烏骨藤提取物對原代新生大鼠心肌細(xì)胞的毒性研究

許曉東 李凱強(qiáng) 王震 張昱 陳波旭 陳秉宇 鄭宇 張威

●論 著

烏骨藤提取物對原代新生大鼠心肌細(xì)胞的毒性研究

許曉東 李凱強(qiáng) 王震 張昱 陳波旭 陳秉宇 鄭宇 張威

目的 探討烏骨藤提取物（MTE）對原代新生大鼠新生心肌細(xì)胞的毒性影響。方法 分離和培養(yǎng)SD大鼠心肌細(xì)胞，將MTE組分A溶于二甲基亞砜，分別使用20、40、80、160和320μg/ml的MTE和8 000μg/ml的5-氟尿嘧啶作為陽性對照處理原代大鼠心肌細(xì)胞24 h，采用MTS法測定不同濃度MTE對體外培養(yǎng)原代大鼠心肌細(xì)胞增殖的影響；采用RTCA Cardio系統(tǒng)建立體外心臟毒性篩選模型，對大鼠心肌細(xì)胞增殖、搏動進(jìn)行檢測。結(jié)果 原代心肌細(xì)胞加入不同濃度的MTE后，細(xì)胞存活受到顯著抑制，半數(shù)存活濃度（EC50）為207.3μg/ml，隨著MTE濃度的升高組分A抑制率增強(qiáng)（均P＜0.05）。原代心肌細(xì)胞接種到RTCA Cardio E-Plate96孔板上，24h后出現(xiàn)心肌細(xì)胞搏動。MTE處理后，細(xì)胞指數(shù)（CI）值顯著下降，240μg/ml MTE組分A處理后心肌細(xì)胞搏動迅速受到抑制，搏動頻率由126次/min下降至0次/min，且不可恢復(fù)；160μg/ml和80μg/ml處理后分別在12h和6h后抑制作用減弱，搏動頻率為40次/min和84次/min；40μg/ml基本無影響。結(jié)論 MTE組分A對原代新生大鼠心肌細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，能夠顯著影響其搏動功能。

心肌細(xì)胞 RTCA 細(xì)胞毒性 烏骨藤

心臟是循環(huán)系統(tǒng)中重要的功能性器官之一，臨床藥 物的細(xì)胞毒性可不同程度增加心臟的循環(huán)壓力，甚至?xí)鹦募〖?xì)胞不可逆的損傷和缺失，導(dǎo)致患者心功能進(jìn)行性惡化。建立心臟實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)（RTCA Cardio）技術(shù)能對臨床藥物心肌細(xì)胞毒進(jìn)行有效篩選，降低心血管疾病導(dǎo)致的病死率[1]。烏骨藤為蘿藦科牛奶菜屬植物，具有抗腫瘤、平喘、免疫調(diào)節(jié)和降血壓等藥理作用[2]。以烏骨藤的粗提物（MTE）為主要成分的藥物“消癌平”臨床上用于治療肝癌、膠質(zhì)瘤、胃癌等腫瘤[3]。但MTE對心肌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用尚不清楚，進(jìn)一步分離純化烏骨藤，利用RTCA Cardio技術(shù)評估MTE的心肌細(xì)胞毒作用，有助于以烏骨藤為主要成分藥物的減毒增效。本研究采用RTCA Cardio技術(shù)對原代大鼠心肌細(xì)胞的增殖、搏動頻率、幅度等進(jìn)行實(shí)時(shí)動態(tài)檢測，探討MTE對原代大鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和動物 MTE經(jīng)萃取和色譜分離，獲得主要組分A，由浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院純化和提供；出生后1～2d清潔級SD新生大鼠，雌雄不限，由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 取出生1～2d的SD大鼠，用75%乙醇消毒后，獲取大鼠心室組織，剪成1mm左右的組織塊，使用預(yù)冷的高糖培養(yǎng)基洗滌3次，用0.08%胰蛋白酶和0.04%膠原蛋白酶Ⅱ消化后將細(xì)胞懸液收集到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行差速貼壁2次，每次45min，以去除成纖維細(xì)胞和其它細(xì)胞。將差速貼壁后的心肌細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2 新型四氮唑鹽（MTS）法檢測存活細(xì)胞抑制率 將MTE組分A溶于二甲基亞砜（DMSO）備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)分別使用20、40、80、160和320μg/ml濃度的MTE組分A和8 000μg/ml的5-氟尿嘧啶（5-FU）作為陽性對照處理原代大鼠心肌細(xì)胞24h，采用MTS法測定吸光度（OD）值，計(jì)算存活細(xì)胞抑制率[2]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，并計(jì)算半數(shù)存活濃度（EC50）。

