固相萃取/18O標記高氯酸根稀釋高效液相色譜-串聯質譜法測定水果中的高氯酸鹽

吳映璇,林 峰,姚仰勛，卲琳智，歐陽少倫

(1.廣東出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術中心，廣東 廣州 510623；2.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

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固相萃取/18O標記高氯酸根稀釋高效液相色譜-串聯質譜法測定水果中的高氯酸鹽

吳映璇1,2*,林 峰1,2,姚仰勛1,2，卲琳智1,2，歐陽少倫1,2

(1.廣東出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術中心，廣東 廣州 510623；2.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

建立了水果中高氯酸鹽的高效液相色譜-串聯質譜分析檢測方法。樣品采用1%乙酸提取，C18固相萃取柱凈化，Waters IC-Pak Anion HR(4.6 mm× 75 mm)色譜柱洗脫,流動相為乙腈-100 mmol/L 乙酸銨溶液(體積比 60∶40),流速 0.7 mL/min；液相色譜-三重四極桿質譜聯用技術-電噴霧負離子監測模式檢測，采用18O標記高氯酸根離子作為內標進行基質校正，內標法定量。結果表明：高氯酸鹽在0.1～10.0 μg/L范圍內線性關系良好，定量下限為1.0 μg/kg；在1.0，2.0，10 μg/kg 3個加標水平下的回收率為92.5%～110%，相對標準偏差(RSD)為1.4%～5.4%。實際樣品檢測表明該方法準確可靠，適合于水果中高氯酸鹽的測定。

高氯酸鹽；18O標記高氯酸根離子稀釋;固相萃?。桓咝б合嗌V-串聯質譜；水果

水果是日常生活中不可或缺的食物之一，不但營養豐富，更有降血壓、減緩衰老、明目、抗癌、降低膽固醇等保健作用。其富含的維生素是嬰幼兒成長發育不可缺少的營養元素，富含的葉酸有助于細胞繁殖與修復，能幫助胚胎神經系統良好發育，預防孕婦貧血。由于水果對嬰幼兒和孕婦的健康具有潛在的影響,其安全問題顯得非常重要。高氯酸鹽是指含有高氯酸根離子([ClO4]-)的鹽類，其物理化學性質極其穩定，水溶性高，流動性強，具有高度的擴散性和持久性，可經土壤、水等途徑被植物吸收富集，并通過食物鏈進入人體[1]。高氯酸鹽進入人體后主要通過與碘離子競爭性結合利用鈉/碘轉運體(NIS)載運膜蛋白，抑制甲狀腺對碘離子的吸收，導致甲狀腺功能紊亂，干擾T3和T4激素的合成與分泌，從而引發下丘腦-垂體-甲狀腺軸系列的補償機制，最終影響人體正常新陳代謝和生長發育，孕婦嚴重的甲狀腺功能不足會導致胎兒的呆小癥[2-3]。

目前，國外已有關于飲用水、水源、奶類、蔬菜以及營養補充劑等中高氯酸鹽含量的相關調查研究[4-5]，檢測含量為0.89～768 μg/kg；我國也有關于飲用水、牛奶和奶粉等中的高氯酸鹽污染情況研究[6-8]，檢測含量為0.05～464 μg/kg。尚未發現有關水果中高氯酸鹽含量的測定研究。因此，建立快速準確測定水果中高氯酸鹽含量的分析方法，保障人群尤其是孕婦和嬰幼兒等敏感群體的健康，已迫在眉睫。

高氯酸鹽的測定方法主要有離子色譜法[5,9]、表面增強拉曼散射法[10-11]、離子色譜-質譜聯用技術[3-5,8-9,12-16]和高效液相色譜-質譜/質譜法[6-7]等。雖然離子色譜法可測定高氯酸根離子,但其檢測器缺乏選擇性,且易出現假陽性。表面增強拉曼散射法的重現性較差，定量分析困難。離子色譜-質譜法能夠滿足檢測需求，但該設備的普及率不高，不利于方法的推廣和應用；相比之下，高效液相色譜-質譜法具有良好的靈敏度和選擇性，且設備普及更廣，利于推廣應用。本課題組在已有研究基礎上采用液相色譜-串聯四極桿質譜結合18O標記高氯酸根稀釋、固相萃取等技術，建立了水果中高氯酸鹽的檢測方法。解決了由于電噴霧離子源造成的電離抑制現象，從而避免了對高氯酸鹽測定的影響并避免了結果偏差[17]。該方法準確、快速、靈敏，能夠為水果中高氯酸鹽污染狀況的監測和產品質量控制提供科學依據和技術支持。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

