利用SSR標記構建水稻核心親本指紋圖譜

曾曉珊，彭 丹，石媛媛，謝 偉，劉愛民

(袁隆平農業高科技股份有限公司，湖南長沙 410006)

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利用SSR標記構建水稻核心親本指紋圖譜

曾曉珊，彭 丹，石媛媛，謝 偉，劉愛民*

(袁隆平農業高科技股份有限公司，湖南長沙 410006)

利用農業行業標準(NY/T 1433-2014)中公布的48對SSR引物構建27個水稻核心親本指紋圖譜，并獲得所有親本的SSR分子身份證號。48對SSR引物在27個親本中共擴增到162個多態性片段，平均每對引物可檢測到3.53個等位基因。能擴增到2個以上等位基因的SSR引物共45對，PIC值變化范圍0.07～0.80，平均0.46。聚類分析結果表明，27個親本的遺傳相似性系數在0.593～0.944之間，基本上反映了不同材料間的親緣關系。核心親本SSR分子身份證的確定，不僅為品種鑒定提供了一個平臺和標尺，便于建立品種的遺傳指紋檔案，還為保護品種知識產權，鑒定品種真偽及純度提供了可靠依據。

水稻；核心親本；SSR標記；指紋圖譜；分子身份證

水稻是我國的主要糧食作物之一。近年來，參加區試的水稻新品種每年呈遞增趨勢。傳統的水稻新品種特異性、一致性和穩定性(DUS)測試因鑒定周期長、鑒定結果易受環境影響等原因，已不能滿足現代新品種快速選育及推廣的要求。基于重復基元重復次數變化的等位位點多態性，賦予了SSR標記能較好反應品種間遺傳多樣性的特點，使其能用于品種鑒定的研究。莊杰云等[1]利用24個SSR標記構建了103個水稻主栽品種的分子指紋圖譜數據庫，并對數據庫中各個標記、各組材料表現進行分析，剔除了1個假雜交稻。McCouch等[2]利用6個SSR標記鑒別了71個相似水稻品種。目前國際新品種保護聯盟(UPOV)已將SSR標記用于新品種的DUS測試中。我國農業部亦出臺了相應方法標準[3]用于水稻品種鑒定。但隨著育種進程的發展，少量親本的延續使用，新品種間的遺傳差異越來越小，品種間相似性逐漸增加。為滿足新品種鑒定和市場監管的需要，農業部新制定了《NY/T 1433-2014 水稻品種真實性鑒定方法》[4]作為水稻新品種鑒定的標準。該方法在SSR標記數目、檢測方法等方面進行了修改、補充。

利用SSR標記構建的指紋圖譜，不僅可應用于品種保護，還可用于品種真實性及純度鑒定。彭鎖堂等[5]利用SSR標記RM17檢測雜交水稻‘汕優63’和‘兩優培九’種子，純度分別為96.0%和98.0%，與田間測定結果96.2%和97.7%接近。同時，通過計算親本間遺傳距離，利用UPGMA法進行聚類分析，可明確各品種間的遺傳差異，對科學配制雜交組合、預測雜種優勢、提高抗病蟲高產的育種效率等具有指導作用。陳躍進等[6]利用55個SSR標記研究23個品種的親緣關系，采用UPGMA構建系統樹和計算遺傳距離，結果表明，23個品種分為秈型、粳型、偏秈型、偏粳型等4類。其中，偏秈型品種之間和偏粳型品種之間的親緣關系均較遠，選用他們作為親本，可提高雜種優勢。因此，建立一套水稻品種的標準指紋圖譜數據庫，對于假種鑒別、保護育種的知識產權與育種者的權益意義重大。

本研究利用NY/T 1433-2014所推薦的48對SSR標記物，構建27個水稻核心親本的分子指紋圖譜，并在此基礎上對品種間的遺傳相似性進行分析，從分子水平上為水稻育種、品種鑒定以及種子生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用27個水稻核心親本包括：H032、R1128、R19、R2010、R608、華占、R299、R012、R1341、R571、R130、黃華占、R248、R9595、R199、R2469、R1102、R527、R0293、R812、R116、R1813、R618、R534、黃莉占、R4024、H472，均由湖南隆平種業有限公司提供。親本分別在三亞、長沙種植，經嚴格去雜后收獲。為保證供試材料的真實性和純度，種子純度嚴格按照國家標準GB4404.1[7]的規定檢測，種子分樣和保存按照GB/T3543.2[8]的規定進行。