1.2.3 RTCA Cardio系統(tǒng)基線的測定及大鼠心肌細(xì)胞細(xì)胞指數(shù)（CI）值、搏動檢測 在E-Plate Cardio96x檢測板中分別加入50μl培養(yǎng)基，將其放在Cardio工作站上，測基線調(diào)零。取出E-Plate Cardio96x檢測板，分別加入100μl細(xì)胞懸液（17 000cells/孔）于E-Plate Cardio96x檢測板中，混勻，室溫放置30min后，放在Cardio工作站上對不同時(shí)間的細(xì)胞增殖進(jìn)行實(shí)時(shí)動態(tài)檢測。24h后，取出E-Plate Cardio96x檢測板，分別加入不同濃度MTE組分A（40、80、160、240μg/m）l和DMSO對照（0.1%），放在Cardio工作站上對心肌細(xì)胞CI和心肌細(xì)胞搏動頻率進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測和信號收集，并通過RTCA Cardio software 1.0對以上指標(biāo)進(jìn)行分析。CI值用來反映細(xì)胞增殖情況，CI值越大，細(xì)胞增殖越多。每隔2min檢測1次，分別選取0、10、30min及2、6、12、18、24h時(shí)間點(diǎn)作圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Prizm 5軟件和RTCA Cardio software 1.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTE組分A對原代大鼠心肌存活細(xì)胞抑制率的影響 通過Prizm 5軟件計(jì)算得出MTE組分A對原代大鼠心肌細(xì)胞的EC50為207.30μg/ml。MTE組分A對原代大鼠心肌存活細(xì)胞抑制率的影響見表1。

表1 MTE組分A對原代大鼠心肌存活細(xì)胞抑制率的影響

由表1可見，與DMSO對照組比較，20、40、80、160和320 μg/ml組MTE組分A及5-FU（8 000μg/ml）對照組對原代大鼠心肌存活細(xì)胞抑制率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且隨著MTE組分A濃度的升高存活細(xì)胞抑制率升高（均P＜0.05）。

2.2 RTCA Cardio檢測MTE組分A對原代大鼠心肌細(xì)胞增殖的影響 見表2。

表2 RTCA Cardio檢測MTE組分A對原代大鼠心肌細(xì)胞增殖的影響

由表2可見，隨著MTE組分A濃度的升高，CI 值下降，存在藥物濃度依賴性。160μg/ml組、240μg/ml組與DMSO對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 MTE組分A對原代大鼠心肌細(xì)胞搏動的影響 見圖1，表3、4。

圖1 MTE組分A對原代大鼠心肌細(xì)胞的瞬態(tài)脈沖圖

表3 MTE組分A對原代大鼠心肌細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)搏動頻率的影響

表4 MTE組分A對原代大鼠心肌細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)搏動幅度的影響

由圖1，表3、4可見，MTE組分A各濃度組對心肌細(xì)胞搏動均有一定的影響，且該影響作用呈濃度依賴性：240μg/ml組經(jīng)處理后，導(dǎo)致細(xì)胞迅速停止搏動，搏動頻率由126次/min降至0次/min，標(biāo)準(zhǔn)搏動幅度由100%降至0，且無法恢復(fù)；160μg/ml組經(jīng)處理后，12h內(nèi)顯著影響細(xì)胞搏動頻率和搏動幅度，搏動頻率和標(biāo)準(zhǔn)搏動幅度分別為40次/min和128%，18h后恢復(fù)正常；80μg/ml組經(jīng)處理后，2h內(nèi)對心肌細(xì)胞搏動頻率和搏動幅度還存在一定的影響，但6h恢復(fù)正常，搏動頻率和標(biāo)準(zhǔn)化搏動幅度分別為84次/min和109%；40μg/ml組經(jīng)處理后幾乎對細(xì)胞搏動無影響。