高氯酸鹽標準溶液，Inorganic Ventures(CAS No：7601-89-0，純度：100%，濃度1 000 mg/L)；18O標記高氯酸根溶液(純度：90%，濃度100 μg/mL，Cambridge Isotope Laboratories);乙腈(HPLC級，美國Tedia公司)；乙酸(HPLC級，德國 Merck Darmstadt 公司)；乙酸銨(優級純，印度 Fluka 公司)。蓮霧、蘋果、橙子和橘子在果蔬市場購買后，于4 ℃冰箱保存備用。

4000QTRAP液相色譜-串聯質譜儀(美國 AB Sciex公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；旋渦振蕩器(德國IKA公司)；C18固相萃取柱(200 mg/3 mL，美國Waters公司),經3 mL乙腈、3 mL 1%乙酸活化后備用；離心機(德國 Sigma 公司)。聚丙烯離心管：50 mL和1.5 mL。實驗所用的試劑和標準溶液存儲容器均需先用30%硝酸溶液預處理。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的制備 標準儲備溶液(10 mg/L)：準確吸取適量高氯酸鹽標準溶液，置于100 mL容量瓶中，用水定容，于4 ℃保存。18O標記高氯酸根儲備溶液(10 mg/L)：準確吸取適量的18O標記高氯酸根標準溶液，置于10 mL容量瓶中，用水定容，于4 ℃保存。標準工作溶液：吸取一定量的標準使用溶液和18O標記高氯酸根使用溶液，用水配制成系列濃度的標準工作溶液，濃度在0～10 μg/L范圍內，18O標記高氯酸根濃度均為2.0 ng/mL，當天配制。

1.2.2 溶液的配制 1%乙酸溶液：移取 10.0 mL乙酸至 1 L容量瓶中，加水至刻度，搖勻備用；乙酸銨溶液(100 mmol/L)：稱取7.708 g乙酸銨，用水溶解定容至1 000 mL，混勻后備用。

1.2.3 樣品提取 稱取試樣5 g(精確至0.01 g)至50 mL離心管中，加100 μL18O標記高氯酸根中間溶液(100 μg/L)和25.0 mL 1%乙酸溶液，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min離心10 min，分離上清液于具塞離心管中，用1%乙酸溶液定容至25 mL刻度，搖勻，待凈化。

1.2.4 樣品凈化 吸取1.5 mL上清液過固相萃取C18柱，收集流出液，渦旋振蕩30 s，轉移至1.5 mL離心管，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液，供液相色譜-質譜/質譜儀測定。

1.2.5 液相色譜-質譜/質譜條件 色譜條件：IC-PakTMAnion HR柱(6 μm，4.6 mm×75 mm)；流動相：乙腈-100 mmol/L乙酸銨溶液(60∶40)，等度洗脫。流速：0.70 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。質譜條件：電噴霧負離子模式(ESI-)掃描；多反應監測方式檢測；氣簾氣壓力(CUR)：207 kPa；霧化氣壓力(GS1)：414 kPa；輔助加熱氣壓力(GS2)：483 kPa；碰撞氣壓力(CAD)：HIGH；電噴霧電壓(IS)：-1 000 V；離子源溫度(TEM)：550 ℃;監測離子對、碰撞能量、去簇電壓、采集時間和保留時間見表1。

表1 高氯酸鹽的質譜分析參數

Table 1 LC-MS/MS parameters for perchlorate analysis

CompoundRetentiontime(min)Parention(m/z)Daughterion(m/z)Declusteringpotential(V)Collisionenergy(V)Perchlorate46199，10183?，85-44，-65-36，-37Isotopelabelledperchlorate46110789-80-37