1.2 DNA提取

水稻種子不少于30粒，催芽3～4 d后，取胚芽，按CTAB法[9]混合提取DNA，并溶解于200 μL 0.1×TE中，儲于-20℃冰箱中。

1.3 DNA定量及PCR擴增

利用NaroDrop 2000 DNA微量檢測儀將DNA濃度調整至50 ng/μL，用于PCR擴增。PCR反應體系為20 μL：模板DNA2.0 μL，25 mmol/L buffer 2.0 μL，10 pmol/μL引物2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP1.6 μL，5 U/μL TaqDNA聚合酶0.2 μL，雙蒸水12.2 μL。反應在ABI 9700 PCR儀上進行。PCR反應程序：95℃預變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個循環；72℃再延伸7 min；最后10℃保存。擴增產物于4℃冰箱保存備用。

1.4 擴增產物電泳及檢測

在每管PCR擴增產物中加入4 μL上樣緩沖液，充分混勻，于3000 rpm瞬時離心。用10 μL八道排槍取2.0 μL PCR產物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳(200 V，60 min)。電泳結束后，取出凝膠，于0.1% AgNO3溶液并輕搖銀染8～10 min。之后用蒸餾水漂洗1次(20 s)；再將凝膠置于顯影液(15.0 g/L NaOH，0.4%甲醛溶液)中，待凝膠適度著色后，取出凝膠，在凝膠成像系統的白光燈下拍照并記載位點。

1.5 SSR引物

本研究所用SSR引物，為國家行標NY/T 1433-2014所推薦，用于水稻品種真實性鑒定的4組、共48對引物(表1)。

1.6 指紋圖譜構建

按1.4的方法，得到48對SSR引物對27個水稻親本的電泳圖譜。SSR引物按其先分組(共4組)，后按染色體號由小到大順序排列(表1)，組成構建指紋圖譜的SSR引物組合。27個水稻親本按表1中順序排列，每個水稻親本在48對SSR引物上的圖譜組合，便構成這些品種的特異SSR指紋圖譜。

1.7 親本SSR指紋圖譜身份證號

對任意一對SSR引物得到的指紋圖譜條帶，根據其分子量大小對所有復等位位點從大到小依次進行阿拉伯數字編號。按1.6方法中親本、引物的排列左右順序，獲得27個水稻親本在48對引物中的等位位點對應具體數值。每個親本在48對引物上的等位位點數值組合便組成其SSR指紋圖譜身份證號。對于含兩個帶型的以分數形式表示，但只占一個數位。指紋圖譜身份證號48位制固定不變，每個數位代表的SSR引物位置固定不變。

1.8 數據統計與分析

SSR擴增產物以“0”、“1”統計帶型，親本對應PCR產物在電泳圖中有條帶出現賦值為“1”，無條帶出現賦值為“0”；缺失賦值為“9”，以此方法建成Excel數據表。每2份親本間的遺傳差異按Nei等[10]的方法求算遺傳相似系數(GS)和遺傳距離(GD)：

GS=2Mxy/(Mx+My)

GD=1-GS

式中：Mx和My分別為x和y兩親本的總片段數，Mxy為兩材料的公共片段數。

根據所得遺傳相似系數，用非加權平均數UPGMA方法(unweighted pair group method using arithmetic averages)進行遺傳相似性聚類。以上運算通過NTSYS-pc Version 2.10軟件[11]進行(軟件中參數為DICE)。

