基于NaYF4：Yb,Er上轉換熒光納米顆粒精準檢測DNA

毛蘭蘭　張立明　鄧燕　呂卓璇＊,　何農躍＊,,2

基于NaYF4：Yb,Er上轉換熒光納米顆粒精準檢測DNA

毛蘭蘭1張立明1鄧燕1呂卓璇＊,1何農躍＊,1,2

(1湖南工業大學綠色化學與生物納米技術應用湖南省重點實驗室，湖南省高等學校2011協同創新中心“經濟林培育與利用”生物芯片分中心，株洲412007)
(2東南大學生物電子學國家重點實驗室，南京210096)

建立了一種利用堿基堆積原理并以上轉換納米粒子熒光作為內參的精準檢測DNA的方法。該方法首先利用熱分解法制備NaYF4:Yb,Er上轉換熒光納米顆粒(upconversion nanoparticles，UCNPs)，再通過表面羧基化變性牛血清蛋白修飾后與氨基化探針核酸單鏈共價偶聯，形成上轉換熒光標記顯示探針。最后再基于堿基堆積原理進行雜交檢測。研究結果表明以NaYF4:Yb,Er熒光強度為內參，根據FAM/UCNP的強度比來定量檢測目標DNA濃度比單一的以報告DNA中FAM熒光強度定量檢測目標DNA濃度要更為精準，有效地避免了實驗中出現的人為操作和儀器誤差。本方法不需要進行擴增，檢測底限可達到5 nmol·L-1，且在較大的濃度范圍內有較好的線性關系，同時該方法也有著良好的特異性，能有效區分單堿基錯配序列。

NaYF4:Yb,Er；DNA檢測；內參；精準性

0　引言

上轉換稀土納米材料是近年來新興的稀土熒光材料，是由鑭系稀土元素摻雜的氧化物、硫化物和氟化物等構成[1-4]。它能夠通過多光子機制把長波輻射(近紅外光)轉換成短波輻射，發射出比激發光波長更短的熒光(可見光)。與傳統的下轉換熒光標記物如有機染料、熒光蛋白、量子點等相比，上轉換稀土熒光納米材料具有化學穩定性好、發光強度高而穩定、毒性低、生物相容性好和反Stokes位移大等優點[5-10]。另外，因近紅外光為上轉換稀土納米材料的激發光源，將其用于生物體內，可以有效地避免生物體內自發熒光的干擾，同時對生物組織有良好的穿透能力，能有效地提高檢測的靈敏度和信噪比[11]。基于稀土上轉換熒光納米材料這些無可替代的優點，其在生物標記和生物檢測等領域有著巨大的應用潛能。此外，NaYF4:20%Yb,2%Er UCNPs是目前在生物醫學領域中應用最為廣泛的稀土納米材料之一[12-13]，它能在980 nm激光器的激發下，發出肉眼可見且穩定的綠色熒光，將其用于生物標記和檢測中，具有著很大的優勢。因此，尋找高效、快捷、形貌可控的上轉換稀土納米材料合成與表面修飾技術，具有十分重要的理論與現實價值。堿基堆積原理是指當兩條或多條連續的寡核苷酸鏈與一條長的互補的單鏈DNA或RNA雜交后，這些短的寡核苷酸鏈可以獲得額外的穩定性。在本實驗中，只有當目標DNA存在時，才可幫助捕獲探針與報告探針穩定結合，通過雜交反應從而獲得檢測信號(如圖1所示)。本研究通過利用羧基化變性牛血清蛋白修飾的NaYF4: Yb,Er UCNPs作為標記物與DNA探針結合，再根據堿基堆積力原理，將長鏈目標DNA和FAM熒光基團標記的短鏈報告DNA與UCNPs修飾的捕獲探針DNA進行雜交。離心洗滌后，通過NaYF4:Yb,Er UCNPs的熒光強度作為內參，確定DNA標準品與FAM/UCNP的信號強度比值的線性關系，從而進行目標DNA的檢測。多次實驗驗證表明，以UCNPs熒光強度作為內參標準的方法能夠有效地避免實驗中出現的人為操作和儀器誤差，比單一的以報告探針的熒光信號作為判斷標準要更精準。該方法無需擴增，檢測靈敏度可至5 nmol·L-1，同時也具有較好的特異性，能檢測僅單個堿基差異的DNA序列，與其他上轉換比率法檢測法[14-17]相比，有一定的優勢，具有較好的應用前景。

