海分枝桿菌ppk基因的生物學功能研究

祝 琳 施旭駿 高 謙

(復旦大學基礎醫學院醫學分子病毒學教育部/衛生部重點實驗室 上海 200032)

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海分枝桿菌ppk基因的生物學功能研究

祝 琳 施旭駿 高 謙△

(復旦大學基礎醫學院醫學分子病毒學教育部/衛生部重點實驗室 上海 200032)

目的 構建海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)ppk基因敲除株,對其生物學功能進行研究。方法利用基因同源重組技術,構建了海分枝桿菌ppk基因敲除株;使用DAPI染色法檢測細菌胞內多聚無機磷酸鹽(poly inorganic phosphate,poly-Pi)濃度;比較野生株及突變株在不同環境壓力下的生存能力;用野生株和突變株分別感染斑馬魚成魚,通過觀察斑馬魚的存活情況,研究ppk基因對海分枝桿菌毒力的影響。將野生株和突變株分別感染小鼠來源的巨噬細胞系RAW267.4,檢測其在巨噬細胞內的增殖。結果ppk突變株胞內poly-Pi濃度明顯下降;在斑馬魚成魚感染模型中出現顯著減毒表型;其在小鼠來源的巨噬細胞感染模型中的增殖較野生型菌株明顯減弱;在營養缺陷、抗生素(利福平、左氧氟沙星)等環境壓力下,其生存能力下降。結論ppk基因影響分枝桿菌在環境壓力下的生存,并且在其致病中發揮重要作用。

分枝桿菌; 多聚磷酸鹽激酶; 多聚無機磷酸鹽

由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染所引起的結核病是一種嚴重威脅公共衛生安全的傳染性疾病。近年來,隨著結核病與HIV共感染、耐多藥結核分枝桿菌的出現使結核病的控制更為困難[1],亟需探索預防和治療結核病的新策略。對結核分枝桿菌重要功能基因及細菌-宿主相互作用的深入研究對于開發新的抗結核藥物和疫苗具有重要意義。

磷元素是構成生物體的必要元素,多聚無機磷酸鹽(poly inorganic phosphate,poly-Pi)是磷元素在生物體內的主要存在形式。poly-Pi是由幾個到幾百個無機磷酸鹽單體通過高能磷酸鍵聚合而成的線性多聚體,廣泛分布于自然界和生物體[2]。poly-Pi可作為信號分子參與細菌對環境壓力的應激性應答[3-4]。對大腸埃希菌的研究發現,在壓力環境下細菌胞內poly-Pi聚集可以激活RNA聚合酶RpoS,從而增強細菌對壓力環境的耐受[5]。此外,細菌蛋白酶體Lon可以與poly-Pi結合,通過降解核糖體蛋白質產生氨基酸來應對營養缺陷[6]。poly-Pi缺失菌株在平臺期生長受到抑制,并且對熱激、酸性、UV輻射以及氧化應激更敏感[7-10],由此說明poly-Pi在細菌對環境壓力的應答中發揮著重要的作用。

由于poly-Pi在細菌生理過程中具有重要的作用,因此其在細菌體內的合成與降解受到精確調控。目前已經發現參與poly-Pi代謝的酶包括多聚磷酸鹽激酶(polyphosphate kinase,PPK)、poly-Pi-AMP磷酸轉移酶(phosphotransferase,PAP)、多聚磷酸鹽外切酶(exopolyphosphatase,PPX)和多聚磷酸鹽內切酶(endopolyphosphatase,PPN)[11]。 PAP、PPXs和PPNs均參與poly-Pi的降解:PAP能轉移poly-Pi末端磷酸基團至AMP[12];PPX具有外切磷酸酶活性,能將poly-Pi降解成無機磷酸根離子[13-14];PPN具有內切磷酸酶活性,能將poly-Pi降解成短鏈的寡聚磷酸鹽鏈。PPK與poly-Pi的合成有關:PPK1能催化ATP末端的磷酸基團轉移合成poly-Pi[15],即nATP→(poly-Pi)n+nADP;而PPK2是雙向酶,催化GTP+(poly-Pi)n-1→GDP+(poly-Pi)n,并且其降解活性顯著高于合成活性[16]。不同細菌中PPK蛋白的種類有所不同,在一些細菌中,同時含有PPK1和PPK2 (如結核分枝桿菌、銅綠假單胞菌等)[17];而在另一些細菌中(如大腸埃希菌、海分枝桿菌等)只含有PPK1[16]。

