ZDF大鼠是從zuker肥胖大鼠(zucker fatty rat,ZF)中篩選出的糖尿病表型大鼠,帶有瘦素受體突變基因[24-25];KK/Ay小鼠則是由KK小鼠編碼調節皮毛顏色的Agouti基因突變導致的自發性肥胖糖尿病小鼠[26];OLETF大鼠是由于膽囊收縮素1受體缺失導致攝食過量引起的肥胖大鼠[27]。DIO模型主要是針對Wistar大鼠及C57BL/6J小鼠等給予高脂飼料或高濃度果糖飲水飼養誘導造模。由于DIO小鼠模型被廣泛應用于肥胖和胰島素抵抗等為特點的代謝綜合征疾病研究中[28],又鑒于目前肥胖的流行發病趨勢主要由攝取大量高熱量飲食等造成,而DIO小鼠模型能更好地模擬當前大多數肥胖的發病原因。為此,本研究選擇用DIO小鼠模型作為研究對象。我們選用60%脂肪能量供比的高脂飼料喂養6周齡雄性C57BL/6J小鼠,通過小鼠體質量明顯增加、附睪脂肪以及腎周脂肪明顯堆積,說明DIO小鼠造模成功。在第18周時DIO模型組小鼠比正常對照組體質量增重25.3%,在第24周時附睪脂肪重量和腎周脂肪重量分別增加59.3%和53.6%。另外,連續6周給藥治療下,觀察到只有在治療組50 μmol·kg-1·d-1NaHS濃度條件下,附睪脂肪和腎周脂肪的重量均有顯著性下降,分別下降44.4%和35.4%,提示此濃度下外源性H2S可能對肥胖的治療有改善效果。

長期以來,脂肪代謝在人體三大代謝系統中發揮著重要的調節作用,cAMP路徑被認為是脂肪代謝重要的調節者,在調控脂代謝水平、脂肪細胞分化以及脂肪因子分泌等方面都起著重要的作用[6]。然而,隨著近年來研究脂肪因子尤其是Leptin、TNF-α 異軍突起,對脂肪代謝調節的認識有了更深入的研究。

H2S在近20年的醫學與生物學研究發展中開始受到足夠的重視[29],在治療或控制肥胖及代謝綜合征領域已有不少發現。Wu等[30]發現H2S能夠減緩由高脂飲食導致肥胖的腎臟損傷;另外,Candela等[31]觀察到肥胖中硫化氫損耗能夠導致微血管的重建;2011年,Desai等[32]探究了H2S與代謝綜合征的關系,表明硫化氫能夠改善代謝綜合征等并發癥的現象。但H2S通過調控脂肪因子水平來改善肥胖及相關代謝性疾病,還少有報道。我們的研究結果顯示,NaHS給藥6周后,DIO小鼠的附睪脂肪與腎周脂肪重量有顯著性降低,但小鼠體質量卻沒有明顯減輕,究其原因可能與DIO小鼠的肝組織脂肪合成過多有關。有文獻報道,通過高脂飲食誘導的肥胖型小鼠,其肝組織細胞脂肪氧化酶mRNA的表達下降和CPT-1的活性降低,從而引起肝組織脂肪堆積的現象[33]。另外,也有文獻發現[34],在高脂飲食誘導后的小鼠體內其脂肪酸合成酶FAS活性下降以及其mRNA水平降低都與肝組織脂肪堆積相關。提示外源性H2S可能通過調節附睪脂肪細胞與腎周脂肪細胞的氧化還原狀態,促進其脂肪氧化酶活性及mRNA的合成,抑制其脂肪酸合成酶的活性,使脂肪酸分解,導致脂肪重量的減輕。而H2S可能受到某些機制影響,對緩解肝組織脂肪堆積的作用不是很明顯,所以小鼠體質量沒有明顯變化。但也有相應文獻提出H2S對體質量變化相反的影響,通過表達產生內源性H2S酶CBS和CSE,發現當CBS及CSE基因缺失,導致蛋白表達量下降,會引起小鼠體質量的下降[35-36]。這說明內源性H2S水平降低可以導致體重減輕,從互補角度上也印證了外源性H2S對肥胖小鼠體質量沒有明顯影響的觀點。此外,還有文獻證明,抑制產生內源性H2S酶系統,能增強脂肪組織的分解,導致脂肪組織質量增加變緩;而給予H2S緩釋供體,卻抑制了脂肪分解作用,脂肪組織質量也無明顯變化[37]。此結論與本研究有一定的矛盾之處,可能原因是內源性H2S對脂肪細胞的代謝與內分泌作用機制不同造成的,這還需要我們對內外源性H2S的作用機制進行深入對比研究。而本研究又發現,高脂飲食誘導后的模型組小鼠其血脂水平普遍有明顯性升高,經外源性H2S給藥處理后,TG水平有顯著性降低,而TC與LDL-C水平卻未顯著性降低。根據文獻報道,血液中近70 %的膽固醇(TC)是通過LDL和極低密度脂蛋白(VLDL)攜帶的,其中65 % ～ 70 %的LDL通過依賴肝細胞的LDLR(低密度脂蛋白受體相關蛋白) 途徑清除[38]。而LDLR作為一種細胞表面蛋白,屬于內吞性受體,其能調節血脂的動態平衡及纖溶功能的穩定,因此對控制血清中膽固醇含量處于正常動態平衡狀態有重要的作用[39]。提示H2S可能阻礙或不能促進LDLR mRNA水平的增加,使其LDLR的表達下降,導致合成LDLR數量有所減少,因此LDL-C水平下降不明顯,血脂TC水平變化也不明顯。但這還需要大量實驗去探究與驗證。另外,H2S影響血脂中TG、TC等代謝的信號通路和具體的作用機制還需更深入的研究。