圖1　上轉換熒光探針檢測DNA的工作原理示意圖Fig.1 Schematic of upconversion fluorescent probes to detect DNA

1　實驗部分

1.1實驗試劑與儀器

六水氯化釔(YCl3·6H2O)、氯化鐿(YbCl3)、氯化鉺(ErCl3)、油酸(OA)、十八烯(ODE)、牛血清蛋白(BSA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，均購自Sigma公司；氯仿、環己烷、甲醇、乙醇、琥珀酸、三乙胺、二甲基亞砜，購自國藥集團化學試劑有限公司；NH2-PEG 5000購自上海西寶生物科技有限公司；DNA序列(如下)、雜交液Ⅲ、SDS、SSC溶液均由上海生工生物工程技術服務有限公司提供。

Seq 1：5′-NH2-AAAAAAAAAA-AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC A-TGC GAC CTA T-3′(探針DNA)

Seq 2：5′-NH2-AAAAAAAAAA-AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC A-TGC GAC CTA T-FAM-3′(FAM熒光基團標記的探針DNA)

Seq 3:5′-FAM-AT AGG TCG CA-3′(報告DNA)

Seq 4:5′-TGA GGT AGT AGG TTG TAT AGTT-3′(目標DNA)

Seq 5:5′-AGA GGT AGT AGG TTG TAT AGT T-3′(目標DNA-錯配1個)

Seq 6:5′-AAA GGT AGT AGG TTG TAT AGT T-3′(目標DNA-錯配2個)

Seq 7:5′-TAGCTT ATC AGACTG ATGTTG A-3′(目標DNA-錯配多個)

Seq 8:5′-AAC TAA TCA TCC AAC ATC CTCA-3′(目標DNA-全錯配)

S-2000N型掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；F-4600熒光分光光度計(日本Hitachi公司)，其中測量上轉換發光光譜的激發光源為連續波長的980 nm半導體激光器；JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本電子公司)；Nicolet Nexus 470傅里葉紅外光譜儀(Thermo Electron公司)。

1.2NaYF4:Yb,Er UCNPs的制備

NaYF4:20%Yb,2%Er UCNPs參照較成熟的熱分解法合成[18-19]。具體步驟如下：取0.473 g YCl3·6H2O，0.112 g YbCl3，0.011 g ErCl3于100 mL三頸燒瓶中，加入2 mL去離子水超聲分散，再加入12 mL油酸與30 mL十八烯，將整體裝置放入加熱套中，在氬氣的保護下加熱攪拌。隨后將混合溶液在15 min內升至110℃，除水30 min；再10 min升至140℃，除HCl氣體30 min。待溶液溫度降至室溫，將0.2 g氫氧化鈉與0.296 g氟化銨溶于10 mL甲醇中，再加入至混合溶液。再進一步將溶液10 min升至100℃，除甲醇25 min；再15min升至310℃，回流反應1 h。反應結束后的產物用環己烷和乙醇(體積比為1:2)沉淀，再用純乙醇與50%乙醇各離心洗滌2次，最后分散于40 mL氯仿中。

1.3NaYF4：Yb,Er UCNPs的表面羧基修飾

1.3.1羧基化變性牛血清蛋白(dBSA)的制備[20-21]：

取1 g牛血清蛋白溶于20 mL去離子水中；再取2 g丁二酸，溶于10 mL去離子水中，并加入5 mL三乙胺將其pH值調至7～8；隨后將偏堿性的丁二酸溶液緩慢加入牛血清蛋白溶液中，再加入1 g EDC，磁力攪拌下反應1 h，反應完成后，將所得到的混合溶液在85℃下恒溫變性1 h。變性后的溶液用蒸餾水透析純化72 h，最后真空冷凍干燥成松軟絮狀的羧基化變性牛血清蛋白，并于-4℃冰箱保存。