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 提取溶劑種類及體積的選擇

已有文獻中采用水[4,6,9]或1%乙酸溶液[5,7-8]為提取溶劑，鑒于高氯酸鹽的高溶解性質，本實驗分別采用1%乙酸溶液和水作為提取溶劑，以蓮霧為例進行研究，比較高氯酸鹽在溶劑(水和1%乙酸)和樣品(蓮霧)中的提取效率。實驗結果顯示，1%乙酸溶液的提取效果優于水。同時，由于1%乙酸溶液對目標化合物的溶解度大，對雜質的溶解度小，且與目標化合物不起化學變化；經濟、易得、使用安全。因此，本實驗選用1%乙酸溶液作為提取溶劑。

進一步考察了相同量的試樣加入不同體積(5，10，25，30 mL)1%乙酸溶液對提取效率的影響，發現均存在基質抑制情況，但在添加同位素內標后，不同體積1%乙酸溶液的提取效率無明顯區別，回收率在98.6%～103%之間?？紤]到基質效應與后續凈化等因素，本實驗選擇1%乙酸的體積為25 mL。

2.2 固相萃取柱的選擇

對比了常用的C18固相萃取柱、Oasis HLB固相萃取柱和石墨碳黑柱的凈化效果。結果表明，C18固相萃取柱的回收實驗較理想，色素等雜質保留在固相萃取柱上，而高氯酸鹽及18O標記高氯酸根離子則沒有保留，隨流出液流出；Oasis HLB固相萃取柱和石墨碳黑柱對高氯酸鹽沒有保留，但對18O標記高氯酸根離子有很強的吸附作用，難以將其洗脫，因此本實驗選用C18固相萃取柱。

2.3 濾膜的吸附作用研究

在液相色譜分析中，為避免管路堵塞，根據篩分原理，通常使用濾膜對待測樣液進行過濾。對實驗室常用的兩種濾膜(尼龍66和聚醚砜濾膜)分別進行測試。結果發現，這兩種濾膜對高氯酸鹽及其同位素內標均有不同程度的吸附，其中尼龍66濾膜對高氯酸鹽及其同位素內標的吸附達90.5%和95.8%；聚醚砜濾膜對高氯酸鹽及其同位素內標的吸附分別為62.4%和63.4%。本實驗采用高速離心的方式將待測樣液中可能存在的大顆粒物質去除，避免了使用濾膜后對待測樣液的吸附作用,以取得較好的回收率。

2.4 質譜條件的優化

用蠕動泵以10 μL/min的流速分別連續注射0.5 mg/L的高氯酸鹽和18O標記高氯酸根標準溶液于ESI離子源中，由于高氯酸鹽中的氯離子在自然界存在同位素35Cl和37Cl，負離子檢測方式下對高氯酸鹽進行一級質譜分析(Q1掃描)，得到高氯酸鹽的準分子離子峰(m/z99，101)和18O標記高氯酸根的準分子離子峰(m/z107，109)。對準分子離子峰進行二級質譜分析(子離子掃描)，得到碎片離子信息,選擇響應值高、基線噪音低的離子對m/z99/83,101/85作為監測離子對(定性離子對)，選擇信號最強的m/z99/83作為定量離子對，選擇響應值高的m/z107/89作為18O標記高氯酸根的特征離子對。采用MRM模式采集數據，各離子對的優化質譜參數見表1。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

在優化條件下，取一系列不同濃度的高氯酸鹽標準溶液，其中18O標記的高氯酸標準溶液濃度為2 μg/L，以高氯酸鹽質量濃度(X，μg/L)對高氯酸鹽與18O標記高氯酸根定量離子的峰面積比值(Y)進行線性回歸。結果表明，高氯酸鹽的濃度在0.1～10.0 μg/L范圍內線性關系良好，回歸方程為y=0.454x+0.011 1,相關系數(r)為0.999 9。按照3倍信噪比計算，高氯酸鹽在蓮霧和蘋果中的檢出限(LOD)分別為0.01 μg/kg和0.015 μg/kg；蓮霧和蘋果樣品中添加水平為1.0 μg/kg時，信噪比均大于10，表明其定量下限(LOQ)可達到1.0 μg/kg。當樣品中高氯酸鹽的濃度超過線性范圍時，可適當加大樣品的稀釋倍數。