目前在不同分枝桿菌研究中PPK的相關報道顯示:恥垢分枝桿菌的ppk1缺失株在氧化應激、表面壓力以及缺氧條件下的生存能力減弱[18];在結核分枝桿菌中,ppk1的缺失引起細菌胞內poly-Pi水平顯著下降,表現出在平臺期、NO壓力下和巨噬細胞內的生長缺陷。同時,ppk1敲除株對一線抗結核藥物如利福平(rifampin,Rif)、異煙肼更加敏感,并在豚鼠感染模型上的毒力顯著減弱[19]。這些研究結果說明poly-Pi對分枝桿菌的生理功能和致病性具有重要的作用。在海分枝桿菌中,PPK1蛋白的功能還不清楚。為探討PPK在海分枝桿菌中的作用,我們通過基因同源重組技術構建了海分枝桿菌ppk(MMAR_1730)基因的缺失突變株。通過壓力實驗、耐藥性實驗、巨噬細胞和斑馬魚感染實驗,對PPK在海分枝桿菌中的作用進行了初步的探索。

材 料 和 方 法

菌株和質粒 海分枝桿菌ATCCBAA-535(M菌株)由加拿大多倫多大學的劉軍教授饋贈;質粒pPR27由法國巴斯德研究所Gicquel B教授惠贈;綠色熒光質粒pTEC15由美國華盛頓大學Ramakrishnan L教授惠贈;pMV306由倫敦帝國學院的 Young D 教授饋贈。

主要試劑和儀器 膠回收試劑盒、PCR產物回收試劑盒、質粒抽提試劑盒(天根生化科技);逆轉錄試劑盒(日本Takara 公司);Cary Eclipse熒光分光光度計(美國Varian 公司);熒光定量PCR儀CFX96(美國Bio-Rad 公司);Nanodrop 2000超微量分光光度計(美國ThermoFisher公司)。

動物和細胞 斑馬魚成魚于實驗室內繁育飼養。小鼠來源巨噬細胞系RAW264.7購自中科院生化所。

細菌培養 大腸埃希菌培養基為LB培養基,37 ℃培養。海分枝桿菌培養基為Middlebrook 7H9肉湯培養基(液體)和Middlebrook 7H10瓊脂培養基(固體),32 ℃培養。必要時添加抗生素:卡那霉素40 μg/mL,潮霉素50 μg/mL,Rif 4 μg/mL,左氧氟沙星(lavo-ofloxacin,Levo)10 μg/mL。

海分枝桿菌ppk基因敲除突變株構建 使用經典的同源重組技術,通過pPR27-wasabi質粒進行反向篩選,構建海分枝桿菌ppk基因突變株。原有的pPR27質粒帶有2個反向篩選標記:sacB基因及1個分枝桿菌溫敏復制起點[20]。但是,海分枝桿菌最適生長溫度為32 ℃,無法在39 ℃高溫下存活,所以pPR27質粒上的溫敏篩選并不適用于海分枝桿菌。因此,我們額外引入了wasabi綠色熒光蛋白來進行敲除菌株的篩選。用引物wasabi_R/wasabi_F從pTEC15質粒上擴增wasabi片段,連接到pPPR27質粒,構建pPR27-wasabi質粒。用引物MMppkKO Fw/MMppkKO Rv(表1)擴增海分枝桿菌ppk基因及其兩端各約1 kb的同源區域,連接入T載體中,BglⅡ/PstⅠ酶切,去除ppk基因片段,并膠回收長片段,引物Hyg_Fw/Hyg_Rv PCR擴增hyg基因片段,BglⅡ/PstⅠ酶切后連入上述長片段,將重組質粒SpeI酶切得到含有ppk基因兩端同源臂及hyg基因的片段即為等位交換底物(allelic exchange substrate,AES)。將AES 連接入 pPR27_wasabi 質粒(SpeI)中,電轉化入海分枝桿菌,涂布于潮霉素 B 抗性的 7H10-OADC 平板上,挑取單克隆培養至對數期,轉接后大量培養,制備單細菌(約 5×106CFU),涂布于含10%蔗糖的潮霉素B抗性平板上;通過熒光顯微鏡進行反向篩選,挑取無熒光單克隆進行 PCR 鑒定。