1.3.2NaYF4:Yb,Er UCNPs的表面羧基化蛋白修飾[20]

稱量50 mg dBSA，溶于1 mL DMSO溶液中，再加入10 mg NH2-PEG 5000與2 mg EDC，磁力攪拌下反應4 h。反應完成后，將其滴加入10 mL氯仿分散的NaYF4:Yb,Er UCNPs中，劇烈攪拌反應過夜。最后的羧基化產物用DMSO離心洗滌5次，并分散于10 mL DMSO中待用。

1.4NaYF4：Yb,Er上轉換熒光納米探針的制備

羧基化NaYF4:Yb,Er UCNPs與氨基化DNA探針的結合根據酰胺反應進行。具體步驟如下：首先將DNA粉末用pH=7.2，濃度為0.01 mol·L-1的PBS溶解成50μmol·L-1的DNA溶液，隨后取14.7μL DNA溶液，加入2 mL PBS，在磁力攪拌下，緩慢將其滴加入2 mL DMSO分散的dBSA/NaYF4:Yb,Er UCNPs中，再加入5 mg EDC，反應過夜。反應后的產物用2×SSC/0.1%SDS和0.2×SSC的洗滌液分別離心洗滌2次，最后用1 mL雜交液Ⅲ分散待用。

1.5DNA雜交

取100μL雜交液Ⅲ分散的NaYF4:Yb,Er修飾的探針溶液于200μL PCR管中，再分別加入1μL不同濃度的目標DNA溶液(0～500 nmol·L-1)與1μL 500 nmol·L-1的報告DNA溶液于其中混合，保持總反應體系為100μL。隨后，總溶液放入PCR儀中雜交1 h，反應結束后，分別用2×SSC/0.1%SDS和0.2×SSC的洗滌液離心洗滌2次，最后用100μL PBS分散待測熒光。

2　結果與討論

通過掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察了熱分解法合成的OA/NaYF4:Yb,Er UCNPs的表面形貌。如圖2所示：從SEM中可以觀察出所制備的OA/NaYF4:Yb,Er UCNPs具有均一的形貌和尺寸，且單分散性好；從TEM中得出所制得的納米顆粒呈現規則的球狀，平均粒徑較小，約25 nm，這足以滿足生物標記與生物檢測應用的尺寸要求。

圖3為dBSA/NaYF4:Yb,Er UCNPs的TEM與紅外光譜表征圖。從TEM表征圖中(圖3A)，dBSA修飾后的納米粒子分散良好。值得一提的是，由于牛血清蛋白經過羧基化的改性，不僅給NaYF4:Yb,Er UCNPs表面帶來了大量的羧基官能團而有利于后續酰胺反應的進行，同時使UCNPs具有更好的生物相容性，便于其后的生物應用。此外，通過NaYF4: Yb,Er UCNPs修飾前后紅外光譜圖的進一步分析，我們更能明顯地觀察到顆粒表面成功地修飾了羧基化的牛血清蛋白。其中3 422 cm-1處寬吸收峰為羧基官能團中O-H的伸縮振動峰，很顯然，修飾后的O-H峰比修飾前的增大了許多；1 654 cm-1的強吸收帶為羧基化蛋白與NH2-PEG反應后形成的酰胺C=O基團伸縮振動峰；1 097 cm-1為PEG中-O-醚鍵的伸縮振動吸收峰；669 cm-1對應著牛血清蛋白和NH2-PEG中N-H的面外搖擺振動吸收峰。這些都足以證明NaYF4:Yb,Er UCNPs表面含有大量的羧基官能團。

圖2　OA/NaYF4:Yb,Er UCNPs的SEM圖(A)與TEM圖(B)Fig.2 SEM(A)and TEM(B)images of the OA/NaYF4:Yb,Er UCNPs