2.6 加標回收率與相對標準偏差

采用含有低含量高氯酸鹽的蓮霧樣品(0.10 μg/kg)和蘋果樣品(0.24 μg/kg)進行加標回收和精密度實驗，加標水平為1.0，2.0，10.0 μg/kg，按照本方法進行提取和凈化，每個加標水平平行測定10次。結果表明，蓮霧樣品中高氯酸鹽的平均回收率為92.9%～110%，相對標準偏差(RSD)為1.4%～5.2%；蘋果樣品的平均回收率為92.5%～108%,RSD為4.2%～5.4%。采用建立的方法檢測市售蓮霧、蘋果、橙子和橘子共10個水果樣品，其中橘子中高氯酸鹽含量為1.65 μg/kg，其他9個水果樣品均低于1.0 μg/kg。

3 結 論

[1] Kirk A B,Dyke J V,Martin C F,Dasgupta P K.Environ.HealthPerspect.,2007，115(2):182-186.

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[4] Krynitsky A J,Niemann R A,Nortrup D A.Anal.Chem.,2004,76(18):5518-5522.

[5] Krynitsky A J,Niemann R A,Williams A D,Hopper M L.Anal.Chim.Acta,2006,567(1):94-99.

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[8] Shi Y L.Environ.Chem.(史亞利.環境化學),2006,25(1):117-120.

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[12] Furdui V I,Tomassini F.Environ.Sci.Technol.,2010,44(2):588-592.

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[14] Kang N,Anderson T A,Jackson W A.Anal.Chim.Acta,2006,567(1):48-56.

[15] Kirk A B,Martinelango P K,Tian K,Dutta A,Smith E E,Dasgupta P K.Environ.Sci.Technol.,2005,39(7): 2011-2017.

[16] Zhang P,Shi Y L,Cai Y Q,Mou S F.J.Instrum.Anal.(張萍,史亞利,蔡亞歧,牟世芬.分析測試學報),2007,26(5):690-693.

[17] Qi M L.Chin.J.Pharm.Anal.(齊美玲.藥物分析雜志),2005,25(4):476-479.

Determination of Perchlorate in Fruits by Solid Phase Extraction/18O Labeled Perchlorate Dilution High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WU Ying-xuan1,2*,LIN Feng1,2,YAO Yang-xun1,2,SHAO Lin-zhi1,2,OUYANG Shao-lun1,2

(1.Inspection and Quarantine Technology Center in Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510623,China;2.Key Laboratory of Animals and Plants and Food Import and Export of Technical Measures in Guangdong Province,Guangzhou 510623,China)

An analytical method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS) was developed for the determination of perchlorate in fruits.Samples were extracted with 1% acetic acid.The extract was cleaned up on an C18solid-phase extraction(SPE) cartridge,and separated on a Waters IC-Pak Anion HR column(4.6 mm×75 mm) using acetonitrile -100 mmol/L ammonium acetate(60∶40) as mobile phase at a rate of 0.7 mL/min.The detection of perchlorate anion was performed by high performance liquid chromatography triple stage quadrupole mass spectrometry,equipped with electrospray ionization(ESI) in the negative ion mode.An18O-labelled perchlorate anion internal standard was used to correct matrix effects.Quantification analysis was conducted by the internal standard calibration.Good linearity was observed for perchlorate in the concentration range of 0.1- 10.0 μg/L.The limit of quantitation was 1.0 μg/kg.The recoveries of perchlorate in different samples at three spiked levels of 1.0,2.0,10.0 μg/kg were in the range of 92.5%-110%,with relative standard deviations of 1.4%-5.4%.The real sample analysis showed that this method was accurate and could be applied in the determination of perchlorate in fruits.

perchlorate；18O-labelled perchlorate dilution;solid-phase extraction;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)；fruits

2015-06-18；

2015-09-01

檢驗檢疫行業標準計劃項目(2009B535)；廣東檢驗檢疫局科技計劃項目(2015GDK10)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.018

O657.63;O623.422

A

1004-4957(2016)03-0355-04

*通訊作者：吳映璇，碩士，高級工程師，研究方向：食品安全檢測，Tel：020-38290337，E-mail: allanwyx@126.com