3 討論

藥物濃度的篩選是心功能不全患者治療效果不佳的重要原因之一[4]，尤其是在腫瘤患者中，化療藥物在為控制腫瘤患者病情，提高生存質(zhì)量的同時(shí)，往往直接或者間接地?fù)p傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)和收縮功能障礙[5]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，MTE能夠顯著抑制大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞增殖，通過調(diào)控Bcl-2家族mRNA表達(dá)的變化，促進(jìn)C6細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]。但關(guān)于烏骨藤對心肌細(xì)胞的作用仍不明確，鮮有報(bào)道。本研究利用RTCA Cardio技術(shù)探究烏骨藤提取物對原代新生大鼠心肌細(xì)胞增殖和功能的變化。該技術(shù)模擬生理?xiàng)l件下，根據(jù)細(xì)胞與E-Plate Cardio96檢測板底部電極相互作用引起阻抗的變化換算成CI值，對心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)、無標(biāo)記、無侵入性的動態(tài)監(jiān)測[7]，從而獲得細(xì)胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁等細(xì)胞生理功能相關(guān)的信息[8]。通過實(shí)時(shí)監(jiān)控細(xì)胞增殖、凋亡和毒性等事件，可以提供豐富的細(xì)胞生理信息[9]，并根據(jù)心肌細(xì)胞搏動頻率、幅度變化進(jìn)行評估，綜合分析藥物對心肌細(xì)胞的生長、細(xì)胞形態(tài)特征和心肌細(xì)胞搏動的影響，可早期進(jìn)行臨床藥物對心臟毒性的篩選，有效減少藥物的浪費(fèi)[10]。我們通過RTCA Cardio系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，MTE組分A能夠抑制心肌細(xì)胞的CI值，抑制細(xì)胞的增殖，這與MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了烏骨藤提取物具有細(xì)胞毒作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高濃度MTE組分A能夠?qū)е滦募〖?xì)胞搏動消失，且隨著時(shí)間的延長不能恢復(fù)，但是中、低濃度處理后，導(dǎo)致的初始階段心肌細(xì)胞搏動消失，隨著時(shí)間的延長，可有一定程度的恢復(fù)，且具有濃度依賴性。160μg/ml MTE組分A對原代大鼠心肌細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，并能顯著抑制其搏動頻率和幅度，該濃度遠(yuǎn)超過其臨床應(yīng)用劑量，提示以烏骨藤提取物為主要成分的消癌平對心肌細(xì)胞較為安全。

綜上所述，烏骨藤制劑在抗腫瘤的同時(shí)存在心肌細(xì)胞毒作用，能夠顯著影響心肌細(xì)胞搏動頻率和搏動幅度，提示在臨床治療過程中，烏骨藤制劑抗腫瘤最佳劑量的篩選尤為重要。

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Cytotoxic effect of Marsdeniae Tenacissimae Extracts on primary cultured myocardial cells of neonatal rat

XU Xiaodong, LI Kaiqiang,WANG Zhen,et al.Research Center of Blood Transfusion,Key laboratory of Ministry of Education,Zhejiang Provincial People's Hospital.Hangzhou 310014,China

Objective To investigate the cytotoxic effect of Marsdeniae tenacissimae extracts(MTE)on primarily cultured myocardial cells of neonatal rats. Methods Primarily cultured myocardial cells of neonatal SD rats were treated with 20,40,80, 160 and 320μg/ml MTE,and 8 000μg/ml 5-FU(positive control),cell proliferation was assessed by MTS method.Cytotoxicity and rhythm changes of myocardial cells were determined by Real-time Cellular Analysis Cardio(RTCA Cardio)system. Results Proliferation of rat myocardial cells was inhibited after MTE treatment in a concentration-dependent manne(P＜0.05),and the half survival rate(EC50)was 207.3μg/ml.RTCA Cardio system showed that myocardial cells were beating normally 24h after testing started.And the cell index(CI)was down-regulation significantly with MTE.The cells beating rate decreased frequently from 126 to 0 beatings/min with the treatment of 240μg/ml MTE component A.When the cells were treated with 160μg/ml and 80μg/ml component A,the cell beating was resumed at 12h and 6h with a beating rate of 40 beatings/min and 84 beatings/min, respectively. Conclusion MTE component A has cytotoxic effect on primary cultured myocardial cells of neonatal rat,and significantly affects the beating function of myocardium.

Myocardial cellRTCA Cytotoxicity Marsdeniae tenacissimae extraction

2016-04-14）

（本文編輯：馬雯娜）

國家自然科學(xué)青年基金（81501824）;浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY15C090004,LY15H280003）；浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)項(xiàng)目（2015ZZ001）；浙江省中醫(yī)藥項(xiàng)目（2014ZQ005，2014ZB007）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016DTB001,2015KYA028，2015ZDA002）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室輸血醫(yī)學(xué)研究中心（許曉東、李凱強(qiáng)、陳秉宇、王震、張威）；溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（張昱、陳波旭、鄭宇）

張威，E-mail：mnfizjpph88@163.com