圖3　dBSA/NaYF4:Yb,Er UCNPs的TEM圖(A)與紅外光譜圖(B)Fig.3 TEM(A)images and FTIR spectra(B)of dBSA/NaYF4:Yb,Er UCNPs

圖4 480 nm激發下探針修飾的NaYF4:Yb,Er UCNPs的FAM熒光光譜圖(A)與980 nm激發下NaYF4:Yb,Er UCNPs修飾前后的上轉換熒光光譜圖(B)Fig.4 Fluorescence spectra of the probe modified NaYF4:Yb,Er UCNPs under an excitation wavelength of 480 nm(A); and fluorescence spectra of NaYF4:Yb,Er UCNPs under an excitation wavelength of 980 nm(B)

圖4A所示為NaYF4:Yb,Er UCNPs修飾的FAM熒光基團標記DNA探針的FAM熒光光譜圖。我們將dBSA/NaYF4:Yb,Er UCNPs與氨基化FAM熒光基團標記的DNA探針反應，通過加入EDC縮合劑與否來判斷羧基與氨基是否為共價鍵結合。從圖中可發現，當在反應中加入了一定量的EDC時，我們能明顯地觀察到FAM熒光基團在522 nm處有強吸收峰(FAM的激發波長為480 nm，發射波長為522 nm)；當未加入EDC時，我們無法測到洗滌后溶液中FAM的熒光強度。這充分說明了羧基化蛋白修飾的NaYF4:Yb,Er UCNPs與氨基化DNA探針已通過酰胺反應共價鍵牢固地結合在一起，而不是簡單的物理吸附。圖4B顯示了NaYF4:Yb,Er UCNPs經過羧基化蛋白修飾與探針修飾后的熒光情況，從它們的熒光光譜圖可觀察出：在980 nm激光器的激發下，修飾前后的NaYF4:Yb,Er熒光強度沒有產生很大變化，熒光強度和性能仍較好。

圖5為DNA雜交后溶液中FAM與UCNP的熒光光譜圖。在本實驗中，我們利用堿基堆積力作用原理進行DNA雜交檢測。堿基堆積力可提供較強的額外作用力來維持長核苷酸序列與兩條相鄰短核苷酸序列的穩定性，該原理已經成功應用于miRNA的基因芯片和熒光實時定量檢測[22-23]。在本研究中，只有在完全互補的目標DNA存在的情況下，才會提供一個比較強的堿基堆積力來促使捕獲探針與報告探針穩定的結合，再通過檢測可獲得雜交信號。而在無目標DNA的情況下，即使存在著與目標DNA極其相似的序列，在較高的雜交溫度下，也無法使得捕獲探針與報告探針穩定地結合，因而不能獲取報告探針上的FAM熒光信號。圖5A為在480 nm激發光的激發下，目標DNA濃度為0～100 nmol·L-1時所測的FAM熒光光譜；圖5B則為在980 nm激發光的激發下，目標DNA濃度為0～100 nmol·L-1時所測得的UCNPs熒光光譜；兩者在不同的目標DNA濃度下都有著相應的熒光強度，當目標DNA濃度大于5 nmol·L-1時，都能夠較清晰的檢測出DNA序列上FAM熒光基團的信號，說明該方法的檢測底限為5 nmol·L-1，在以后的研究中我們將進一步改進方法，提高其靈敏度。

圖5　雜交后溶液中的FAM熒光光譜圖(A)與UCNP熒光光譜圖(B)Fig.5 FAM(A)and UCNP(B)luminescence spectra of the final hybridization solution