表1 引物名稱和序列

海分枝桿菌ppk基因敲除互補株構建 引物MMppkCO_Fw/ MMppkCO_Rv擴增包含ppk基因編碼序列及其上下游序列在內的DNA 片段,PCR產物純化,回收后的DNA片段及質粒pMV306分別使用相應的限制性內切酶酶切,回收后連接,轉化入大腸埃希菌 DH5α并抽提質粒。抽提的質粒經過 PCR鑒定正確后再進行測序鑒定。鑒定正確后分別電轉化進入海分枝桿菌,構建海分枝桿菌ppk基因敲除互補株。

海分枝桿菌胞內poly-Pi檢測 收集海分枝桿菌,使用100 mmol/L的Tris鹽酸緩沖液(pH=7.4)洗滌3次后重懸細菌,使用熒光分光光度計進行測量(海分枝桿菌懸液D600值不低于0.2)。EP管中加入2 mL細菌懸液,再加入1 mmol/L的DAPI溶液20 μL,使其終濃度為10 μmol/L,即刻用錫箔紙包裹,避光混勻5 min;立刻加入干凈的透明比色皿,置于熒光分光光度計中進行測量,系統自動記錄450～650 nm每1.0 nm的發射光值。選取550 nm處記錄值,與測量菌液的D600進行標準化處理后,即可得到每1.0單位D600的菌胞內poly-Pi的相對量。

體外H2O2壓力實驗 細菌于7H9-OADC培養基中培養至對數生長期(D600=0.5～1.0),常溫下10 528×g離心5 min,收集細菌并用玻璃珠震蕩打散成單細菌,PBS洗滌2次后調整D600至0.3,以終濃度為 10 mmol/L H2O2處理2 h,同時設置未處理對照組,對細菌進行鋪板計數,比較野生株及突變株對H2O2的敏感性。

體外營養缺陷實驗 細菌于7H9-OADC培養基中32 ℃培養至對數生長期(D600=0.5～1.0),常溫下10 528×g離心5 min,收集細菌并用玻璃珠震蕩打散成單細菌,使用PBS-Tween 80洗滌細菌3次后,重懸于PBS-Tween 80,將單細菌懸液的D600值調整至0.1,按1∶10稀釋至0.01。將細菌懸液移入透氣培養瓶中,32 ℃旋轉培養(100 r/min)。并于2、4、6天后收集100 μL細菌懸液,鋪板計數。

體外十二烷基硫酸鈉實驗 細菌于7H9-OADC培養基中32 ℃培養至對數生長期(D600=0.5～1.0),常溫下10 528×g離心5 min,收集細菌并用玻璃珠震蕩打散成單細菌,將單細菌懸液的D600值調整至0.02和0.002,分別吸取5 μL菌液懸滴于含有0.02%十二烷基硫酸鈉(SDS)的7H10-OADC平板上,于32 ℃培養7天,觀察菌落形態。

海分枝桿菌的藥敏實驗 細菌于7H9-OADC培養基中培養至對數生長期(D600=0.5～1.0),常溫下10 528×g離心5 min,收集細菌并用玻璃珠震蕩打散成單細菌,調整D600至 0.1,加入Rif(終濃度分別為4和10 μg/mL),Levo處理,32 ℃旋轉培養(100 r/min)。分別于處理3、7天后收集100 μL細菌懸液,鋪板計數。

斑馬魚成魚腹腔注射感染 制備海分枝桿菌單細菌,將菌液稀釋到1×106CFU/mL。成年斑馬魚用0.02%的三卡因溶液麻醉3～5 min。使用無菌HPLC 級微量進樣器注射,每條魚10 μL菌液,即1×104CFU,于泄殖腔附近行腹腔注射;對照組注射相同體積PBS。觀察感染后不同時間點的斑馬魚存活狀況。