根據Smith等[12]報道的方法計算每1對SSR引物的多態性信息含量指數(polymorphic information content，簡稱PIC值)：

式中：fi表示第i種等位基因(alleles)的頻率。

以上運算通過生物學軟件POPGENE 1.31進行。

2 結果與分析

2.1 SSR引物多態性及品種鑒別

48對引物在27個親本中共擴增到162個多態性片段，第I、II、III、IV組標記各獲得49、41、37、35個多態片段。除RM85、RM423及RM567在27個親本中僅檢測到1個片段外，其他標記均可擴增到2個及2個以上等位基因，平均每對引物可檢測到3.53個等位基因(表1)。45個SSR位點的PIC值變化范圍0.07～0.80，平均為0.46。等位基因數超過平均值的標記有17個；PIC值超過平均值的標記有25個。在兩類大于平均值的指數中，共同出現的引物有15對，分別為RM583、RM71、RM336、RM311、RM209、RM208、RM232、RM258、RM224、RM493、RM21、RM424、RM289、RM332和RM7102。這些引物的等位基因數越多，PIC值越高，區分品種能力也越強。圖1為引物RM7102對27個親本材料的擴增結果。

在162個等位基因中，有28個只存在1個品種，其中涉及到19對引物及14個水稻親本(表2)。這些特異等位位點的特征譜帶將有助于識別和鑒定相應水稻品種。

表1 27份雜交水稻核心親本SSR指紋標記等位基因數及多態性信息指數(PIC值)Table 1 The allele number and PIC of 27 hybrid rice core parental lines based on SSR fingerinting markers

表2 雜交水稻核心親本特征性標記Table 2 Characteristic markers of hybrid rice core parent lines

2.2 SSR指紋圖譜構建

利用48對引物，依次對27個水稻親本材料基因組DNA(按順序排列)進行PCR擴增，經顯影、拍照，得到一套SSR引物的圖譜(圖1)。根據所構建的指紋圖譜，可對某一品種的真實性進行鑒定。

圖1 RM7102對27個雜交水稻核心親本的擴增結果Fig.1 Amplification profile of 27 hybrid rice core parental lines at RM7102

2.3 SSR指紋身份證系統數據庫構建

利用得到的Excel數據，構建SSR指紋身份證數據庫。27個水稻親本材料的SSR指紋身份證號見表3。由表3可見，6對引物檢測到了雜合位點，分別為RM209、OSR28、RM590、RM571、RM316和RM7102。

表3 27個雜交水稻核心親本的SSR指紋身份證號Table 3 The SSR Molecular identity cards of 27 hybrid rice core parent lines

(續表3)

以SSR標記遺傳相似系數為原始數據，用UPGMA法對所有供試親本材料進行聚類分析，并繪制成樹狀圖(圖2)。根據樹狀圖，可直觀地了解親本間的親緣關系遠近。以相似系數0.667為閾值，R4024為單獨類群，與其他26個親本差異最大；以相似系數0.704為閾值，可將26個親本分為兩個亞群：第一亞群包含H032和R1128，第二亞群包含其余24個親本。第二亞群在相似系數0.710閾值處又可分為2個亞群，A亞群的親本攜帶蜀恢527、明恢63等血緣；B亞群親本的遺傳相似性反映了不同地理緯度的關系。

圖2 27個水稻核心親本UPGMA聚類分析圖Fig.2 UPGMA clustering for 27 rice core parent lines

3 討論

隨著近年來水稻新品種的逐漸增多，多數品種遺傳基礎不斷變窄，對于品種一致性、穩定性鑒定方法，需要不斷完善。我國制定的《NY/T 1433-2014 水稻品種真實性鑒定方法》，不僅增加了檢測標記的數量，還對檢測方法、檢測流程作了詳細的規范，為新《種子法》在種質特異性、一致性、穩定性及品種審定、種子安全生產經營等方面提供了依據。

為確保研究結果與國家標準的一致性，本研究以國標規定的水稻品種真實性鑒定方法中要求的48對引物，對27個親本進行了DNA指紋分析。首先，在特異性中發現，RM85、RM423及RM567在27個親本中間無多態；RM17、RM219等標記的等位位點數及PIC值遠低于平均值。這說明，27個親本品種間有較高的平均遺傳相似系數，但親緣關系很近。這與前人認為我國當前水稻品種遺傳基礎較狹窄的結果一致[14，15]。其次，本研究中所用SSR標記具有代表性。一方面，聚類分群的結果與傳統系譜對水稻的劃分情況基本一致；另一方面，本研究中檢測到的等位基因數和PIC值超過平均值的標記15個，等位基因數和PIC值均低于相關平均值的標記。在其他來源品種的研究中，等位基因數和PIC值均都較高，如黃瑞等[16]在構建非洲水稻種質資源SSR指紋圖譜時，RM85、RM17、RM219的等位基因數分別為4、5、9，PIC值分別為0.463、0.658和0.823。這說明本研究所采用的指紋標記本身具有較高的代表性，由這些標記所構建的分子指紋圖譜在品種鑒定、品種選育及種子管理等方面具有現實意義。