為了考察用NaYF4:Yb,Er UCNPs作為內參來檢測DNA的優點，我們研究了目標DNA濃度與報告DNA中FAM熒光基團的熒光強度或FAM/UCNP的熒光強度比之間的線性關系，分別如圖6A與B。從圖5A中，可明顯看出目標DNA濃度與FAM的熒光強度在0～100 nmol·L-1間的線性關系并不明顯，兩者相關系數R2=0.738。然而，當使用UCNP作為內參，依據FAM/UCNP的比值來判斷目標DNA濃度的變化時，它們在0～100 nmol·L-1間有著較好的線性關系，隨著目標DNA濃度的增大，FAM/ UCNP的熒光強度比也隨著增大，兩者相關系數R2= 0.958。這說明用NaYF4:Yb,Er UCNPs作為內參，能大大地提高DNA檢測的準確性，減少實驗中出現的人為操作和儀器誤差。事實上，實驗過程中常常會有難以避免的人為操作和儀器誤差存在。當存在這些誤差時，必然會使溶液中報告DNA端的FAM熒光信號發生變化。因此如果單一地以FAM熒光強度為信號，肯定會導致最后所測結果的不準確；然而，由于在同一溶液體系中，如有誤差的存在，FAM與UCNP都會存在相應的變化，因此用UCNP作為內參，以FAM/UCNP的熒光強度比作為信號，可很大程度地消除這些誤差的存在，使最終的檢測結果重復性好，準確性高。

此外，我們用不同的目標DNA(分別與標準目標DNA錯配1個堿基、錯配2個堿基、錯配多個堿基及全錯配)與探針DNA、報告DNA雜交來檢測該方法區別堿基錯配的能力及特異性強弱。如圖7所示，只有當目標DNA與探針前部分堿基完全互補配對時，才能促進報告DNA與探針雜交，進而可檢測到報告DNA中FAM熒光基團在522 nm處的發射峰，然而錯配1個或多個堿基都無法檢測到FAM基團在522 nm處的發射峰。這說明該方法有較強的堿基錯配識別能力及好的特異性。

圖6　目標DNA濃度分別與FAM熒光強度的線性關系圖(A)與FAM/UCNP熒光強度的線性關系圖(B)Fig.6 Linear relationships between target DNA concentration and the fluorescence intensity of FAM(A), and between target-miRNAs concentration and the intensity ratios of FAM/UCNPs(B)

圖7　不同目標DNA雜交后的FAM熒光光譜圖Fig.7 FAM luminescence spectra of final hybridization solution for different DNA sequences

3　結論

本文以形貌、尺寸均一，表面富有羧基官能團修飾的NaYF4:Yb,Er UCNPs為內參標準，利用堿基堆積力原理快速便捷地檢測目標DNA。通過多次實驗證明，該方法比傳統的以報告DNA為單一信號所檢測的結果要更為精準，在無擴增的前提下，最低檢測限達5 nmol·L-1，且重復性好，特異性高。此簡便方法有望在疾病的早期檢測和預防上發揮巨大的應用潛能。

[1]YU Ran(於然),XIE Fei(謝飛),MA Xue-Mei(馬雪梅). Beijing Biomed.Eng.(北京生物醫學工程),2015,34(3):304 -309

[2]Jiang S,Gnanasammandhan MK,Zhang Y.J.R.Soc.Interface, 2010,7(42):3-18

[3]CHEN Zhi-Gang(陳志鋼),SONG Yue-Lin(宋岳林),TIAN Qi-Wei(田啟威),et al.Mod.Chem.Ind.(現代化工),2010 (7):27-31

[4]LI Shu-Quan(李樹全),LIN Jian-Ming(林建明),WU Ji-Huai (吳季懷),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(無機化學學報), 2009,25(1):60-64

[5]LIU Tao(劉濤),SUN Li-Ning(孫麗寧),LIU Zheng(劉政), et al.Prog.Chem.(化學進展),2011,24(2/3):304-317

[6]ZHAO Lian(趙蓮),FENG Jian(馮建).Chem.Bioeng.(化學與生物工程),2013,30(4):22-26

[7]Chatterjee D K,Gnanasammandhan M K,Zhang Y.Small, 2010,6(24):2781-2795

[8]WANG Yi-Lin(王益林),WAN Xin(萬鑫),LIU Sheng-Yan (劉聲燕),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(無機化學學報), 2012,28(1):97-102

[9]WANG Xue-Ting(王雪婷),YU Jun-Sheng(于俊生),XIE Ying(謝穎).Chinese J.Inorg.Chem.(無機化學學報), 2007,28(7):1185-1193