海分枝桿菌在巨噬細胞內的增殖檢測 小鼠來源巨噬細胞系RAW264.7采用含10% FBS 的DMEM培養基中,置于37 ℃、0.5% CO2培養箱中培養。胰酶消化細胞,計數細胞并調整濃度為105/mL。將上述細胞懸液加入24 孔培養板中(1 mL/孔),37 ℃、5%CO2培養24 h,使單層細胞貼于板壁上即可應用于侵染實驗。制備單細胞懸液,每孔加入1 mL上述菌液,共培養4 h(MOI=1)。在指定時間點去除培養基,每孔加入0.1 mL 0.1%Triton X-100,于32 ℃培養箱中孵育15 min,裂解細胞,胞內的細菌用無菌PBS梯度稀釋并鋪板,于32 ℃培養,進行CFU計數。

統計學分析 采用Graphpad 5.0軟件對所有數據進行統計學處理,差異顯著性采用雙側t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

ppk在分枝桿菌中的序列保守度分析 在海分枝桿菌中,ppk基因由MMAR_1730編碼。通過生物信息學分析,我們發現,MMAR_1730與結核分枝桿菌Rv2984(ppk1)和恥垢分枝桿菌MSMEG_2391(ppk1)高度同源,其氨基酸序列一致性分別為 89%和94%(圖1),提示ppk基因在分枝桿菌中高度保守,因此海分枝桿菌ppk基因很有可能與結核分枝桿菌ppk1發揮相似的功能。

海分枝桿菌ppk基因的敲除與鑒定 為了研究海分枝桿菌中ppk基因的功能及poly-Pi的調控方式,我們使用經典的同源重組技術,通過 pPR27-wasabi質粒進行反向篩選,構建海分枝桿菌ppk基因的敲除菌株。抽提基因組,用ppk敲除鑒定引物1和2進行PCR驗證(表1),敲除成功的菌株ppk基因內插入了Hygromycin抗性基因(圖2A),經PCR及測序驗證后證明海分枝桿菌ppk突變株構建成功(圖2B),繼續構建ppk基因敲除互補株。使用DAPI-poly-Pi染色法檢測細菌胞內poly-Pi水平,結果顯示ppk突變株胞內poly-Pi濃度下降至約15% (P<0.01,Student′st檢驗,圖2C),證明PPK在海分枝桿菌中與ploy Pi的合成相關,敲除ppk基因后ploy Pi的濃度明顯降低。

ppk基因缺失對壓力環境下細菌生存的影響 已知poly-Pi能作為信號分子參與細菌對環境壓力的應激性應答[18-19]。為了研究海分枝桿菌ppk基因缺失是否影響細菌在壓力環境下的生存,我們分別檢測了突變株在H2O2處理和營養缺陷狀態下的生存能力,及其對細胞壁裂解劑SDS的敏感性。結果發現,突變株經10 mmol/L H2O2處理2 h后的生存能力較野生株無顯著差異(圖3A);在PBS模擬的營養缺陷環境中培養6天后,突變株的生存率下降了 60%,而野生株未見明顯下降。在Δppk菌株中互補該蛋白使表型差異得以恢復(圖3B)。在含有0.02% SDS的平板上,突變株失去了生長的能力,野生株仍然可以正常生長并形成完整的菌落形態(圖3C)。以上結果說明PPK對于海分枝桿菌在營養缺陷和細胞壁壓力環境下的生存十分重要。

ppk基因缺失增強海分枝桿菌的藥敏性 結核分枝桿菌poly-Pi的累積被認為與藥物的耐受性相關[19]。為了證實這一點,我們將海分枝桿菌野生株、ppk突變株及互補株分別用Rif和Levo處理。結果顯示(圖4):用Rif及Levo處理3天后,突變株菌量下調至20%;用Rif處理7天后,突變株菌量下調至10%;用Levo處理7天后,突變株菌量下調至6%。這些結果說明ppk基因的缺失使海分枝桿菌對某些藥物更加敏感。

ppk基因缺失對海分枝桿菌在巨噬細胞內增殖的影響 為了進一步研究ppk基因的缺失是否影響分枝桿菌在巨噬細胞內的存活,我們分別用野生株、突變株和互補株感染小鼠來源的巨噬細胞株 RAW264.7,CFU鋪板計數結果顯示,ppk基因缺失使突變株無法在巨噬細胞內增殖,而互補株使表型差異得以全部恢復(圖5)。由此提示PPK對于海分枝桿菌在巨噬細胞內的增殖是必需的。