本研究還顯示,H2S對于小鼠血清中的NEFA水平具有顯著的降低作用,與DIO模型組相比,給藥后治療組血清中NEFA含量對應DIO+25、50、100 μmol·kg-1·d-1NaHS組分別下降40.4%、46.0%和49.1%,提示H2S能夠明顯下調NEFA水平,兩者之間存在一種負相關性;根據前期的研究成果[15],我們認為H2S可能激活了胰島素受體磷酸化,促進體內葡萄糖代謝,通過氧化還原反應間接導致脂肪細胞的三酰甘油水平降低,分解釋放的NEFA減少,具體原因還需深入研究。H2S對血清中resistin水平的調控方面,與DIO模型組比較,給藥條件下治療組均無顯著性變化。其對resistin是否有調控作用仍需進一步研究。

基于脂肪因子與肥胖及脂肪代謝等方面有著密切的關系,有效調控脂肪因子水平對體質健康以及控制體脂起著舉足輕重的作用。本研究發現H2S對于調控NEFA水平具有明顯的改善效果,這對預防肥胖及肥胖相關代謝疾病等方面都具有潛在的應用前景。但目前如何利用緩釋的H2S供體來提供穩定生理濃度的H2S以及長期H2S給藥,能否一直有效控制NEFA等血脂水平還存在很多不確定的因素,需進一步深入研究。

致謝 復旦大學基礎醫學院王銘潔副教授對本文進行了悉心的指導。

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The regulation of lipid metabolism by H2S in diet-induced obesity mice

WANG Zhi1,2, SUN Ji-ping1,2, ZHOU Ji1,2, ZHU Yi-chun1,2△

(1DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2ShanghaiKeyLaboratoryofBioactiveSmallMolecules,Shanghai200032,China)

Objective To explore the regulation of lipid metabolism by exogenous hydrogen sulfide (H2S) in mice serum. Methods Mice were divided into a normal group (n=10),a model group (n=10) and three treatment groups (n=15) of NaHS (25,50 and 100 μmol·kg-1·d-1) as exogenous H2S donor.The normal group was given a normal feed.The diet-induced obesity (DIO)model group mice were induced by using high-fat diet for 12 weeks.Treatment groups received different concentrations of NaHS in saline solution by daily intra peritoneal injection for 6 weeks since the 18thweek.Finally,at the end of treatment period,we measured the weight of epididymis adipose and perirenal fat after killing mice of treatment groups.Then the content of non-esterified fatty acid (NEFA) was measured by automatic biochemical analyzer and resistin level was measured with ELISA kit in mice serum. Results Compared with the normal group,the body weight,epididymis adipose weight and perirenal fat weight had obvious increase (P<0.05),but the levels of NEFA and resistin did not change significantly in model group; Compared with model group mice,the weight of epididymis adipose and perirenal fat and the level of NEFA had significant decrease in mice of treatment groups (P< 0.05),but the content of resistin had no obvious change. Conclusions Hydrogen sulfide could obviously reduce the fat accumulation of DIO mice and significantly decrease the serum level of NEFA in treatment groups,but its regulation on resistin was not obvious.

hydrogen sulfide; diet-induced obesity; non-esterified fatty acid; resistin; mice

國家自然科學基金(81230003,31471088)

R363

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.002

2016-09-07;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:yczhu@shmu.edu.cn

* This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81230003,31471088).