DNA分子指紋圖譜以可見的譜帶形式來表示各品種DNA的組成。通過對譜帶進行條帶賦值，構建品種指紋圖譜數據和分子身份證庫，可實現計算機管理。判斷新選育組合是否是水稻新品種，只需將其指紋信息或分子身份證輸入數據庫，與現有品種進行比較，可達到鑒定目的。本研究已構建了27個親本的分子身份證數據庫，隨著后期研究深入，已構建的數據庫會有一定的局限性。這就需要繼續往數據庫中添加品種及其SSR指紋身份證號，進一步豐富和完善數據庫。

對育種家而言，了解品種親緣關系的遠近是育種工作的基礎。根據指紋圖譜中所計算的品種間遺傳距離，經UPGMA法所構建的品種間親緣關系樹狀圖，可直觀地看出各品種間的遺傳差異。根據Xiao等[17]和趙慶勇等[18]的研究結果，聚類分析結果能較好地預測亞種內的雜種優勢，而亞種間的相關程度不足以預測產量雜種優勢。本研究所選用的親本均為秈稻品種，指紋圖譜及聚類分析結果對于科學配制雜交組合、預測雜種優勢具有一定指導作用，并為下一步的分子設計育種打下基礎。

種子混雜、外來花粉授粉造成種質資源的變異及遺傳漂變造成的改變是導致親本不純的主要因素。為長期保存種質資源，可利用SSR標記來有效鑒定各親本材料，以確保保存材料的真實性。本研究中還檢測到14個親本具有特征性標記，在進行入庫前的真實性和純度檢測時，可優先選用這些標記。

研究中，筆者還發現了7個標記雜合位點，這說明親本可能不完全純合。根據前人的研究報道[1]，這些雜合位點可能引起剩余遺傳效應，導致雜交稻與其親本不匹配，品種不穩定遺傳等情況。田大剛等[19]認為，這種不穩定遺傳的情況是廣泛存在的。對于本研究中遺傳不穩定的標記，在品種一致性、穩定性及雜種純度檢測的研究中，盡量不選擇使用；在品種選育過程中，需緊密結合大田選育，以獲得具有目標性狀、穩定遺傳的新種質/材料。

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Fingerprinting Construction of Rice Core Parental Lines with SSR Markers

ZENG Xiaoshan，PENG Dan，SHI Yuanyuan，XIE Wei，LIU Aiming*

(Yuanlongping High-Tech Agriculture CO.LTD.，Changsha，Hunan 410006，China)

Fingerprinting profiles and molecular identity cards of 27 rice core parental lines were established using 48 SSR markers recommended by “Sector Standard of Agriculture (NY/T 1433-2014)”.Total 162 Polymorphic fragments were detected with an average of 3.53 alleles for each SSR primer.Each of the 45 SSR primers are amplified more than 2 alleles respectively，theirPIC(polymeric index content) values ranged from 0.07 to 0.80，and the average PIC value is 0.46.Result from cluster analysis showed that genetics similarities among the 27 lines ranged from 0.593 to 0.944，which reflected basically the genetic relatives based on the pedigree analysis.Varietal genetic files were developed based on the established fingerprinting profiles and molecular identity cards，and found that it performed well in intellectual property rights protection，varietal identification and purity testing.

rice；core parental lines；SSR markers；fingerprinting；molecular identity cards

2016-04-20

曾曉珊(1977-)，女，副研究員，博士，主要研究方向為分子輔助育種，mail：zengxiaoshan@lpht.com.cn。*通信作者：劉愛民，Email：lam@lpht.com.cn。

公益性行業(農業)科技專項(201303005)。

S511.032

A

1001-5280(2016)05-0481-06

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.05.01