ppk基因突變株在斑馬魚模型中呈現減毒表型為了進一步研究ppk基因對宿主的致病作用,我們分別用1×104CFU劑量的野生株、突變株及互補株分別感染斑馬魚模型,比較不同菌株的毒力。結果顯示,在感染的25天內,對照組(PBS)及突變株組斑馬魚沒有出現死亡,而被野生株及互補株感染的斑馬魚在1周后逐漸出現活力降低、腹部腫脹等癥狀,直至死亡。斑馬魚生存曲線如圖6所示,可見野生株和互補株感染的斑馬魚分別從第10天和第11天開始死亡,而被突變株感染的斑馬魚直至觀察結束沒有出現死亡。這一結果說明ppk基因對于海分枝桿菌的致病十分重要。

A:Schematic representation of MT strains.The region containingppkhas been replaced by the hygromycin cassette allelic exchange substrate.B:The PCR result using WT and MT as the template and usingppkPR1 andppkPR2 as the primer.C:Measurement of intracellular poly-Pi inM.marinum.Poly-Pi concentration was determined by the fluorescence emission of DAPI-poly-Pi complex at 550 nm.AU:Arbitrary fluorescence emission units;WT:Wild type;MT:Mutant type.(1)P<0.01.

圖2 海分枝桿菌ppk突變株構建及鑒定

Fig 2 The construction and identification ofppkmutant inM.marinum

A:Survival of WT,MT and complement strain after exposure to H2O2.Aliquots (1 mL) of culture atD600of 0.3 were exposed to PBS(control) or 10 mmol/L H2O2for 2 h at 32 ℃.The cultures were serially diluted and plated onto 7H10+OADC plates and the colonies counted after 7-10 days of incubation at 32 ℃ (P>0.05).B:WT,MT and complement strain were grown in PBS for 7 days at 32 ℃.Mycobacteria CFUs were determined at the indicated time points.Data were generated from 3 independent experiments.(1)P<0.05,Student’sttest.C:The growth of WT,MT and complement strain on 7H9+OADC agar with or without 0.01% SDS were visualized after 7-10 days of incubation.WT:Wild type;MT:Mutant type.

圖3 海分枝桿菌對壓力環境的敏感性

Fig 3 The sensitivity ofM.marinumto external stress

Different strains were grown atD600of 0.1.These cultures were diluted and exposed to Rif (4 μg/mL) and Levo (10 μg/mL) for 3 or 7 days at 32 ℃.The percentage of survival was measured in the culture after incubation with the drug relative to it before the addition of drug.Data were generated from 3 independent experiments.(1)P<0.05;(2)P<0.01.

圖4 海分枝桿菌的藥敏性

Fig 4 Drug tolerance ofM.marinum

討 論

RAW 264.7 cells were co-cultured with WT,MT and complement strain at an MOI of 1 for 4 h at 32 ℃.Data were generated from 3 independent experiments.(1)P<0.01,(2)P<0.001 (Student’sttest).

圖5 海分枝桿菌在巨噬細胞內的生存情況

Fig 5 Intracellular survival ofM.marinumin macrophage

The zebrafish were infected with WT,mutant,complent strain and PBS by intraperitoneal injection (for each group,n=30).The injection dose was about 1×104CFU per fish.

圖6 斑馬魚感染海分枝桿菌后的生存曲線

Fig 6 Survival curve of the zebrafish infected withM.marinum

在本研究中,海分枝桿菌ppk基因缺失后,細菌在營養缺陷環境中的生存能力顯著下降,對Rif和Levo更加敏感。這說明poly-Pi在細菌對環境壓力的應答中發揮重要的作用。我們還發現ppk突變株在巨噬細胞中的增殖被抑制,在斑馬魚感染模型上呈現完全減毒表型,這些都提示ppk基因對分枝桿菌的致病非常重要。

在結核桿菌中的研究表明,poly-Pi的缺失導致“應激反應調節子”——ppGpp合成基因relA的表達下調和ppGpp含量降低[3],而ppGpp為細菌應答饑餓環境刺激所必需的物質。在大腸埃希菌中的研究表明,在營養缺陷環境下poly-Pi可以和蛋白酶體Lon結合,促進蛋白質降解,產生氨基酸來應對營養缺陷[6]。在海分枝桿菌中,poly-Pi的缺失可能也是通過這些途徑導致突變株在這一環境下生存能力下降。