[10]XIE Ying(謝穎),XU Jing-Juan(徐靜娟),YU Jun-Shegn (于俊生),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(無機化學學報), 2004,20(6):663-667

[11]WANG Shi-Ting(王士婷),YE Song(葉松),WANG De-Ping (王德平).Mater.Rev.(材料導報),2012,26(9):65-68

[12]Chen X,Zhao Z,Jiang M,et al.New J.Chem.,2013,37(6): 1782-1788

[13]Jin J,Gu Y J,Man C W Y,et al.ACS Nano,2011,5(10): 7838-7847

[14]Liu S J,Zhang L L,Yang T S,et al.ACS Appl.Mater. Interfaces,2014,6(14):11013-11017

[15]Ma T C,Ma Y,Liu S J,et al.J.Mater.Chem.C,2015,3 (26):6616-6620

[16]Li Z,Liang T,Lv S w,et al.J.Am.Chem.Soc.,2015,137 (34):11179-11185

[17]Xiao Y,Zeng L Y,Xia T,et al.Angew.Chem.Int.Ed., 2015,54(18):5323-5327

[18]Yuan P,Lee Y H,Gnanasammandhan M K,et al.Nanoscale, 2012,4(16):5132-5137

[19]Bogdan N,Vetrone F,Ozin G A,et al.Nano Lett.,2011,11 (2):835-840

[20]Zhang L M,Lu Z X,Bai Y Y,et al.J.Mater.Chem.B, 2013,1(9):1289-1295

[21]Zhang L M,Xia K,Bai Y Y,et al.J.Biomed.Nanotechnol., 2014,10(8):1440-1449

[22]Duan D M,Zheng K X,Shen Y,et al.Nucleic Acids Res., 2011,39(22):e154

[23]Lu Z X,Duan D M,Cao R,et al.Chem.Commun.,2011,47 (26):7452-7454

Accurate Detection of DNA Based on the NaYF4：Yb,Er Upconversion Nanoparticles

MAO Lan-Lan1ZHANG Li-Ming1DENG Yan1LüZhuo-Xuan＊,1HE Nong-Yue＊,1,2
(1Economical Forest Cultivation and Utilization of 2011 Collaborative Innovation Center in Hunan Province,Hunan Key Laboratory of Green Chemistry and Application of Biological Nanotechnology,Hunan University of Technology,Zhuzhou,Hunan 412007 China)
(2State Key Laboratory of Bioelectronics,School of Biological Science and Medical Engineering,Southeast University,Nanjing 210096,China)

A new method for improving the accuracy of DNA detection has been developed,which was based on the base stacking principle and the fluorescence of NaYF4:Yb,Er UCNPs.Firstly,the NaYF4:Yb,Er UCNPs were synthesized by thermaldecomposition method and functionalized with denatured bovine serum albumin.Then,the denatured bovine serum albumin-functionalized OA/NaYF4:Yb,Er UCNPs were conjugated with amino groupmodified DNA probes to form upconversion fluorescence labeled probes and detect DNA.The results showed that the method of using the fluorescence of NaYF4:Yb,Er UCNPs as a reference standard to quantitatively detect target DNA concentration had higher accuracy than that of only using a single FAM fluorescence intensity,and the operation and equipment errors was effectively avoid during the experiment.Moreover,this method can reach the detection limit as low as 5 nmol·L-1without amplification,displays a good linear relationship in wide concentration range and a high specificity,and also can effectively differenciate single-base mismatch sequences.

NaYF4:Yb,Er;DNA detection;reference standard;accuracy

O614.33；O614.32

A

1001-4861(2016)12-2095-07

10.11862/CJIC.2016.271

2016-04-09。收修改稿日期：2016-09-24。

國家自然科學基金(No.61301039,61471168,61527806)和湖南省2011高等學校協同創新中心(No.湘教通[2013]448號)資助項目。

＊通信聯系人。E-mail：luzhuoxuan1981@163.com;nyhe@seu.edu.cn