本研究結果顯示,海分枝桿菌ppk基因敲除株對SDS更敏感。Sureka等[18]在結核分枝桿菌的研究中發現,SDS處理組與非處理組相比,胞內的poly-Pi濃度也顯著增高,敲除結核分枝桿菌ppk1基因,細菌對SDS更敏感。結核分枝桿菌relA基因突變引起眾多細菌細胞壁合成相關基因的表達改變,提示分枝桿菌的應激反應與細胞壁的重塑性有關[21]。代謝組學研究發現,結核分枝桿菌體內poly-Pi水平失衡導致脂肪酸合成降低,提示poly-Pi在調控細菌細胞壁合成中發揮重要作用[22]。

本研究發現海分枝桿菌ppk基因敲除菌株對Rif和Levo更加敏感,說明poly-Pi對于細菌應對抗生素壓力非常重要。Singh等[19]用Rif、Levo、慶大霉素處理結核分枝桿菌,發現與非處理組相比,ppk基因的表達顯著上調,胞內poly-Pi濃度顯著增高。由此說明,ppk1基因缺失后,細菌對Rif、異煙肼、Levo等抗生素也更加敏感。對銅綠假單胞菌的研究發現,ppk基因缺失后細菌也對β-內酰胺類抗生素更加敏感。poly-Pi的累積可能誘導細菌進入低代謝狀態,而代謝不活躍的細菌更容易在體內形成耐藥性。突變株則可能因為poly-Pi的減少而改變細菌的代謝水平,因此更易被藥物清除。

在結核分枝桿菌中,PPK1的缺失引起細菌在巨噬細胞內出現生長缺陷以及在豚鼠感染模型上的毒力顯著減弱。本研究發現海分枝桿菌ppk基因突變株在巨噬細胞中的增殖被抑制,在斑馬魚感染模型上呈現完全減毒表型,提示ppk基因對分枝桿菌的致病非常重要。但是對于ppk基因的功能及其影響毒力的具體機制,目前尚不清楚。有研究顯示poly-Pi調控細菌細胞壁合成[22],由此推測ppk基因缺失可能會導致細菌對宿主的某些殺傷機制更加敏感。

綜上所述,本研究證實了ppk對于海分枝桿菌在壓力環境下的生存具有重要作用,poly-Pi降低則細菌對藥物的敏感性增加,并且與細菌的毒力減弱相關,這些結果都揭示了poly-Pi與分枝桿菌持續性感染之間的聯系。ppk缺失引起的poly-Pi水平下降有可能改變ATP水平、NAD+/NADH比值及細菌的氧化還原狀態,這些都與細菌的持續性感染相關,在此基礎上還需要進一步的實驗研究去探索poly-Pi在細菌生理和持續性感染中的作用。

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The biological function of ppk gene in Mycobacterium marinum

ZHU Lin, SHI Xu-jun, GAO Qian△

(KeyLaboratoryofMedicalMolecularVirology,MinistryofEducationandHealth,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Objective To construct theppkmutant inMycobacteriummarinum(M.marinum) and to investigate its role in the physiology. Methods Theppkmutant inM.marinumwas constructed by homologous recombination.Intracellular poly inorganic phosphate (poly-Pi) concentration was measured in cell suspensions by using a DAPI-based fluorescence approach.Theninvitrobacterial viability ofppkmutant type and the wild type strain was compared under different stress conditions.Furthermore,invivomycobacterial virulence was checked by infecting the adult zebrafish with mutant and wild type strain.And the intracellular growth ability was investigated by infection of the murine macrophage cell line RAW267.4. Results The intracellular poly-Pi concentration ofM.marinumwas significantly decreased after the deletion ofppkgene.In addition,theppkmutant displayed attenuated phenotype in the zebrafish model.In mice-derived macrophage cell line,the cell proliferation ofppkmutant type declined significantly compared with wild type.Moreover,theppkmutant type was more sensitive to nutrient starvation and antibiotic treatment,including rifampicin and levo-floxacin.Conclusions These results indicate thatppkis involved in stress response and required for mycobacterial virulence.

mycobacterium; polyphosphate kinase; poly inorganic phosphate

Q933

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.003

2016-01-21;編輯:段佳)

△Corresponding author E-mail:qgao99@yahoo.com